Determinasi dari Morfin dan codein dalam serum setelah mengkonsumsi biji Poppy

Menggunakan Kromatografi gas- spektrum massa

M. MÁTYUS1,*, GY. KOCSIS1, O. BOLDIS1, G. KARVALY2, E. MAGYAR1, J. FŰRÉSZ2, AND A.

GACHÁLYI1

1Hungarian Defence Forces Dr György Radó Military Medical Center, Hungary 2Military Hospital-State Health Centre, Scientific
Institute, P.O. Box 1, H-1553 Budapest, Hungary *H-1118 Budapest, Rétköz utca 47/C, 2/2

Kesimpulan. Sebuah metode yang sensitif dikembangkan untuk menentukan morfin dan kodein
bebas dalam darah. Metode ini cocok untuk mendeteksi konsumsi obat-obatan terlarang. Tes ini
dapat diterapkan untuk memantau dosis terapeutik serta berdiri di pengadilan. Untuk pengujian
kami menggunakan deuterium dengan tag morfin dan kodein. Kami menandai spesimen darah
dengan deuterium sebelum pengujian. Bahan aktif (morfin dan kodein) diekstraksi dengan
ekstraksi fase padat, dan akhirnya diderivatisasi dengan pentafluoro propionik anhidrida (PFPA).
Senyawa yang dihasilkan stabil dan memiliki karakteristik kromatografi yang baik. Sistem Mass-
spektrofotometer (GC / MS) yang digabungkan dengan kromatograf gas digunakan untuk
menentukan konsentrasi senyawa yang dihasilkan menggunakan atau / dalam mode ion selektif
(SIM). Hasil ion target dan ion berkualitas adalah 414, 577, 361 untuk morfin, dan 282, 445
untuk kodein. Selama pengukuran kami, grafiknya linier antara 1 dan 100 ng / mL. Semua hasil
kualifikasi sejalan dengan Standar Jerman DIN 32645, yang diperiksa dengan program BEN.

Kata kunci: metabolit, obat-obatan terlarang, morfin, morfin bebas, kodein, biji poppy, GC-MS, darah

Pendahuluan
Kehadiran obat-obatan terlarang atau metabolitnya dalam urin merupakan bukti asupan,
konsentrasinya dalam darah diharapkan berkorelasi dengan efeknya pada sistem saraf pusat.
Seorang Kriminal yang berada dibawah pengaruh obat-obatan secara illegal di Hungaria
menerima hukuman berat [1-2]. Selain itu, interpretasi hasil analisis seringkali dipersulit oleh
fakta bahwa benih poppy domestik (Papaver somniferum), yang mengandung morfin dan
senyawa terkait dalam jumlah yang besar, merupakan bahan makanan yang disetujui dan
populer di Hongaria. Saat ini, tidak ada item hukum yang membatasi jumlah biji poppy dalam
makanan. Sepotong kue poppy, makanan penutup yang sangat populer di Hongaria, dapat
mengandung hingga 120 g poppy dan, akibatnya, sekitar 100 mg morfin. Investigasi yang
dilakukan di laboratorium kami menunjukkan bahwa orang dewasa mengeluarkan morfin dan
kodein dalam urin mereka di atas batas yang disetujui hingga 3 hari setelah makan sepotong
kue poppy [3]. Akibatnya, pendekatan untuk verifikasi yang jelas dari status "di bawah
pengaruh" sangat penting [4].

Pengalaman kami menunjukkan bahwa metabolit heroin spesifik 6- monoacetylmorphine (6-

MAM) terdeteksi pada konsentrasi yang lebih tinggi dari 10 ng mL-1 hanya dalam urin konsumen
heroin tetapi tidak dalam serum. Tidak adanya 6-MAM dalam urin, bagaimanapun, tidak
mengesampingkan konsumsi obat-obatan terlarang ketika morfin dan kodein hadir, karena
kodein diekskresikan oleh konsumen opium dan teh poppy, sementara morfin adalah agen
farmasi terkenal. dan metabolit penting dari kodein dan heroin [5].

