Tersedia online di www.sciencedirect.

com Energy Procedia 119 ( 2017) 38–51

Energy Procedia 00 (2017) 000–000
ScienceDirect
ScienceDirect
Energy Procedia 00 (2017) 000–000
Tersedia online di Tersedia online
di www.sciencedirect.com
www.elsevier.com/locate/procedia
www.sciencedirect.com Energy
Procedia 00 (2017) 000–000 www.elsevier.com/locate/procedia

ScienceDirect
ScienceDirect www.elsevier.com/locate/procedia
Konferensi Internasional tentang Teknologi dan Bahan untuk
Energi Terbarukan , Lingkungan dan Keberlanjutan,
TMREES17, 21-24 April 2017,Beirut Lebanon
Konferensi Internasionaltentang Teknologi dan Bahan untuk
Energi Terbarukan, Lingkungan dan Keberlanjutan,
TMREES17, 21-24 April 2017, Beirut Lebanon
Biodegradasi dan Detoksifikasi Malachite
Green Dye Menggunakan Biodegradasi
dan Detoksifikasi Pewarna Hijau Malachite
Menggunakan
Simposium Internasional ke-15 tentangPemanas dan
Pendingin Distrik
Enzim Noveldari Bacillus cereus
StrainKM201428: Enzim Novel Kinetik
dari Bacillus c ereus Regangan
KM201428: Kinetic dan Metabolit
Analisis
Menilai kelayakan menggunakan
panas permintaan luar ruangan dan
Analisis Metabolit
fungsitemperaturuntuk permintaan panas
kabupaten jangka panjang ramalan
Wycliffe Chisutia Wanyonyi *a,John Mmari
Onyarib,Paul Mwanza Shiunduc,Francis Wycliffe
Chisutia Wanyonyi *a, John Mmari Onyarib, Paul
Mwanza Shiunduc, Francis
Jackim Mulaad
I. Andrića, b, c*, A. Pinaa, P. Ferrãoa, J. Fournierb., B.
Lacarrièrec, O. Le Correc
Jackim Mulaad
Departemen
Ilmu Fisika, Fakultas Sains & Teknologi, Universitas Kabianga, PO Box 2030- 20200
Kericho, Kenya. aIN + Pusat Inovasi, Teknologi dan Penelitian Kebijakan - Instituto
Superior Técnico, Av. Rovisco Pais 1, 1049-001 Lisbon, Portugal
b
Departemen Kimia, Sekolah Tinggi Ilmu Biologi dan Fisika, Universitas Nairobi, PO Box
30197 - 00100, Nairobi, Kenya. DepartemenIlmu Fisika, Fakultas Sains & Teknologi,
Universitas Kabianga, PO Box 2030- 20200 Kericho, Kenya. bVeolia Recherche &
Innovation, 291 Avenue Dreyfous Daniel, 78520 Limay, Prancis
c
Departemen Ilmu dan Teknologi Kimia, Universitas Teknik Kenya, Haile Selassie Avenue, PO Box
 52428 - 00200, Nairobi, bDepartemen Kimia, Sekolah Tinggi Biologi dan Fisik Sains, Universitas
Nairobi, PO Box 30197 - 00100, Nairobi, Kenya.
Kenya IMT Atlantique, 4 rue Alfred Kastler, 44300 Nantes,
c
Département Systèmes Énergétiques et Environnement - Prancis
c
Departemen Ilmu dan Teknologi Kimia, Universitas Teknik Kenya, Haile Selassie Avenue, PO Box
52428 - 00200, Nairobi, dDepartemen Biokimia, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan, Universitas
Nairobi, PO Box 30197 - 00100, Nairobi, Kenya.
Kenya
d
Departemen Biokimia, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan, Universitas
Nairobi, PO Box 30197 - 00100, Nairobi, Kenya. Abstrak
Abstrak
Abstrak
Degradasi polutan organik berbasis enzim merupakan pendekatan detoksifikasi yang
menjanjikan karena sifat promiscuous dari jaringan pemanas Distrik umumnya
dibahas dalam literatur sebagai salah satu solusi paling efektif untuk menurunkan
enzim, efisiensi, hemat biaya dan ramah lingkungan. Dalam studi ini, kami telah
melakukan dekolorasi terperinci dan
degradasi polutan organik berbasis enzim adalah pendekatan detoksifikasi yang
menjanjikan karena sifat bebas emisi gas rumah kaca dari sektor bangunan. Sistem
ini membutuhkan investasi tinggi yang dikembalikan melalui studi degradasi panas
pada model kelompok pewarna triphenyl methane (Malachite Green dye (MG))
menggunakan enzimbaru diisolasi
enzim yang, efisiensi, hemat biaya dan ramah lingkungan. Dalam studi ini, kami
telah melakukan penghilangan warna dan penjualan secara detail. Karena kondisi
iklim yang berubah dan kebijakan renovasi bangunan, kebutuhan panas di masa yang
akan datang bisa berkurang, dari Bacillus cereus KM201428 dalam kondisi statis.
Biodegradasi zat warna dipantau denganUV-VIS
studi degradasipada model gugus trifenil metana zat warna (zat warna Malachite
Green (MG)) menggunakan enzim yang baru diisolasi untuk memperpanjang
periode pengembalian investasi.
spektrofotometer dan metabolit yang dihasilkan dianalisis dengan Liquid Chromatography –
Hybrid Quadrupole Time of Flight Mass
dari Bacillus cereus KM201428 dalam kondisi statis. Biodegradasi pewarna dipantau
dengan UV-VIS. Ruang lingkup utama makalah ini adalah untuk menilai kelayakan
penggunaan permintaan panas - fungsi suhu luar ruangan untuk Spektrometri
permintaan panas (LC – QToF-MS) dan Kromatografi Gas / Spektrometri Massa
(GC - MS ). Hasil analisis metabolit menunjukkan bahwa
spektrofotometer dan metabolit yang dihasilkan dianalisis dengan prakiraan Liquid
Chromatography – Hybrid Quadrupole Time of Flight Mass. Distrik Alvalade, yang
terletak di Lisbon (Portugal), digunakan sebagai studi kasus. Distrik ini terdiri dari
665 degradasi enzimatik pewarna MG menghasilkan mineralisasi lengkap dan
penghapusan cincin benzena; yang terakhir dikenal untukorganik
Spektrometri(LC-QToF-MS) dan Kromatografi Gas / Spektrometri Massa (GC -
MS). Hasil analisis metabolit menunjukkan bahwa bangunan yang dibangun
bervariasi baik dalam periode konstruksi maupun tipologi. Tiga skenario cuaca
(rendah, sedang, tinggi) dan tiga distrik zat warna toksisitas. Hasil studi kinetik
menunjukkan bahwa model kinetik orde pertama paling baik diterapkan untuk
mendeskripsikan penghilangan warna pewarna MG.
degradasi enzimatik dari pewarna MG menghasilkan mineralisasi lengkap dan
penghilangan cincin benzena; yang terakhir dikenal untuk skenario renovasi organik
dikembangkan (dangkal, menengah, dalam). Untuk mengestimasi kesalahan,
diperoleh nilai kebutuhan panas yang digunakan kinetika Michaelise-Menten, plot
Lineweaver-Burk dan model plot Eadie-Hofstee untuk menetapkan parameter kinetik
toksisitas zat warna. Hasil studi kinetik menunjukkan bahwa model kinetik orde
pertama paling baik diterapkan untuk mendeskripsikan penghilangan warna
pewarna MG. dibandingkan dengan hasil dari model permintaan panas dinamis,
yang sebelumnya dikembangkan dan divalidasi oleh penulis. untuk penghilangan
warna pewarna. Plot Lineweaver-Burk memberikan korelasi teoritis terbaik dari
data eksperimen denganmaksimum
kinetika Michaelise-Menten, plot Lineweaver-Burk dan model plot Eadie-Hofstee
digunakan untuk menetapkan parameter kinetik. Hasil menunjukkan bahwa hanya
perubahan cuaca yang dipertimbangkan, margin kesalahan dapat diterima untuk
beberapa tingkat aplikasi (Vmax) dari 17,70 mg l-1h-1 dan Michaelis konstan (Km)dari
 124 mgl-1.Hasil memberikan bukti bahwa enzim kasar dari
pewarna untuk penghilangan warna. Plot Lineweaver-Burk memberikan korelasi
teoritis terbaik dari data eksperimen dengan maksimum (kesalahan dalam permintaan
tahunan lebih rendah dari 20% untuk semua skenario cuaca yang dipertimbangkan).
Namun, setelah memperkenalkan renovasi Bacillus cereus strain KM201428
menawarkan bioteknologi yang efektif, terbarukan, ramah lingkungan dan terjangkau
untuk pengobatan
tingkat (Vmax) 17,70 mg l-1h-1 dan Michaelis konstan (Km)dari 124 mgl-1.Hasil
memberikan bukti bahwa enzim kasar dari skenario, nilai kesalahan meningkat
hingga 59,5% (tergantung pada cuaca dan kombinasi skenario renovasi
dipertimbangkan). limbah industri tercemar dengan pewarna organik.
Bacillus cereus StrainKM201428 menawarkan bioteknologi yang efektif, terbarukan,
ramah lingkungan dan terjangkau untuk pengobatan Nilai koefisien kemiringan
meningkat rata-rata dalam kisaran 3,8% hingga 8% per dekade, yang sesuai dengan
limbah industri yang tercemar dengan pewarna organik.
penurunan jumlah jam pemanasan 22-139h selama musim pemanasan (tergantung
pada kombinasi cuaca dan© 2017 The Authors. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
skenario renovasi). Di sisi lain, fungsi intersep meningkat 7,8-12,7% per dekade (tergantung
pada
© 2017 The Authors. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
Peer-review di bawah tanggung jawab Euro-Mediterranean
Institute for Sustainable Development (EUMISD). © 2017 The
Penulis Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
Peer-review di bawah tanggung jawab Euro-Mediterranean Institute for Sustainable
Development (EUMISD).
Skenario digabungkan). Nilai yang disarankan dapat digunakan untuk memodifikasi
parameter fungsi untuk skenario yang dipertimbangkan, dan Tinjauan sejawat di
bawah tanggung jawab Euro-Mediterranean Institute for Sustainable Development
(EUMISD). meningkatkan akurasi perkiraan permintaan panas.
Kata kunci: Biodegradasi, Zat Warna Malachite Green, Bacillus cereus, Kinetik, Metabolit
Kata Kunci: Biodegradasi, Zat Warna Malachite Green, Bacillus cereus, Kinetik, Metabolit
© 2017 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
Peninjauan sejawat di bawah tanggung jawab Komite Ilmiah Simposium Internasional
ke-15 tentang Pemanasan Distrik dan
* Penulis yang sesuai. Tel .: +254 721810325
Pendinginan.
Alamat email: wwanyonyi@kabianga.ac.ke
* Penulis terkait. Tel .: +254 721810325
Alamat email: wwanyonyi@kabianga.ac.ke
Kata kunci: Permintaan panas; Ramalan cuaca; Perubahan iklim
1876-6102 © 2017 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
Peer-review di bawah tanggung jawab Euro-Mediterranean Institute for Sustainable Development
(EUMISD).
1876-6102 © 2017 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
Peer-review di bawah tanggung jawab Euro-Mediterranean Institute for Sustainable Development
(EUMISD).

