LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM DAN PENGAMATAN MIKROSKOPIS

OLEH:
NAMA:
RAKHEL MARGARETA SITOHANG
NIM:
08051382025098
KELOMPOK/KELAS:
B

LABORATORIUM BIOEKOLOGI KELAUTAN

JURUSAN ILMU KELAUTAN
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SRIWIJAYA
2021
 I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme terdapat dimana-mana, baik didalam tanah, air, udara maupun

pada makhluk hidup termasuk pada jaringan tubuh kita sendiri (kulit dan selaput lendir).
Mikroba sangat beragam jumlahnya, yang umumnya berada dalam suatu populasi
campuran. Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang hidup
tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen terdapat bersama-
sama bakteri yang tidak berbahaya sehingga beberapa teknik isolasi dan pemurnian
mikroba sangat diperlukan untuk memisahkan tiap jenis mikroba tersebut sehingga
dapat dilakukan penelitian lebih lanjut (Sabdaningsih et al, 2013).

Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini sangatlah besar dan
cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita seperti
mulut, saluran pencernaan dan kulit. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar.
Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu- ribu mikroorganisme.
Udara, tanah, dan air yang merupakan komponen alam sebagai tempat tinggal kita juga
dihuni oleh beragam mikroorganisme. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri,
khamir, kapang dan sebagainya (Lambui dan Magfirahtul, 2017).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini,
olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut: zat pewarna kristal
violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya
berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya (Wulandari dan Desi, 2019).

Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu
bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan
mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu
tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna
kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna
tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna
merah. Perbedaan warna inidisebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding
selnya (Wulandari dan Desi, 2019).

Bakteri merupakan salah satu golongan mikroorganisme prokariotik (bersel

tunggal) yang hidup berkoloni dan tidak mempunyai selubung inti namun mampu hidup
dimana saja. Menurut klasifikasinya bakteri dibagi menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif
dan bakteri Gram negatif. Beberapa bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif
merupakan flora normal pada tubuh manusia. Flora normal adalah mikroorganisme
yang menempati suatu daerah tanpa menimbulkan penyakit pada inang yang ditempati.
Pada kulit normal biasanya ditempati sekitar 102 - 106 CFU/cm2 bakteri. Ada juga
sebagian dari bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif misalnya Staphylococcus
aereus yang dapat menyebakan penyakit jika mencapai jumlah 1.000.000 atau 106 per
Gram yang merupakan suatu jumlah yang cukup banyak digunakan untuk memproduksi
toksin (Rahayu dan Hidayat, 2017).

1.2 Tujuan

Tujuan yang ingin dicapai oleh praktikan dalam praktikum kali ini yaitu:

1. Mahasiswa mampu memahami pewarnaan gram terhadap jenis bakteri.

2. Mahasiswa mampu mengamati berbagai morfologi bakteri.
3. Mahasiswa mampu mengidentifikasi suatu jenis bakteri termasuk bakteri gram
positif dan gram negatif.

1.3 Manfaat

Manfaat yang diperoleh dari praktikum “Pewarnaan Gram Dan Pengamatan

Mikroskopis” adalah :

1. Kita dapat mengetahui macam-macam teknik Pewarnaan Gram.

2. Kita dapat mengetahui larutan pewarna yang digunakan pada percobaan
pewarnaan gram.
3. Kita dapat mengetahui pengamatan mikroskopis dengan pewarnaan gram.
 II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengamatan Bakteri

Bakteri merupakan salah satu golongan organisme prokariotik (tidak mempunyai

selubung inti) namun bakteri memiliki informasi genetik berupa DNA yang berbentuk
sirkuler, panjang dan bisa disebut nucleoid. Tes bokimia pewarnaan gram merupakan
kriteria yang efektif untuk klasifikasi. Hasil pewarnaan akan menunjukkan perbedaan
dasar dan kompleks pada sel bakteri (struktur dinding sel), sehingga dapat membagi
bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif Pada
pewarnaan Gram, golongan bakteri gram positif akan memberikan warna ungu karena
memiliki lapisan peptidoglikan setebal 20-80nm sedangkan Bakteri Gram negatif
memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis yaitu 5-10 nm dengan komposisi utama:
lipoprotein, membran luar dan polisakarida (Holderman et al, 2017).