Saat ini, tidak ada perbedaan hukum antara konsumsi kue poppy dan opiat ilegal di Hongaria.
Meskipun fakta ini telah diidentifikasi di makalah sebelumnya, tidak ada solusi yang diberikan.
Meningkatkan tingkat batas morfin dari 300 ng mL-1 menjadi 2000 ng mL-1 tidak memungkinkan
untuk diferensiasi ini dan rasio konsentrasi kodein dan morfin juga gagal untuk secara tegas
menunjukkan penggunaan obat-obatan terlarang [1-5]. Dalam upaya untuk mempromosikan
perbedaan ini, metode analisis throughput tinggi telah dikembangkan dan divalidasi untuk
penilaian konsentrasi morfin dan kodein dalam serum manusia.

Eksperimental
Protokol penelitian yang dilakukan dengan partisipasi sukarelawan manusia telah disetujui oleh
Komite Studi Etis dari Institut Perlindungan Kesehatan, Pasukan Pertahanan Hongaria,
sebelum penyelidikan dimulai.

Peralatan

Analisis dilakukan pada kromatograf gas (GC) Agilent 6890 digabungkan dengan spektrometer
massa kuadrupol tunggal Agilent 5973 (MS; Agilent Technologies, Wilmington, DE). Sampel
diinjeksi menggunakan unit autosampler Agilent. Ekstraksi analit dilakukan pada kartrid Bond
Elute Certify (CP-Analitika Kft., Budapest, Hongaria). Peralatan sekali pakai digunakan untuk
persiapan sampel bila memungkinkan, termasuk ujung pipet, botol, tutup dan kartrid ekstraksi
fase padat.

Kondisi Kromatografi Gas

Volume injeksi sampel 2 μL dan injeksi dilakukan pada temperatur injektor 280 ° C. Gas
pembawa adalah kelas Helium 6.0 (Messer Hunga- rogáz Kft., Budapest, Hongaria) yang
dimasukkan pada laju aliran 1,0 mL min−1. Pemisahan dilakukan pada kolom kapiler Varian
FactorFourTM VF-5MS (panjang: 30 m, diameter dalam: 0,25 mm, ketebalan film: 0,25 μm; CP-
Analitika Kft., Budapest, Hongaria). Suhu oven dijaga pada 100 ° C selama 1 menit, diikuti
dengan ramp pada 40 ° C menit−1 hingga 220 ° C, kemudian pada 10 ° C menit−1 hingga 310 ° C
dan akhirnya dipertahankan konstan selama 5 menit.

Deteksi Selektive Massa

Temperatur jalurTransfer adalah 280 ° C. Ionisasi dampak elektron dilakukan pada energi 70
eV, dan pada suhu sumber ion 230 ° C. Suhu quadrupole adalah 150 ° C. MS dioperasikan
dalam mode single ion monitoring (SIM). Ion yang dipantau ditampilkan pada Tabel I.

Nama dari Tujuan Ion Target Ion Qualifier #1 Ion Qualifier #1

senyawa (m/z) (m/z) (m/z)
Morpin analit 414 577 361
pentafloroproponi
k ester
Kodein analit 282 445
pentafloroproponic
ester
D6- Morpin Standar internal 417 580 364
pentafloroproponi
k ester
D3- Kodein Standar internal 285 448
pentafloroproponic
ester

Akuisisi Data dan Pengolahan

Data diakuisisi oleh Agilent Chemstation Software (Kromát Kft., Buda- pest, Hongaria). Area puncak digunakan untuk
penghitungan. Hasil analitis diproduksi dengan menggunakan BEN Software (program yang dirancang untuk berjalan
di Windows ExcelTM menentukan parameter analitik dari pengukuran GC-MS) [6]. 