1876-6102 © 2017 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.

Peer-review di bawah tanggung jawab Komite Ilmiah Simposium Internasional ke-15 tentang
Pemanasan dan Pendinginan Distrik.
1876-6102 © 2017 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
Peer-review di bawah tanggung jawab Euro-Mediterranean
Institute for Sustainable Development (EUMISD). 10.1016 /
j.egypro.2017.07.044
Wycliffe Chisutia Wanyonyi dkk. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 39
Wanyonyi et al. / Energy Procedia 00 (2017) 000–000

1. Pendahuluan
Pewarna sintetis banyak digunakan di tekstil, penyamakan kulit, kosmetik,
percetakan, obat-obatan dan industri pengolahan makanan untuk produk
pewarna. Saat ini, pewarna terus ditingkatkan dan diganti dengan senyawa
unggul yang meningkatkan ketahanan, stabilitas, kecerahan dan ketahanan
terhadap degradasi alami seperti sinar matahari. Meskipun pemanfaatan zat
warna yang ekstensif membuatnya berharga bagi kehidupan manusia, zat
warna juga memiliki dampak negatif terhadap lingkungan dan kesehatan
manusia karena residu mereka dalam limbah [1]. Pembuangan air limbah
 berwarna dari industri ini ke aliran alami telah menyebabkan banyak
masalah yang signifikan, seperti peningkatan toksisitas, kebutuhan oksigen
kimiawi dari limbah, dan penurunan penetrasi cahaya, yang memiliki efek
buruk pada fenomena fotosintesis [2]. Pewarna biasanya memiliki asal
sintetik dan struktur molekul aromatik kompleks yang membuatnya lebih
stabil dan lebih sulit terurai [3]. Selain itu, pewarna tidak hanya polutan
bandel dan tahan api yang merupakan beban lingkungan yang signifikan,
tetapi juga beracun, mutagenik, dan karsinogenik.