Bakteri merupakan sel prokariotik dengan genom berbentuk sirkuler dan

mempunyai plasmid. Bakteri di samping dikenal sebagai agen penyebab penyakit,
bakteri juga mempunyai manfaat yang besar bagi kehidupan manusia seperti
pemanfaatan bakteri dalam pembuatan yogurt dan antibiotik. Di dalam tubuh manusia
pun bakteri memberikan manfaat yang banyak pertahanan melawan infeksi, berperan
dalam sistem imun, sumber nutrient dan menstimulasi pergantian epitel. Bakteri yang
menghuni tubuh manusia disebut mikroba flora normal. Menghuni kulit dan selaput
mukosa individu sehat dan normal, Kebanyakan bakteri anaerob dan fakultatif anaerob
yang berperan didalamnya (Yasir, 2015).

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi

ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi
dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang
digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang
memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan
diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi
kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Ristiari et al, 2018).

Pengamatan morfologi yang dilakukan meliputi morfologi sel dan morfologi

koloni. Pengamatan morfologi selsecara mikroskopik dilakukan pada saat pewarnaan
gram. Sedangkan, pengamatan morfologi koloni dilakukan setelah mendapatkan biakan
murni. Pengamatan ini meliputi warna, permukaan koloni (halus, kasar), bentuk (form),
tepian koloni (margin), dan elevasi (Nurhidayati et al, 2015).

2.2 Pewarnaan Gram

Salah satu metode yang dapat mengidentifikasi suatu bakteri ialah Pewarnaan
Gram, Pewarnaan Kapsul dan Pewarnaan Tahan Asam. Pewarnaan Gram merupakan
pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan yang digunakan
untuk mengelompokan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan struktur,
komposisi dinding sel bakteri dan permeabilitas diantara kedua kelompok dinding sel
bakteri menyebabkan perbedaan warna pada bakteri Gram positif dan bakteri Gram
negatif. Pewarnaan Gram berdasarkan kemampuan bakteri untuk menahan pewarna
primer (kristal ungu) atau kehilangan warna primer dan menerima warna tandingan
(safranin). Bakteri Gram positif akan menunjukkan warna ungu sedangkan untuk
bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah (Jannah et al, 2017).

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negatif,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal violet. Beberapa
bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, karena dinding selnya mengandung
banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya.
Pada pewarnaan tersebut sel bakteriakan berwarna merah tetapi sel jaringan akan
berwarna hijau. Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2
yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative. Pada pewarnaan Gramini, reagen
yang digunakan ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodine (Jannah et al, 2017).

Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violetnya
sehingga ketika diamati mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri
Gram negative tidak dapat mempertahankan warna ungu dari kristal violet tetapi zat
warna safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga akan memperlihatkan warna
merahnya (Pratita, 2012).

Pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteriserta untuk

membedakan bakteri gram positif dan gram negative. Perbedaan warna pada bakteri
gram positif dan gram negatif menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding
sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri gram positif memiliki struktur dinding
sel dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram negatif
memiliki sturktur dinding seldengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri, 2011).

2.3 Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif

Bakteri merupakan salah satu golongan organisme prokariotik (tidak mempunyai

selubung inti) namun bakteri memiliki informasi genetik berupa DNA yang berbentuk
sirkuler, panjang dan bisa disebut nucleoid. Tes bokimia pewarnaan gram merupakan
kriteria yang efektif untuk klasifikasi. Hasil pewarnaan akan menunjukkan perbedaan
dasar dan kompleks pada sel bakteri (struktur dinding sel), sehingga dapat membagi
bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pada
pewarnaan gram, golongan bakteri gram positif akan memberikan warna ungu karena
memiliki lapisan peptidoglikan setebal 20-80 nm sedangkan bakteri gram negatif
memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis yaitu 5-10 nm dengan komposisi utama:
lipoprotein, membran luar dan polisakarida (Holderman et al, 2017).

Dinding sel bakteri gram positif pada umumnya memiliki struktur dinding sel yang
tebal (15-80 nm) dan sedikit lemak (1-4%). Dinding sel bakteri gram positif memiliki
peptodoglikan yang lebih banyak yang mampu mempertahankan zat warna ungu
sehingga warna ungu yang muncul pada pengamatan mikroskopis terlihat kontras. Pada
penggunaan safranin diperoleh kualitas yang kurang baik karena warna merah yang
diserap oleh pori-pori peptidoglikan dinding sel yang lebih tebal tidak sempurna
sehingga pada pengamatan mikroskopis terlihat kurang kontras, sedangkan bakteri gram
negatif memiliki dinding sel yang lebih tipis (10-15 nm) dan persentase lemak lebih
tinggi (11-24%) dari bakteri gram positif dikarenakan bakteri gram negatif memiliki
peptidoglikan sedikit yang mampu menyerap warna merah hingga warna merah yang
muncul pada pengamatan mikroskopis terlihat kontras (Jannah et al, 2017).

