1. Pindahkan cryovial dari nitrogen cair ke water bath 37°C.

2. Thawing dalam water bath 37° C dengan konstan, agitasi dalam waktu 40-60
detik. Water bath harus memiliki air bersih yang mengandung antimikroba.
Ketika es pada cryovial hampir habis, keluarkan dari pemandian air. keringkan
dan usap dengan alkohol 70% sebelum dibuka penutupnya, untuk mencegah
kontaminasi.
3. Buka cryovial dan pindahkan suspensi sel ke dalam tabung centrifuge 15 ml
steril yang berisi 8 ml media kultur sel yang telah dihangatkan.
4. Resuspensi sel dengan hati-hati.
5. Sentrifugasi pada 200xg selama 3 menit dan keluarkan supermatan.
Resuspensi sel dengan hati-hati dalam 5 ml media kultur sel dan pindahkan ke
dalam cell culture flask T-25 (25 cm2). (Langkah sentrifugasi dapat
dihilangkan, tetapi dalam hal ini sisa-sisa media pembekuan harus dihilanglan
setelah 24 jam).
6. Amati sel setelah 24 jam kemudian; sel-sel seharusnya melekat pada bagian
bawah cell culture flask T-25.
7. Sekitar 70% sel siap untuk disubkultur pada kepadatan 5x10 3 hingga 1x104
sel/cm2.