Reaksi Rantai Polimerase

Meskipun perpustakaan sangat efektif dan umum digunakan untuk mengkloning dan
mengidentifikasi gen yang diminati, yaitu polymerase chain reaction (PCR) jauh lebih banyak
pendekatan cepat untuk kloning daripada membangun dan menyaring Perpustakaan. PCR sering
kali merupakan teknik pilihan saat gen kloning tetapi juga memiliki banyak aplikasi lain.
Dikembangkan pada pertengahan 1980-an oleh Kary Mullis, PCR ternyata merupakan teknik
revolusioner yang dimilikinya berdampak pada banyak bidang biologi molekuler. Di 1993,
Mullis memenangkan Hadiah Nobel Kimia untuk karyanya penemuan. PCR adalah teknik untuk
membuat salinan atau memperkuat urutan DNA tertentu dalam waktu singkat waktu. Konsep di
balik reaksi PCR sangat sederhana. DNA target yang akan diamplifikasi ditambahkan ke sebuah
tabung berdinding tipis dan dicampur dengan deoksiribonukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
buffer, dan DNA polimerase. Satu set primer berpasangan ditambahkan ke campuran. Primer
adalah oligonukleotida DNA untai tunggal pendek yang biasanya memiliki panjang sekitar 20
hingga 30 nukleotida. Primer ini melengkapi nukleotida mengapit ujung-ujung DNA target yang
akan diamplifikasi.
Tabung reaksi kemudian ditempatkan di sebuah sepeda termal. Dalam arti yang paling
sederhana, pendaur ulang termal adalah blok pemanas canggih yang mampu berubah dengan
cepat suhu dalam interval waktu yang sangat singkat. Pengendara sepeda termal mengambil
sampel melalui serangkaian reaksi disebut siklus PCR (Gambar 3.6). Setiap siklus terdiri dari
tiga tahap. Pada tahap pertama, disebut denaturasi, yaitu tabung reaksi dipanaskan sampai kira-
kira 94 ° C sampai 96 ° C, menyebabkan pemisahan DNA target menjadi tunggal untaian. Pada
tahap kedua, disebut hibridisasi (atau anil), tabung kemudian didinginkan sedikit di antaranya
55 ° C dan 65 ° C, yang memungkinkan primer menjadi hydrogen ikatan ke basa komplementer
di ujung berlawanan dari urutan target. Selama perpanjangan (atau perpanjangan), tahap terakhir
dari siklus PCR, suhu biasanya dinaikkan sedikit (menjadi sekitar 70 ° C hingga 75 ° C), dan
DNA polimerase menyalin DNA target dengan mengikat ke 3 'ujung setiap primer dan
menggunakan primer sebagai template. DNA polimerase menambahkan nukleotida ke 3 'ujung
setiap primer untuk mensintesis pelengkap untai.
Di akhir satu siklus lengkap, jumlah DNA target telah digandakan. Pengendara sepeda
termal mengulangi ketiga tahap ini lagi sesuai dengan totalnya jumlah siklus yang ditentukan
oleh peneliti, biasanya 20 atau 30 siklus. Keuntungan terbesar dari PCR adalah miliknya
kemampuan untuk memperkuat jutaan salinan DNA target dari sejumlah kecil bahan awal dalam
waktu singkat periode waktu. Karena DNA targetnya berlipat ganda setelah setiap putaran PCR,
setelah 20 siklus PCR, sekitar 1 juta salinan (220) DNA target dihasilkan dari reaksi yang
dimulai dengan satu molekul dari DNA target.
Salah satu kunci PCR adalah jenis DNA polymerase digunakan dalam reaksi. Pemanasan
dan pendinginan berulang yang diperlukan untuk PCR akan mengubah sifat dan menghancurkan
sebagian besar DNA polimerase hanya setelah beberapa siklus. Beberapa sumber polimerase
DNA yang sesuai dengan PCR tersedia. Salah satu enzim pertama dan terpopuler untuk PCR
dikenal sebagai Taq DNA polymerase. Taq diisolasi dari domain Archaea yang disebut Thermus
aquaticus, spesies yang tumbuh subur di mata air panas. Karena T. aquaticus beradaptasi hidup
di air panas (pertama kali ditemukan di mata air panas Yellowstone National Park), ia telah
mengembangkan DNA polimerase yang bisa tahan suhu tinggi. Karena Taq stabil di suhu tinggi,
dapat menahan suhu perubahan yang diperlukan untuk PCR tanpa didenaturasi. Polimerase
termostabil seperti Taq sangat penting untuk PCR.
Ada banyak variasi dan aplikasi berbeda dalam teknologi PCR. Misalnya, waktu nyata
atau PCR kuantitatif (qPCR), menggunakan termal khusus pengendara sepeda yang
memungkinkan peneliti mengukur reaksi amplifikasi saat terjadi. Kami akan membahas qPCR
nanti di bab ini. Tutorial bagus tentang PCR bisa jadi dilihat di situs web Pusat Pembelajaran
DNA Cold Spring Harbor yang tercantum di Situs Web Companion.
PCR memiliki aplikasi luas dalam penelitian dan kedokteran, seperti membuat probe
DNA, mempelajari gen ekspresi, memperkuat sejumlah kecil DNA menjadi mendeteksi patogen
virus dan infeksi bakteri, memperkuat DNA untuk mendiagnosis kondisi genetik, mendeteksi
melacak jumlah DNA dari jaringan di TKP, dan bahkan memperkuat DNA purba dari jaringan
dinosaurus yang membatu (Gambar 3.7). Banyak aplikasi PCR dijelaskan di seluruh buku.