Penambahan alkohol pada bakteri gram positif menyebabkan pori-pori dalam

peptidoglikan menjadi menyusut sehingga kristal violet melekat, terlarut atau luntur
oleh alkohol yang mengakibatkan warna bakteri gram positif adalah violet, sedangkan
pada bakteri negatif lipid pada membran luar larut dan lepas sehingga safranin atau zat
warna pendamping diikat yang menyebabkan warna bakteri gram negatif menjadi
merah. Peptidoglikan pada dinding sel bakteri gram positif memiliki ketebalan sekitar
90% dari total komposisi dinding sel bakteri sedangkan bakteri gram negatif
mengandung peptidoglikan yang jauh lebih sedikit pada dinding selnya dan
peptidoglikan ini mempunyai ikatan silang yang kurang ekstensif dibandingkan dengan
bakteri Gram positif (Jannah et al, 2017).

Identifikasi bakteri dilakukan dengan cara mengamati morfologi koloni meliputi

bentuk koloni bakteri, warna koloni, tepi koloni, dan elevasi koloni bakteri. Kemudian
dilanjutkan dengan pewarnaan Gram yang bertujuan untuk mengetahui golongan bakteri
jika bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan jika bateri Gram negatif akan
berwarna agak merah. Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara bakteri difiksasi diatas
microscope slides menggunakan NaCl dan yang pertama diberi larutan kristal violet
selama 3 menit, lugol selama 1 menit, alkohol 95% selama 30 detik dan safranin selama
2 menit (Holderman et al, 2017).

Pada isolat bakteri yang berwarna merah berarti merupakan bakteri Gram negatif
namun pada saat diamati dibawah mikroskop bakteribakteri tersebut terlalu menumpuk
dan bentuk selnya berbeda dari bakteri Gram negatif pada umumnya. Untuk
memastikan kembali apakah bakteri tersebut adalah Gram negatif dilakukan penanaman
bakteri pada media MacConkey (MCA) (Holderman et al, 2017).
 III METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Mikrobiologi dengan judul “Pewarnaan Gram Dan Pengamatan

Mikroskopis” dilaksanakan pada hari Jumat 26 Maret 2021, pada pukul 13.00 WIB
sampai dengan selesai. Praktikum ini dilaksanakan di tempat praktikan masing- masing.

3.2 Alat

NO Alat & Bahan Fungsi

1. Bunsen Untuk pemanasan dan sterilisasi

2. Aquades Untuk pencampuran zat
3. Kaca Preparat Untuk tempat objek atau preparat
4. Label Untuk sumber informasi
5. Jarum Ose Untuk memindahkan biakan untuk
ditanam ke media baru
6. Tissue Untuk membersihkan sesuatu
7. Pipet Tes Untuk memindahkan cairan
8. Beaker Glass Untuk mengaduk cairan
9. Cawan Petri Pemurnian Untuk isolasi mikroorganisme
10. Larutan Kristal violet Untuk mengikat zat warna
11. Larutan lugols iodin Untuk mempertahankan zat warna
12. Larutan safranin Untuk memberikan warna
13. Alkohol 70% Untuk sebagai antiseptik
14. Alcohol 95% Untuk sebagai antiseptik

3.3 Cara Kerja

Cara kerja yang dilakukan dalam praktikum “Pewarnaan Gram Dan Pengamatan
Mikroskopis” adalah :

a) Pewarnaan bakteri, langkah-langkahnya sebagai berikut:

Bersihkan kaca preparat dengan menyemprotkan terlebih dahulu alkohol 70%,

lalu dikeringkan dengan tisue.

Tetesi 3 tetes air aquades secukupnya di atas kaca preparat.

 Panaskan terlebih dahulu jarum ose diatas bunsen.

Diamkan sejenak lalu ambil bakteri murni dari cawan petri.

Goreskan diatas kaca preparat, jarum ose dibakar lagi, lalu diletakkan kedalam
beker glass yang sudah ada aquades.