Pewarna hijau malasit oksalat (Gbr. 1) adalah hijau tua, padatan kristal dan
senyawa kontroversial, karena efeknya pada sistem kekebalan dan
reproduksi serta potensi genotoksisitas dan karsinogenisitas [4,5].
Meskipun toksisitasnya tinggi, MG saat ini digunakan secara luas di
seluruh dunia untuk pewarnaan karena biayanya yang relatif rendah, mudah
didapat dan efisiensinya. Paparan MG pada manusia dapat disebabkan oleh
konsumsi ikan yang diolah, bekerja di industri pewarna dan akuakultur.
Beberapa metode fisikokimia telah digunakan untuk menghilangkan
pewarna dari limbah air limbah [6-8]. Namun, penerapan metode ini
memiliki kelemahan yang melekat secara ekonomi tidak layak,
ketidakefisienan dalam penghilangan zat warna dan pembentukan lumpur
yang mengakibatkan pencemaran sekunder. Selain itu, pewarna yang
mengandung air limbah dari industri tekstil dibuang pada pH tinggi, suhu
dan kadar salinitas tinggi sehingga menimbulkan masalah pada metode
pengolahan fisikokimia konvensional. Pengembangan teknologi baru yang
ekonomis, terbarukan dan sangat efektif untuk mengatasi pengolahan
limbah yang mengandung zat warna dalam air limbah tekstil tidak bisa
terlalu ditekankan. Biodegradasi pewarna dengan cepat menjadi terkenal
sebagai alternatif yang ramah lingkungan dan lebih murah.

+ O HO OH
H 3C N
2 2
CH 3 H 3 CCH 3 - O
O
N
OH
O
O

Gambar 1. Struktur pewarna Malachite Green Oxalate (MG).

Mikroorganisme ekstremofil seperti bakteri alkalifil menunjukkan

kemampuan untuk tumbuh pada kondisi lingkungan yang sangat keras
seperti pH tinggi, suhu, tingkat salinitas dan tekanan yang sangat
mempengaruhi pertumbuhannya. Perlu dicatat bahwa ini adalah kondisi
lingkungan yang hampir serupa di mana air limbah industri yang
mengandung pewarna organik dilepaskan ke badan air penerima. Penerapan
enzim dari mikroorganisme ekstremofil dari Danau Soda Celah Afrika
Timur dalam bioremediasi pewarna organik masih sangat kurang.
Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki kemanjuran protease alkali kasar
dari bakteri Bacillus cereus ekstremofilstrain KM201428 dari Danau
Bogoria (Danau Soda di Kenya) dalam biodegradasi pewarna MG. Korelasi
sifat kinetik dengan konsentrasi substrat (pewarna) dan parameter
lingkungan yang bergantung pada kecepatan diselidiki. Metabolit yang
dihasilkan selanjutnya dianalisis dengan GC-MS dan LC-QToF-MS. Studi
ini memberi peluang untuk mengembangkan bioteknologi hijau baru dan
memberikan informasi mendasar tentang pemanfaatan enzim dari
mikroorganisme ekstremofil dalam detoksifikasi pewarna organik yang
terkandung dalam air limbah industri.
40 Wycliffe Chisutia Wanyonyi dkk. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 Wanyonyi et al. /

Energy Procedia 00 (2017) 000–000 3 2. Bahan dan Metode

2.1 Bahan Kimia

Pewarna dasar kationik, Malachite green oxalate (MW: 929.03g) diperoleh
dari Loba-Austria dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Larutan
stok disiapkan dalam air suling ganda dan pH disesuaikan dengan
menambahkan 0,1 M HCl atau NaOH. Semua media kultur, senyawa
organik dan anorganik, dan reagen yang digunakan dalam analisis GC - MS
dan LC - QToF-MS diperoleh dari Sigma Aldrich. Protease alkali mentah
diproduksi oleh Bacillus cereus strain KM201428 menggunakan 1% kasein
dalam fermentasi terendam seperti yang dijelaskan oleh Wanyonyi
[9]Penghilangan

2.2warna pewarna dalam kondisi berbeda

Percobaan batch dilakukan dalam labu berbentuk kerucut 100ml pada
pengocok Orbital Thermolyne pada 150 rpm yang berjalan pada waktu
yang berbeda interval pada 25˚C. Semua percobaan dilakukan dalam
rangkap tiga dan nilai rata-rata dilaporkan. Spektrofotometer UV-Vis
ditetapkan ke nilai panjang gelombang maksimum (617 nm) untuk semua
pengukuran absorbansi. Pengaruh waktu kontak diselidiki dengan
menggunakan 10ml protease kasar yang dicampur dengan 40 ml larutan
pewarna 9,30mg / L MG pada pH 8,5 dalam 100 ml labu berbentuk
kerucut. Biodegradasi pewarna MG dipantau dengan Spektrofotometer UV-
Vis (U-2810 Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Jepang). Setelah
interval waktu yang berbeda, alikuot dari campuran reaksi dianalisis untuk
residu pewarna MG. Pengaruh konsentrasi pewarna awal diselidiki dengan
memvariasikan konsentrasi MG awal mulai dari 0,93mg / L hingga
9,30mg / L. 10 ml protease kasar dicampur dengan 40 ml larutan pewarna.
Pembacaan absorbansi diambil dengan interval 10 menit sampai
kesetimbangan tercapai. Pengaruh suhu diteliti pada kisaran suhu 25 - 70˚C
dan pH 8,5. 40 ml pewarna MG konsentrasi awal 9,30 mg / L dicampur
dengan 10 ml protease kasar yang telah disetarakan sebelumnya pada suhu
kerja selama 30 menit sebelum dicampur dalam labu berbentuk kerucut
100ml. Pembacaan absorbansi diambil pada interval 10 menit sampai
mencapai kesetimbangan. Efisiensi dekolorisasi enzim dihitung
menggunakan persamaan berikut: AA
0 -=
× A
Dekolorisasi (%) 100 (1)
0

Dimana A0 adalah absorbansi awal dan A adalah absorbansi media setelah

penghilangan warna pewarna pada λmaks (nm) 2.3 Penentuan Tingkat
Konsumsi Pewarna Maksimum (Vmax), Konstanta Tingkat
Penghilangan Warna (Km) dan Model Urutan Kinetika Reaksi (k0,
k1 dan k2)
Penentuan tingkat konsumsi pewarna MG maksimum (V max), dekolorisasi
laju konstan (Km)dan kinetika reaksi model agar diselidiki pada 25˚C dan
pH 8. 40 ml MG pewarna konsentrasi mulai dari 0.93mg / L untuk 9.30mg /
L ditempatkan di 100ml termos kerucut yang berbeda dan 10 ml protease
mentah ditambahkan ke setiap labu. Pembacaan absorbansi diambil dalam
rangkap dua pada interval 30 menit selama 6 jam dan nilai rata-rata
dihitung. Hasil yang diperoleh disesuaikan dengan berbagai persamaan
model kinetik dimana kesesuaian model ditentukan dan nilai untuk V max,
Km, k0, k1 dan k2 dihitung.