Mengkloning produk PCR

PCR sering digunakan sebagai pengganti skrining perpustakaan pendekatan untuk
mengkloning gen karena cepat dan efektif (Gambar 3.8). Kerugian dari kloning PCR adalah,
untuk mendesain primer, Anda perlu tahu sesuatu tentang urutan DNA yang mengapit file gen
yang menarik. Kloning dengan PCR paling mudah jika gen telah diklon pada spesies lain —
untuk Misalnya, menggunakan primer untuk gen yang dikloning sebelumnya dari tikus untuk
mengkloning gen yang setara dari manusia.
Ada banyak cara untuk mengkloning gen menggunakan PCR. Salah satu pendekatan
modern untuk kloning PCR memanfaatkan dari kekhasan yang menarik dari polimerase
termostabil. Sebagai DNA disalin, Taq dan polimerase lain digunakan untuk PCR biasanya
menambahkan satu adenin nukleotida ke 3 ' akhir dari semua produk PCR (Gambar 3.8). Setelah
memperkuat gen target, produk PCR kloning dapat diikat plasmid disebut vektor T. Vektor T
mengandung nukleotida timin bermerek tunggal di setiap ujung yang dapat melengkapi pasangan
basa dengan adenin yang menjorok. nukleotida dalam produk PCR. Setelah diikat menjadi vektor
T, plasmid rekombinan yang mengandung hasil cloning Produk PCR dapat masuk ke dalam
bakteri dan bakteri nya urutan nukleotida dapat ditentukan.
Sekarang, setelah Anda mempelajari beberapa strategi paling umum yang digunakan
untuk mengkloning gen, di bagian selanjutnya kami akan mempertimbangkan berbagai macam
pendekatan yang berbeda yang digunakan para ilmuwan untuk mempelajari gen kloning.
 Mengapa mengkloning DNA? Apa yang dapat Anda lakukan dengan cloning gen? Ada
banyak aplikasi kloning gen dan teknologi DNA rekombinan. Gambar 3.9 merangkum
penerapan kloning gen yang umum, banyak di antaranya dibahas lebih lanjut di bab lain. Di
bagian ini, kami menyajikan beberapa rutinitas penting dasar dan teknik laboratorium biologi
molekuler aplikasi kloning gen.
Elektroforesis gel agarosa adalah salah satu yang paling banyak teknik laboratorium
umum yang digunakan dalam bekerja dengan DNA karena memungkinkan seseorang untuk
memisahkan dan memvisualisasikan Fragmen DNA berdasarkan ukurannya (Gambar 3.10
tentang halaman selanjutnya). Agarose adalah bahan yang diisolasi dari rumput laut, dilelehkan
dalam larutan penyangga, dan dituangkan ke dalam nampan plastik. Saat agarosa mendingin, ia
mengeras menjadi bentuk gel setengah padat horizontal yang berisi lubang kecil atau pori-pori
yang akan dilalui fragmen DNA. Itu persentase agarosa yang digunakan untuk membuat gel
menentukan kemampuannya untuk menyelesaikan fragmen DNA yang berbeda ukuran.
Kebanyakan aplikasi umumnya melibatkan gel itu mengandung 0,5% sampai 2% agarosa. Gel
dengan persentase agarosa yang tinggi (katakanlah 2%) lebih cocok untuk memisahkan fragmen
DNA kecil karena akan mengular. melewati pori-pori lebih mudah daripada yang besar fragmen,
yang tidak terpisah melalui padat gel dengan sangat baik. Persentase agarosa yang lebih rendah
lebih baik cocok untuk memecahkan fragmen DNA yang besar.