Keringkan kaca preparat dekat dengan api bunsen.

Lakukan hal yang sama untuk pengambilan bakteri murni.

Jika sudah dilakukan pengambilan bakteri murni, langkah selanjutnya adalah

pewarnaan gram.

Tetesi gram A diatas kaca preparat, tunggu sampai 45 detik.

Setelah itu cuci dengan air aquades.

T

Tetesi dengan gram B dan tunggu 1 menit.

T

Tetesi dengan gram C untuk membilas sehingga warna akan luruh.

Cuci dengan air aquades.

Tetesi dengan gram D tunggu 30 detik.

Cuci dengan air aquades.

b). Pengamatan bakteri, langkah-langkahnya meliputi:

Hidupkan mikroskop On.

Letakkan kaca preparat pada meja pengamatan mikroskop.

 Atur meja pengamatan sesuai kebutuhan.

Amati dari lensa mikroskop perbesaran yang terkecil dahulu, cari fokusnya.

Setelah mendapatkan fokusnya, baru beralih ke lensa mikroskop perbesaran

selanjutnya, cari fokusnya lagi.

Untuk lensa dengan perbesaran 40x0,65 cari fokus terlebih dahulu, jika sudah
mendapatkan fokus, alihkan lensa sehingga terlihat jarak antara perbesaran
40x0,65 dan 100x.

Kemudian tetesi minyak imersi pada bagian yang kita amati tadi.

Baru geserkan lensa mikroskop dengan perbesaran 100x cari fokus.

T

Amati, tulis di buku catatan (warna, gram, bentuk) bakteri.

 DAFTAR PUSTAKA

Fitri L, Yekki Y. 2011. Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Kitinolitik.
Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi Vol. 3 (2) : 20-25.

Holderman MV, Edwin DQ, Sendy BR. 2017. Identifikasi Bakteri Pada Pegangan
Eskalator Di Salah Satu Pusat Perbelanjaan Di Kota Manado. Jurnal Ilmiah
Sains Vol. 7 (1) : 13-18.

Lambui O, Magfirahtul J. 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Tanah di Hutan Sekitar
Danau Kalimpa’a, Kawasan Taman Nasional Lore Lindu, Sulawesi Tengah.
Jurnal Online Natural Sains Vol. 6 (1) : 73 – 82.

Jannah R, Safika, Jalaluddin M, Darmawi, Farida, Dwinna A. 2017. Jumlah Koloni

Bakteri Selulolitik Pada Sekum Ayam Kampung (Gallus Domesticus). Jurnal
Ilmiah Mahasiswa Veteriner Vol. 1 (3) : 558-565.

Nurhidayati S, Faturrahman, Mursal G. 2015. Deteksi Bakteri Patogen Yang Berasosiasi

Dengan Kappaphycus Alvarezii (Doty) Bergejala Penyakit Ice-Ice. Jurnal Sains
Teknologi & Lingkungan Vol. 1 (2) : 24-30.

Rahayu SA, Muhammad HG. 2017. Uji Cemaran Air Minum Masyarakat Sekitar
Margahayu Raya Bandung Dengan Identifikasi Bakteri Escherichia Coli.
Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology Vol. 4 (2) : 50-
56.

Ristiari NPN, Ketut SMJ, Ida APS. 2018. Isolasi Dan Identifikasi Jamur Mikroskopis
Pada Rizosfer Tanaman Jeruk Siam (Citrus Nobilis Lour) Di Kecamatan
Kintamani, Bali. Jurnal Pendidikan Biologi Undiksha Vol. 6 (1) : 10-19.

Sabdaningsih A, Anto B, Endang K. 2013. Isolasi Dan Karakterisasi Morfologi Koloni

Bakteri Asosiasi Alga Merah (Rhodophyta) Dari Perairan Kutuh Bali. Jurnal
Biologi Vol. 2 (2) : 11-17.
Wulandari D, , Desi P. 2019. Identifikasi Dan Karakterisasi Bakteri Amilolitik Pada
Umbi Colocasia Esculenta L. Secara Morfologi, Biokimia, Dan Molekuler.
Jurnal Bioteknologi dan Biosains Indonesia Vol. 6 (2) : 247-258.
Yasir Y. 2015. Bakteri dan Kesehatan Manusia. Seminar Nasional Mikrobiologi
Kesehatan dan Lingkungan.