Bahan dan Metode

Bahan Kimia

Morfin [100 μg mL−1 dalam metanol], D3-morfin [100 μg mL−1 dalam metha- nol], kodein [100 μg mL
dalam metanol] dan D3-kodein [100 μg mL−1 dalam larutan metanol] diperoleh dari Cerilliant
Company (Austin, TX). Pentafluoropropionic anhydride (PFPA) dibeli dari Sigma Al-drich
Hungary Kft. (Budapest, Hungaria). Serum manusia kosong diperoleh dari Promochem
(Budapest, Hongaria). Semua bahan kimia dan pelarut lainnya diperoleh dari Merck Kft.
(Budapest, Hongaria) dan kelas analitik.

Komposisi Sampel Analisis

Kalibrator disiapkan menggunakan serum kosong dan diambil melalui langkah persiapan yang sama seperti sampel
darah dianalisis. Kosong serum dan sampel darah dibubuhi larutan standar A dan B serta larutan standar internal
pengganti (Tabel II). Konsentrasi morfin dan kodein yang diperoleh dalam analisis standar kimia dianggap 100%
dalam percobaan pemulihan.

Larutan standar A. Larutan Morfin Brilian 100 μL dan Larutan Kodein Cemerlang 100 μL diencerkan menjadi 800 μL
dengan metanol dalam botol silanisasi 2 mL (CP-Analitika Kft., Budapest, Hongaria). Larutan digunakan tidak lebih
dari 1 minggu dan disimpan pada suhu -20 ° C. Larutan standar B. Larutan standar A 100 μL diencerkan menjadi 900
μL dengan metanol dalam botol silanisasi 2 mL (CP-Analitika Kft., Budapest, Hun - gary). Solusinya digunakan dalam
24 jam.

Mengganti solusi standar internal. 100 μL D6-Morphine

Solution dan 100 μL D3-Codeine Solution
diencerkan menjadi 800 μL dengan metanol dalam botol silanisasi 2 mL (CP-Analitika Kft.,
Budapest, Hongaria). Solusinya digunakan tidak lebih dari 1 minggu dan disimpan pada suhu
-20 ° C.

pH = 9 larutan buffer karbonat. Untuk 20 mL 0,2 mol L-1 larutan berair230 mL larutan air0,2 mol
L−1 natrium karbonat,natrium hidrogen karbonatditambahkan. Campuran diencerkan dengan air
suling (kadar LichroSolv® ) hingga 1000 mL.
Tabel III. Komposisi dari kalibrasi, sampel kosong dan serum

ID Matrix Volume dari spikes larutan tandard (µL) Konsentrasi

kodein dan
Morfin (ng
mL-1)

Larutan Larutan Pengganti

tandard B tandard larutan internal
A tandard
(1-1µg mL-1)
(1-1µg (10-10µg mL-1)
mL-1)

Senyawa

Koleksi Darah

Darah dikumpulkan dalam tabung dengan dinding yang sebelumnya dilapisi dengan natrium
fluorida dari sukarelawan sehat yang sebelumnya telah memberikan persetujuan tertulis. Tabung
dikocok perlahan selama 30 detik dan kemudian disimpan pada suhu 5 ° C selama 10 menit.
Selanjutnya disentrifugasi pada 3000 putaran per menit diikuti selama 10 menit. Sentrifugasi
yang digunakan adalah Eppendorf 584 Centrifuge (Eppendorf GmBH, Hamburg, Jerman). 1 mL
supernatan kemudian dipindahkan ke vial silanisasi 2 mL untuk pembersihan dan derivatisasi.

Pembersihan Sampel dan Derivatisasi

Pembersihan sampel dilakukan dengan mengaplikasikan supernatant ke kartrid Solid Phase