2.4 Analisis Metabolit dengan Kromatografi Cair – Spektrometri

Massa Waktu Penerbangan Quadrupole Hibrid (LC – QTOF-
MS)
Setelah penghilangan warna lengkap MG, 15 ml produk terdegradasi
yang mengandung metabolit, enzim kasar, dan larutan pewarna
disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 10 menit untuk menghilangkan
kotoran. Ekstrak dipekatkan dalam vakum sampai kering kemudian
dilarutkan kembali dalam 3 mL metanol LC-MS grade
CHROMASOLV (Sigma-Aldrich) sebelum disentrifugasi pada 14.000
rpm selama 10 menit; setelah itu 0,5 μL secara otomatis diinjeksikan ke
dalam LC − QToF − MS. Pemisahan kromatografi dicapai pada sistem
kelas I Waters ACQUITY UPLC (ultra-performance liquid
chromatography) (Waters Corpo- ration, Maple Street, MA) yang
dilengkapi dengan ukuran partikel 2,1 mm x 100 mm, 1,7 μm Waters
 ACQUITY UPLC BEH Kolom C18 (Waters Corporation, Dublin,
Irlandia) dipanaskan hingga 40 ° C dan baki sampler otomatis
didinginkan hingga 15 ° C. Fase gerak air (A) dan asetonitril (B),
masing-masing dengan 0,01% asam format digunakan. Gradien berikut
digunakan: 0−1.5 menit, 10% B; 1,5−2 menit, 10−50% B; 2−6 menit,
50−100% B; 6−9 menit, 100% B; 9−10 menit, 90−10% B; 10-12 menit,
10% B. Laju aliran dipertahankan konstan pada 0,4 mL / menit. Sistem
UPLC dihubungkan oleh ionisasi elektrospray (ESI) ke Waters Xevo
QToF-MS yang dioperasikan dalam MSE scan penuh dalam mode
positif. Data diperoleh dalam mode resolusi pada rentang m / z 100-
1200 dengan waktu pemindaian 1 detik menggunakan tegangan kapiler
0,5 kV, tegangan kerucut sampling 40 V, suhu sumber 100 ° C, dan
suhu desolvasi 350 ° C. Laju aliran desolvasi nitrogen adalah 500 L /
jam. Untuk pemindaian energi tinggi
Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 41 Wanyonyi et al. / Energy

Procedia 00 (2017) 000–000

fungsi, ramp energi tabrakan 25−45 eV diterapkan

dalam sel tumbukan gelombang-T menggunakan argon
dengan kemurnian sangat tinggi (≥99.999%) sebagai gas
tabrakan. Senyawa referensi semprotan kunci kontinu
(leusin enkefalin; [M + H] + = 556,2766) diambil
sampelnya pada interval 10 detik untuk koreksi massa
data sentroid. Spektrometer massa dikalibrasi di
rentang massa 50−1200 Da menggunakan larutan
natrium format 0,5 mM yang disiapkan dalam 90:10 2-
propanol / air (v / v). Komposisi unsur dihasilkan
untuk setiap analit. Tugas potensial dihitung
menggunakan massa monoisotop dengan spesifikasi
toleransi penyimpangan 10 ppm dan keadaan elektron
ganjil dan genap mungkin. Rumus empiris yang
dihasilkan digunakan untuk memprediksi struktur
yang diusulkan berdasarkan database online
(ChemSpider, Metlin), pola fragmentasi, dan literatur.

2.5 Analisis Metabolit dengan Kromatografi Gas / Spektrometri

Massa (GC / MS)
Metabolit terdegradasi zat warna MG diekstraksi menjadi fasa organik
menggunakan toluena. Dua labu berbentuk kerucut 100 ml; satu berisi 25ml
1,0 x 10-4 MG dan lainnya yang mengandung 25ml metabolit MG
terdegradasi masing-masing dicampur dengan 5ml toluena. Campuran
diaduk pada suhu 25˚C sebelum menambahkan 3ml kalsium karbonat
50 persen. Campuran diaduk selama satu jam pada 140 rpm pada suhu
25˚C dan kemudian dibiarkan mengendap selama satu jam setelah itu
lapisan berair bagian bawah ditarik dan dibuang, dan lapisan toluena
yang mengandung pewarna MG dan metabolit dihilangkan untuk
analisis. Analisis GC-MS dari pewarna MG dan metabolitnya yang
terdegradasi dilakukan dianalisis dengan injeksi split / splitless
menggunakan model menggunakan Hewlett Packard Agilent GC /
Mass Spec, Model 6890 digabungkan dengan spektrometer massa XL EI
/ CI 5975C inert (Agilent Technologies , Palo Alto, CA) (GC − MS),
dilengkapi dengan kromatograf gas terintegrasi dengan kolom DB-5
(panjang 30 m, diameter internal 0,25 mm). Helium digunakan sebagai
gas pembawa dengan kecepatan aliran 1,3 mL / menit. Temperatur
injektor dipertahankan pada 300 ° C dengan kondisi oven. Suhu kolom
awal dipertahankan pada 40 ° C selama 3 menit, kemudian dinaikkan
secara linier pada 10 ° C / menit menjadi 325 ° C, dan ditahan selama 2
menit. Ionisasi dilakukan dalam mode tumbukan elektron. Tegangan
pengali elektron (El 70 eV) dan target kendali penguatan otomatis
ditetapkan secara otomatis. Produk yang terdegradasi diidentifikasi
 dengan perbandingan waktu retensi dan pola fragmentasi, serta dengan
spektrum massa di perpustakaan spektral National Institute of Standards
and Technology (NIST) yang disimpan dalam perangkat lunak
komputer GC-MS.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1 Pengaruh waktu kontak pada penghilangan warna pewarna
MG
Pengaruh waktu kontak pada penghilangan warna pewarna MG oleh enzim
kasar Bacillus cereus KM201428 diselidiki dan hasil menunjukkan bahwa
MG benar-benar menghilangkan warna setelah 12 jam dengan
penghilangan warna lebih dari 98%. Gambar. 2 mengilustrasikan spektrum
UV-Vis tipikal dari MG kontrol pada waktu nol dan sampel pewarna MG
dicampur dengan enzim pada berbagai periode waktu. Puncak diamati pada
428 nm dan 617 nm pada waktu awal (0 menit). Selama degradasi
enzimatik, puncak secara bertahap menurun tanpa pergeseran λ max sebelum
menghilang. Hilangnya total
puncak utama pada 617 nm setelah 12 jam serta puncak minor pada 428 nm
dengan jelas menunjukkan bahwa protease kasar secara efektif
menghilangkan warna pewarna MG. Pengamatan ini konsisten dengan
temuan sebelumnya yang dilaporkan oleh Du [10] yang menyelidiki
biodegradasi malachite green oleh Pseudomonas sp. saring DY1 dalam
kondisi aerobik.