extraction (SPE) yang mengandung campuran C 8 dan sorben penukar kation kuat [7].
Pemulihan analit dari SPE dinilai dengan memproses tiga sampel serum kosong yang dibubuhi
kedua senyawa pada konsentrasi setiap 50 ng mL −1. Kolom itu dikondisikan dengan 3 mL
metanol dan 3 mL pH = 9 larutan buffer karbonat. Sampel serum yang sebelumnya dibubuhi
larutan standar pengganti dan dicampur dengan 3 mL larutan buffer karbonat (pH = 9) dibiarkan
menetes dengan kecepatan 1 mL menit−1. Setelah sampel melewati sorbent, yang terakhir dicuci
dengan 3 mL akuades dan dibiarkan mengering selama 35 menit dalam vakum ( −50 mm Hg).
Analit dielusi dengan kecepatan 1 mL menit −1 ke dalam vial silanisasi 2 mL menggunakan 1
mL diklorometana– propanol– larutan amonia (25%) Campuran 80: 20: 2. Proses elusi diulangi
sekali. Fraksi yang dielusi digabungkan dan diuapkan hingga kering pada suhu 36 ° C di bawah
aliran nitrogen, menggunakan Modul Pemanasan Pierce Reacti- Therm ™ (Dr. Wéber
Consulting Kft., Budapest, Hongaria). Residu kering 100 μ L PFPA ditambahkan, dan vial
ditutup dan disimpan pada suhu 60 ° C selama 30 menit. Turunannya diuapkan sampai kering
pada 36 ° C di bawah aliran nitrogen dan disolvasi dengan 30 μL campuran dikloro- metana –
propanol 90:10. Setelah periode ini, larutan dibiarkan menjadi dingin sampai suhu lingkungan
dan diteruskan untuk dianalisis

HASIL DAN DISKUSI

Konsumsi obat-obatan terlarang dan psikotropika merupakan masalah serius dalam masyarakat
modern. Identifikasi secara spesifik dan sensitif dan kuantitas bahan kimia dan metabolitnya
dalam matriks biologis, serta pemanfaatan data analitik untuk verifikasi pengaruh konsumsi obat
secara akut dan kronis pada individu yang terlibat dalam tindak pidana, oleh karena itu hal
tersebut tetap menjadi tantangan penting.

Sejumlah pendekatan telah dibuat untuk verifikasi konsumsi obat-obatan ilegal. Urine adalah
salah satu matriks yang paling banyak dipertimbangkan untuk penyelidikan semacam itu [8-11].
Namun, pengumpulan urin yang terkontrol memerlukan tindakan khusus. Selain itu, analisis urin
tidak selalu memberikan bukti pemasukan tunggal karena membutuhkan waktu, biasanya
beberapa jam, untuk konsentrasi metabolit urin mencapai batas deteksi [9]. Konsentrasi yang
dinilai dipengaruhi oleh asupan cairan, nutrisi, usia, konsumsi obat-obatan dan status kesehatan
sehubungan dengan gangguan peredaran darah dan ginjal, yang meningkatkan risiko
mendapatkan hasil negatif palsu

Deteksi zat terlarang dalam air liur adalah pendekatan non-invasif lainnya. Kendala analisis
saliva dibatasi oleh fakta bahwa kadar analit, dan bahkan ketersediaan volume sampel yang
diperlukan, juga semuanya bergantung pada beberapa faktor fisiologis, asupan nutrisi dan cairan,
sedangkan efek biologis (seperti aktivitas kolinergik) dari zat terlarang yang dikonsumsi juga
dapat menjadi faktor yang signifikan [12]. Identifikasi konsumen kronis atau verifikasi akhir dari
asupan tunggal dimungkinkan menggunakan rambut sebagai matriks [13], tetapi tidak cocok jika
untuk verifikasi awal konsumsi.

Pengumpulan darah dalam jumlah kecil adalah metode pengambilan sampel yang dapat diterima
secara etis dan aman, yang memungkinkan deteksi dini zat terlarang. Serum adalah matriks yang
lebih disukai untuk tujuan analitis dibandingkan dengan urin karena jumlah dan jumlah
komponen yang mengganggu lebih kecil. Metode canggih untuk pengambilan sampel darah
dengan ketidak nyamanan minimal yang individu sampel tersedia secara luas. Akibatnya,
pengambilan sampel darah telah banyak digunakan untuk evaluasi konsumsi obat di masa lalu
[14-16]. Sebagai langkah pertama, pengukuran awal dilakukan untuk memverifikasi bahwa GC-
MS adalah teknik analisis yang sesuai untuk tujuan kami. Kesulitan diperkirakan akan muncul
karena sejumlah alasan. Konsentrasi analit dalam sampel diharapkan lebih kecil dari batas bawah
kisaran terapeutik (2 ng mL −1), yang menyoroti pentingnya upaya yang bertujuan untuk
meningkatkan kepekaan deteksi. Validasi metode analitik juga menimbulkan persyaratan
tertentu. Standar deviasi relatif dari parameter retensi senyawa target dan standar internal
diharuskan tidak melebihi 2% deviasi standar relatif, sementara faktor tailing dari puncak
kromatografi analit target dan standar internal diharuskan untuk tidak melebihi 5%.

Identitas dan kemurnian puncak yang muncul dalam kromatogram ion diverifikasi dengan
mencocokkan waktu retensi, bentuk puncak dan rasio ion target dan kualifikasi ( Tabel III)
dengan puncak standar [17–19]. Dengan pendekatan ini, deteksi analit dan standar internal
spesifik setelah pemisahan kromatografi ( Gambar 1). Evaluasi data analitik yang diperoleh dari
serum blank run menunjukkan bahwa tidak ada puncak ion yang mengganggu yang pernah ada
dalam matriks. Untuk lebih mengurangi risiko (atau bahaya) kesalahan identifikasi yang
disebabkan oleh interferensi yang terjadi pada waktu retensi puncak analit, jendela puncak
referensi waktu sempit (± 0,5%) ditetapkan [20] ( Gambar 2–3).

PFPA memungkinkan derivatisasi bahan kimia yang diminati secara sederhana, cepat, dan
lengkap. The adducts sangat berfluorinasi, dengan deteksi yang sangat sensitif menggunakan MS
dalam mode ionisasi kimia negatif [14.]. Spektrum massa ionisasi elektron dari turunannya
murni dengan ion molekuler intensif hadir dalam kasus semua senyawa yang dipantau.

Rentang dinamis linier diidentifikasi sebagai 1 hingga 100 ng mL −1 untuk kedua senyawa.
Batas kuantitasi adalah 0,87 ng mL −1 untuk morfin dan 0,9 ng mL −1 untuk kodein. Koefisien
determinasi ( r2) kurva kalibrasi lebih tinggi dari 0,9990 di semua kasus. Pemulihan ditemukan
75% sampai 80% untuk morfin dan 80% sampai 85% untuk kodein. Pemulihan standar internal
tidak berbeda secara signifikan ( p = 0,05) dari analit.

Memasukkan analog deuterasi dari analit ke sampel sebagai standar internal sebelum preparasi
sampel menghilangkan semua kesulitan yang timbul dari keragaman komponen matriks dan
hilangnya analit selama proses ekstraksi [21-23]. Perbedaan minimal antara massa molar
molekul analit dan bahan kimia standar internal, bersama dengan kemiripan yang luar biasa
dalam sifat fisik dan kimia, menghasilkan retensi analit yang hampir identik dan analisis
deuterasinya pada kolom kromatografi. Oleh karena itu, kemungkinan munculnya puncak yang
mengganggu dikurangi, sama seperti ketidakakuratan apa pun yang akan terjadi secara tak
terelakkan selama persiapan sampel. Menggunakan serum kosong sebagai matriks kalibrator
memungkinkan untuk menghilangkan kesalahan analitik yang timbul dari reaksi kimia yang
merugikan antara analit dan molekul yang biasanya ada dalam darah manusia. Penggunaan
standar internal pengganti juga mendorong penghitungan konsentrasi analit satu langkah dengan
menempatkan rasio puncak ion target analit dan standar internal ke dalam persamaan yang
diperoleh selama kalibrasi. Perhitungan batas deteksi, identifikasi dan penghitungan didasarkan
pada konsentrasi rata-rata yang diperoleh selama studi perbandingan intra-assay dan antar-assay
( Tabel IV). Studi ini dilakukan seperti yang didefinisikan oleh Standar Industri Jerman DIN
32645 [17] dengan tujuan untuk memperkirakan kelayakan prosedur analitis. Analisis dilakukan
pada kalibrator konsentrasi terendah ( Tabel V dan VI).