1,2 0
e
335 435 535 635 735 Panjang
gelombang (nm)
c

br
0,8 0 Menit 5 Menit 10 Menit 1 Jam
o

s
1,5 Jam 2 Jam
bA
3 Jam
1,6 0,4 6 Jam
12 Jam

Gambar. 2. Pemindaian spektra UV-Vis pewarna MG (1,0x 10 -5M) terurai oleh protease kasar dari
Bacillus cereus strainKM201428 pada periode waktu yang berbeda, pH 8 dan 25˚C
42 Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 Wanyonyi et al. / Energy

Procedia 00 (2017) 000–000 5

3.2 Pengaruh konsentrasi pewarna MG awal pada dekolorisasi

Konsentrasi substrat yang ada dalam fase air memiliki pengaruh yang
signifikan pada reaksi yang dimediasi oleh enzim [11]. Pengaruh
konsentrasi pewarna MG awal diselidiki pada konsentrasi yang berbeda
(0,93-9,30mgl-1), sambil menjaga semua parameter lainnya konstan. Jumlah
pewarna yang dihilangkan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi
pewarna MG awal(Gbr. 3). Misalnya, jumlah pewarna MG yang
dihilangkan pada kesetimbangan meningkat dari 0,77 menjadi 8,26 mgL -1
dengan peningkatan konsentrasi pewarna MG dari 0,93 menjadi 9,3 mg L -1.
Hal ini dapat dikaitkan dengan lebih banyak molekul pewarna yang tersedia
untuk penghilangan warna dan degradasi selanjutnya ketika konsentrasi
pewarna ditingkatkan.
Namun, efisiensi penghilangan warna menurun dengan meningkatnya
konsentrasi pewarna MG. Tren yang diamati konsisten dengan literatur
yang diterbitkan [12].
 Gambar 3. Pengaruh konsentrasi pewarna MG pada dekolorisasi enzim.
3.3 Pengaruh Temperatur pada penghilangan warna zat warna MG
Pengaruh temperatur pada penghilangan warna zat warna dievaluasi dengan
menginkubasi campuran zat warna dan enzim pada temperatur antara 25 -
70˚C dan hasilnya disajikan pada Gambar. 4. Hasil dengan jelas
menunjukkan bahwa penghilangan warna meningkat dengan peningkatan
dalam suhu hingga 40˚C, setelah itu penghilangan warna menurun secara
bertahap. Suhu optimal untuk penghilangan warna ditemukan pada 40 ° C.
Pada suhu tinggi melebihi 40 ° C, terjadi penurunan laju penghilangan
warna. Pengamatan ini dapat dikaitkan dengan denaturasi termal dari
molekul enzim. Selain itu, suhu yang sangat tinggi merusak struktur enzim
sehingga mengurangi kapasitas pengikatan situs aktifnya untuk molekul
substrat. Hasil serupa telah dilaporkan sebelumnya [13].

Gambar. 4. Pengaruh suhu pada dekolorisasi pewarna MG.

Wycliffe Chisutia Wanyonyi dkk. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 43 Wanyonyi et al. / Energy

Procedia 00 (2017) 000–000

3.4 Studi Kinetik

3.4.1 Urutan Dekolorisasi

Kinetika proses dekolorisasi memberikan informasi yang berguna
mengenai efisiensi degradasi enzimatik dan kelayakan operasi peningkatan
skala. Data dekolorisasi yang diperoleh dari hasil eksperimen dianalisis
dengan Nol, pertama dan ketertiban kinetik persamaan model kedua
diberikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Nol, pertama dan urutan kedua kinetik models

Model Kinetik Bentuk Linear Plot Rate konstan
Nol rangka
CC kt t = 0-0 (Ct)vs waktu k0(mgl-1min-1)
Orde pertama lnC
ln () ln () 1 C0 C kt t = + t vs waktu k1(min-1)
11 (1 / C
=+ t ) vs waktu k2(mg / l menit)
Orde kedua
kt
C tC 2
0
 Dimana Ct adalah konsentrasi zat warna dalam larutan (mgl -1) pada setiap
waktu t dan C0 adalah konsentrasi awal zat warna dalam larutan (mgl -1).
Hasil yang diperoleh pada konsentrasi pewarna MG awal yang berbeda
digunakan untuk menentukan urutan penghilangan warna pewarna.
Konstanta laju reaksi degradasi dan koefisien setidaknya analisis metode
kuadrat ditabulasikan pada Tabel 2. koefisien korelasi (R2)adalah tertinggi
dalam model orde pertama di kisaran 0,95-0,99, dibandingkan dengan Zero
dan kinetik urutan kedua model yang berada di bawah 0,83. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa biodegradasi enzimatis zat warna MG
mengikuti model kinetika orde satu. Gambar 5 menunjukkan plot untuk
model kinetik orde pertama untuk konsentrasi awal pewarna MG yang
berbeda. Data eksperimen menunjukkan kesesuaian yang baik dengan
model kinetik orde pertama yang mengkonfirmasikan bahwa itu adalah
yang terbaik untuk menggambarkan kinetika degradasi enzimatik pewarna
MG menggunakan protease kasar dari Bacillus cereus strainKM201428.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa proses penghilangan warna
bergantung pada konsentrasi zat warna MG. Temuan ini konsisten dengan
hasil sebelumnya yang dilaporkan dalam literatur [14].

Gambar 5.satu pada konsentrasi awal zat warna MG yang berbeda

44 Kinetika ordeWycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51
Wanyonyi et al. / Energy Procedia 00 (2017)
000–000 7

Tabel. 2. Konstanta kinetik orde pertama dan kedua dan koefisien korelasi nol yang diperoleh dalam
degradasi enzimatikpewarna MG
model KinetikaKonstan 0.93mg / L 1.86mg / L 3.72mg / L 5.57mg / L
7.43mg / L 9.30mg / L Urutan nol k0(mgl-1min-1) 0,0019 0,0039 0,0076
0,0114 0,0147 0,0179 Co(cal) 0.5281 1.218 2.4898 3.9144 5.0876 6.0427
R2 0.7574 0.7444 0.780 0.8295 0.8132 0.744
Urutan pertama k1(min-1) 0,0152 0,0077 0,007 0,0062 0,0060 0,0061
Co(cal) 1.0072 1.392 2.826 4.387 5.646 6.491
R2 0,9814 0,9591 0,9626 0,9664 0,9694 0,9507
Urutan kedua k2 (l mg −menit1-1) 0,0069 0,0004 0,0212 0,0133 0,0138
0,033 Co(cal) 14.66 1.3381 0.1341 0.3729 0.4832
0.5240
R2 0,8053 0,0002 0,611 0,0677 0,5247 0,6385

3.4.2 Dekolorisasinya laju konstan (Km)dan Maximum Substrat

Konsumsi Rate (Vmax) Tingkat konsumsi substrat maksimum (Vmax)dan
tingkat dekolorisasi konstan (Km)ditentukan dengan menggunakan tiga yang
berbeda pendekatan yaitu Michaelis -Menten, Lineweaver Burk dan Eadie-
Hofstee.
i) Kinetika Michaelis -Menten
Hasil percobaan pada berbagai konsentrasi pewarna MG dianalisis
berdasarkan interpretasi Persamaan kinetika Michaelis-Menten. Persamaan
 VS
Michaelis-Menten diberikan sebagai berikut [15]. V
[] maks
(2)
m += []
KS
Dimana Vmax adalah tingkat konsumsi substrat (MG) maksimum dalam mg
l-1 h-1; V adalah tingkat konsumsi substrat dalam mg l -1 h-1; S adalah
konsentrasi substrat dalam mgl-1; Km adalah konstanta Michaelis -Menten
dalam mg l-1. Km sama dengan konsentrasi substrat jika laju reaksi setengah
dari kecepatan maksimum. Gambar 6 menunjukkan plot S (konsentrasi
pewarna MG dalam mgl-1) ayat V (mgl-1h-1) untuk penghilangan warna
enzimatik pewarna MG. Data eksperimental cocok dengan persamaan
Michaelis-Menten dengan nilai R2 tinggi 0,991 yang menunjukkan bahwa
penghilangan warna pewarna MG mematuhi persamaan kinetika Michaelis-
Menten dan juga menyarankan urutan reaksi orde pertama.

Gambar 6. Plot Michaelis-Menten untuk dekolorasi enzimatis pewarna

MG
ii) Plot Lineweaver-Burk
Ketika persamaan Michaelis-Menten ditransformasikan oleh timbal balik
ganda, diperoleh persamaan Lineweaver-Burk [16] di bawah ini:
1 K
m
=+ (3) 1
V
maks V max VS
[]
Plot 1 / V versus 1 / S menghasilkan garis lurus dengan 1 / Vmax sebagai
intersep pada ordinat ketika 1 / S mendekati nol, dan intersep (1 / Km) pada
absis ketika V mendekati nol. Plot Lineweaver-Burk ditunjukkan pada
Gbr.7. Data
Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 45
Wanyonyi et al. / Energy Procedia 00 (2017) 000–000

cocok dengan R2 Nilai 0,996 menunjukkan bahwa model plot Lineweaver-

Burk juga paling baik diterapkan untuk mendeskripsikan biodegradasi zat
warna MG oleh protease kasar dari Bacillus cereus strain KM201428.

Gambar. 7. Lineweaver-Burk rencana untuk penghilangan warna enzimatik MG dye

 iii) Eadie-Hofstee merencanakan
Cara lain untuk menghitung Km dan Vmaks adalah penggunaan Plot Eadie-
Hofstee. Memecahkan persamaan Michaelis-Menten untuk Vmax dan
penataan ulang, hasil persamaan Eadie-Hofstee di bawah ini:
max V
() (4) V S V = K m + Plot V terhadap (V / S) menghasilkan garis lurus
dengan kemiringan Km dan mencegat Vmax ..The Eadie-Hofstee plot yang
ditunjukkan pada Gambar. 8. Koefisien korelasi (R2)tidak dekat dengan 1,0
(R2 = 0,0104) menunjukkan bahwaEadie-Hofstee
plottidak sesuai dalam menggambarkan biodegradasi zat
warna MG oleh enzim protease kasar.

Gambar 8. Plot Eadie-Hofstee untuk dekolorasi enzimatik pewarna MG

A perbandingan Km dan Vmaks nilai yang diperoleh dari atas tiga pendekatan
diringkas dalam Tabel 3. Lineweaver Burk plot dan persamaan Michaelis-
Menten memiliki R tertinggi2 nilai-nilai. Oleh karena itu dapat disimpulkan
bahwa dekolorisasi MG oleh enzim protease kasar dapat dijelaskan dengan
paling baik oleh plot Lineweaver-Burk dan Michaelis-
46 Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 Wanyonyi et al. / Energy

Procedia 00 (2017) 000–000 9

Persamaan Menten. Hasil ini lebih lanjut menegaskan bahwa, penghilangan

warna MG oleh enzim protease kasar adalah proses ireversibel orde
pertama. Pengamatan serupa juga dilakukan oleh Shah [14] yang
menyelidiki degradasi enzimatik pewarna tekstil Reactive Orange 13 oleh
strain bakteri yang baru diisolasi Alcaligenes faecalis PMS-1

Tabel.3. Perbandingan Km dan Vmax nilai untuk dekolorasi enzimatik pewarna MG

Plot tipe Vmax (mg l-1 h-1) Km (mg l-1) R2
Kinetika Michaelis-Menten 0.1451 7.7017 0.9910 Lineweaver-
Burk plot 17.70 124.1955 0.9958 Eadie-Hofstee plot 0.1471
0.0019 0.0104Analisis

3.5GC-MS Analisis
GC-MS dilakukan untuk mengetahui metabolit yang terbentuk selama
proses biodegradasi. Tabel 4 merangkum berbagai metabolit yang diperoleh
pada waktu retensi berbeda dan struktur bahan kimia yang sesuai seperti
yang diidentifikasi dengan mencocokkan spektrumnya dengan spektrum
yang tercatat di perpustakaan spektral National Institute of Standards and
Technology (NIST) yang disimpan dalam perangkat lunak komputer GC-
MS. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ketika pewarna MG dilarutkan
dalam air yang tidak diolah dengan enzim (kontrol positif), ia berdisosiasi
menjadi Leuco Malachite Green (LMG). Diketahui secara luas bahwa LMG
sangat toksik bagi organisme akuatik karena disimpan dalam jaringan
lemak dan bertahan selama lebih dari sepuluh bulan setelah pengobatan
[17]. Oleh karena itu, degradasinya sangat diinginkan dan kritis. Setelah
pengobatan enzimatik, LMG didegradasi menjadi Methanone [4-
(dimethylamino) phenyl] phenyl (m / z 225); Phosphinic acid, bis[p-
(dimethylamino)phenyl], methyl ester (m/z 318); (E)-2-Hydroxy-4'-
dimethylamino-stilbene (m/z 239) and Benzylaniline (m/z 183). The result
implied crude protease from Bacillus cereus strain KM201428 effectively
 degraded MG dye. Similar results were reported by Du [10].

3.6 Liquid Chromatography–Hybrid Quadrupole Time-of-Flight

Mass Spectrometry (LC–QTOF-MS) Analysis
LC–QTOF-MS analysis was carried out to investigate
the metabolites formed during the biodegradation
process that could not be extracted and measured by
GC-MS. Structures of the metabolites resulting from
the enzymatic degradation of MG dye were
successfully identified. Using positive mode
electrospray ionization (ESI+) and multiple reaction
monitoring (MRM), identification and quantification
were accomplished. From the LC-QToF-MS result
analysis, twelve peaks of specific intermediate
products that were clearly distinguished compared
with the controls of MG without crude alkaline
protease enzyme or only alkaline protease enzyme
without MG (Fig.9). Based on the time for decolorizing,
the parent compound and intermediate compounds
formed were identified. The structure of MG dye could
not be detected by LC−QToF−MS suggesting that the
dye split into Leuco Malachite Green structure (LMG)
(mw 330) before fragmentation. Similar results have
been previously reported in malachite green
biodegradation by Exiguobacterium sp. MG2 [18]. From the
LC−QToF−MS results, it was possible to assign unique
elemental compositions to each peak observed during
the course of the analysis and probable molecular
structure drawn using ACD/ChemSketch ver. 12.0
(www.acdlabs.com) as shown in Fig. 10.

Analysis of metabolite showed that some metabolites detected were of

higher molecular weight than LMG and MG. Since biodegradation of MG
dye was performed at ambient conditions which could favor
polymerization, the above observation could be attributed to polymerization
of the resultant metabolite. The end products in the degradation of MG or
LMG were found to be Cyclohexanamine, 4-(cyclohexylmethyl)
cyclohexanamine and 6-amino-6-
oxohexanoic acid. Due to the limitation of the analysis method, it was not
possible to ascertain if these products were further degraded into CO, H 2O
and NH3. However, it is clear from the degraded metabolites that the
triphenylmethane structure was cleaved off followed by benzene ring-
removal together into cyclohexane. These observation differ with earlier
results reported by Cha [19] which indicated that either tridesmethyl MG or
LMG, the end-products in MG degradation by the Fungus Cunninghamella
elegans, keeps the intact triphenylmethane structure. From these results, it
can inferred that the enzymatic degradation of MG using protease from
Bacillus cereus strain KM201428 comprised not only the decoloration
reaction but also the more significant mineralization and benzene ring-
removal which are very important for the efficient removal of organic toxic
pollutants.
Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 47 Wanyonyi et al. / Energy

Procedia 00 (2017) 000–000

Table 4. GC-MS Scan chromatogram of metabolite obtained after MG dye degradation by crude
protease from Bacillus cereus strain KM201428
Metabolite name, chemical formula molecular Mass spectrum and corresponding chemicals
weight
 1 Leuco Malachite Green (LMG)

C23H26N2

Mw (m/z) 330

2 Methanone, [4-(dimethylamino) phenyl] phenyl

C15H15NO

Mw (m/z) 225

3 Phosphinic acid, bis[p-(dimethylamino)phenyl]-

, methyl ester

C17H23N2O2P

Mw (m/z) 318

4 (E)-2-Hydroxy-4'-dimethylamino-stilbene

C16H17NO

Mw (m/z) 239

5 Benzenemethanamine, N-phenyl
C13H13N

Mw (m/z) 183

48 Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 Wanyonyi et al. /
Energy Procedia 00 (2017) 000–000 11
 Fig.9. Extracted ion chromatograms of MG dye metabolites detected by LC–QTOF-MS in crude
protease enzyme supernatant. (A), (B) & (C) represent chromatograms of degraded MG metabolites
numbered M1-M12 and (D) represent chromatograms of leuco malachite green (LMG) resonance
structure detected when MG dye dissolved in water without treatment with crude alkaline protease.
Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy
Procedia 119 (2017) 38–51 49 Wanyonyi et al. /
Energy Procedia 00 (2017) 000–000

CH3 O O OH OH 2 H 3CN N CH 3
N
H3C
H2O CH 3 H 3C
O
Polymerization

N
+ HO O NN H 3CN N CH 3
H3C CH3 H3C CH3
2 BAGIAN 3 C
O BAGIAN3 BAGIAN3 H3

Malachite Green Oxalate (MG) dye (MW = 929.03g)` MW = 330.2; C23H26N2M9

Leuco Malachite Green (LMG)
Demethylation OH
MW - 658.4; C46H50N4
 C H
H3 N NH2 N CH3 C
N
H3 NO

CH3 (dimethylamino)phenyl]methanol MW= MW = 316.1; C22H24N2

242.1; C15H18N2O 4-[4-(dimethylamino) benzyl]benzoic
M11
C
acid MW = 255.3; C16H17NO2
H 3 BAGIAN3

BAGIAN3 OH

N-demethylated - LMG OH
OH
H 3C H
M2 N
(4-aminophenyl) [4- M8
4-(hydroxymethyl) phenol MW - 124.1; C7H8O2
CH 3 M7
HO

[4-(dimethylamino) phenyl](phenyl)methanol

MW = 227.3; C15H17NO
OH
NH2

H C O
2N H3 NH M1: Cyclohexanamine MW = 99.2;
2 C6H13N
NH
M3: bis(4-aminophenyl) methanol MW
= 214.3; C13H14N2O

H2N
M10: 4-(cyclohexylmethyl) O
cyclohexanamine MW = 195.2; C13H25N Polymerization
HO
OH
OH

OH
NH

NH2

NH OH M4 OH M5 NH
CH3
H3C M6 NH 6-amino-6-oxohexanoic
MW = 426.2; acid
Polymerization OH
MW - 145.1; C6H11NO3

C27H26N2O3 NH

MW = 636.3; C41H40N4O3

Fig.10. LC–QTOF-MS analysis of Intermediate product after degradation of the MG dye (Probable
Intermediates molecular structure drawn using ACD/ChemSketch ver. 12.0)
50 Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) Wanyonyi et al. / Energy

38–51
Procedia 00 (2017) 000–000 13 4. Conclusions

The study was conducted to explore the applicability of using crude

protease from Bacillus cereus strain KM201428 to decolorize and
biodegrade MG dye. The experimental results obtained revealed the
effectiveness of crude protease in the treatment MG dye. Operating
parameters affecting dye decolorization rate such as time, temperature and
initial dye concentration were extensively investigated. The ability of the
enzyme to degraded triphenylmethane structure of MG dye under a broad
range of temperature and different initial dye concentration suggested that
the enzyme could be useful in treatment of industrial wastewater. Kinetic
study of decolorization experiments approximate first-order reaction at
different initial dye concentration. Decolorization kinetic was carried out by
three different approaches namely Michaelis -Menten, Lineweavere Burk
and Eadie-Hofstee. Lineweaver-Burk plot and Michaelis-Menten equation
best described the MG dye biodegradation. The results clearly
 demonstrated that crude protease enzyme isolate from Bacillus Cereus
Strain KM201428 exhibit a novel alkaline protease properties with ability
to decolorize and degrade MG dye. UV-visible spectroscopy analysis
confirmed decolorization while GC-MS and LC–QTOF-MS analysis
confirmed degradation of MG dye into numerous non-toxic metabolites.
Taking these results into consideration, it can be concluded that crude
protease isolate from Bacillus Cereus Strain KM201428 can be exploited in
bioremediation and detoxification of triphenyl methane group of dyes as a
cost effective and ecofriendly alternative technology for treatment of
wastewater polluted with organic dye.

Acknowledgments
We are thankful to the National Commission for Science, Technology and
Innovation (NACOSTI) research endowment fund (Project no.
NCST/ST&I/RCD/4TH CALL PhD/140), World Federation of Scientists
(WFS) Scholarship through the International Centre for Insect Physiology
and Ecology (ICIPE) and Department of Chemistry and Biochemistry
University of Nairobi for supporting and providing the infrastructure
facilities for this study.

References

[1] Wangpradit R, Chitprasert P. Chitosan-coated Lentinus polychrous Lév.: Integrated biosorption

and biodegradation systems for decolorization of anionic reactive dyes. Int Biodeterior
Biodegrad 2014; 93:168–76.
[2] Bulut Y, Aydın H. A kinetics and thermodynamics study of methylene blue adsorption on wheat
shells. Desalination 2006; 194:259–67. [3] Song J, Zou W, Bian Y, Su F, Han R. Adsorption
characteristics of methylene blue by peanut husk in batch and column modes. Desalination 2011;
265:119–25.
[4] Srivastava S, Sinha R, Roy D. Toxicological effects of malachite green. Aquat Toxicol 2004;
66:319–29.
[5] Stammati A, Nebbia C, Angelis ID, Albo AG, Carletti M, Rebecchi C, et al. Effects of malachite
green (MG) and its major metabolite, leucomalachite green (LMG), in two human cell lines.
Toxicol In Vitro 2005;19:853–8.
[6] El-Zawahry MM, Abdelghaffar F, Abdelghaffar RA, Hassabo AG. Equilibrium and kinetic
models on the adsorption of Reactive Black 5 from aqueous solution using Eichhornia
crassipes/chitosan composite. Carbohydr Polym 2016; 136:507–15.
[7] Wanyonyi WC, Onyari JM, Shiundu PM. Adsorption of Congo Red Dye from Aqueous
Solutions Using Roots of Eichhornia Crassipes: Kinetic and Equilibrium Studies. Energy
Procedia 2014; 50:862–9.
[8] Wanyonyi WC, Onyari JM, Shiundu PM. Adsorption of Methylene Blue Dye from Aqueous
Solutions Using Eichhornia crassipes. Bull Environ Contam Toxicol 2013; 91:362–6.
[9] Wanyonyi WC, Onyari JM, Shiundu PM, Mulaa, JF. Enzymatic Decolorization of Malachite
Green Dye by a Newly Isolated Bacillus Cereus Strain wwcp1. J Environ Sci Toxicol Food
Technol 2014; 8:58–64.
[10] Du LN, Wang S, Li G, Wang B, Jia XM, Zhao YH, et al. Biodegradation of malachite green by
Pseudomonas sp. strain DY1 under aerobic condition: characteristics, degradation products, enzyme
analysis and phytotoxicity. Ecotoxicology 2011; 20:438–46. [11] Mohan SV, Prasad KK, Rao NC,
Sarma PN. Acid azo dye degradation by free and immobilized horseradish peroxidase (HRP)
catalyzed process. Chemosphere 2005; 58:1097–105.
[12] Alneyadi AH, Ashraf SS. Differential enzymatic degradation of thiazole pollutants by two
different peroxidases – A comparative study. Chem Eng J 2016; 303:529–38.
[13] Chiong T, Lau SY, Lek ZH, Koh BY, Danquah MK. Enzymatic treatment of methyl orange
dye in synthetic wastewater by plant based peroxidase enzymes. J Environ Chem Eng 2016;
4:2500–9.
[14] Shah PD, Dave SR, Rao MS. Enzymatic degradation of textile dye Reactive Orange 13 by
newly isolated bacterial strain Alcaligenes faecalis PMS-1. Int Biodeterior Biodegrad 2012;
69:41–50.
[15] Michaelis L, Menten ML. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z 1913; 49:333–69.
[16] Lineweaver H, Burk D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am
Chem Soc 1934;56:658–66. [17] Jian S, Wenyi T, Wuyong C. Ultrasound-accelerated
enzymatic hydrolysis of solid leather waste. J Clean Prod 2008; 16:591–7.
Wycliffe Chisutia Wanyonyi et al. / Energy Procedia 119 (2017) 38–51 51Wanyonyi et al. / Energy

Procedia 00 (2017) 000–000

[18] Wang J, Gao F, Liu Z, Qiao M, Niu X, Zhang KQ, et al. Pathway and Molecular Mechanisms
for Malachite Green Biodegradation in Exiguobacterium sp. MG2. PLoS ONE 2012; 7:1–10.
[19] Cha CJ, Doerge DR, Cerniglia CE. Biotransformation of Malachite Green by the Fungus
Cunninghamella elegans. Appl Environ Microbiol 2001; 67:4358–60.