Andrographolide

Andrographolide, merupakan senyawa yang masuk dalam grup

trihidroksilakton yang memiliki rumus molekul C20H30O5. Andrographolide,
merupakan komponen utama daun sambiloto yang dapat mudah larut dalam
methanol, ethanol, pyridine, asam asetat, dan aceton, tetapi sedikit larut dalam eter
dan air. Sifat fisika dari andrographolide yaitu memiliki ttik leleh 228 – 230 ℃,
spektrum ultraviolet dalam etanol λ maksimal 223 nm (Kumoro, 2007).
Andrographolide berupa kristal berbentuk jarum tak berwarna, mempunyai rasa yang
sangat pahit, sukar larut dalam air. Kelarutannya dalam air pada suhu 25 ℃ sebesar
60 mg/L. (Rosindah dkk, 2014)

Andrografolid mengandung tiga gugus hidroksil, yaitu pada C-19 (alcohol

primer), C-3 (alcohol sekunder), dan C-14 (alcohol alilik) serta memiliki ikatan
rangkap eksosiklik dan cincin lakton (Devender et al., 2015)

O
14
HO O

CH3
CH2

3
HO H
HO CH3
19

Gambar Struktur Andrografolid (Preet et al., 2014)

Property Name Property Value

Molecular Weight 350.4 g/mol
XLogP3-AA 2.2
 Hydrogen Bond Donor Count 3
Hydrogen Bond Acceptor Count 5
Rotatable Bond Count 3
Exact Mass 350.209324 g/mol
Monoisotopic Mass 350.209324 g/mol
Topological Polar Surface Area 87 Ǻ2
Heavy Atom Count 25
Formal Charge 0
Complexity 597
Isotope Atom Count 0
Defined Atom Stereocenter Count 6
Undefined Atom Stereocenter Count 0
Defined Bond Stereocenter Count 1
Undefined Bond Stereocenter Count 0
Covalently Bonded Unit Count 1
Compound Is Canonicalized Yes

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim
Assalamualaikum Warahmatullah Wabarakatuh

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT, sehingga penulis dapat menyelesaikan
makalah ini. Sholawat serta salam kepada junjungan Nabi akhir zaman Muhammad
SAW beserta sahabat serta orang yang berjuang dalam menegakkan risalah beliau.
Atas rahmat, hidayah dan izin Allah SWT penulis dapat menyelesaikan makalah yang
berjudul “Reverse Phase - High Performance Liquid Cromatography (RP-HPLC)”

Alhamdulillah makalah ini dapat terselesaikan dengan baik berkat bantuan

dari pihak lain juga. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih yang
sebesarbesarnya kepada Bapak Dr. Sandra Hermanto, M.Si selaku pengampu mata
kuliah Metabolisme atas saran dan bimbingannya.

Penulis berharap semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi para pembaca,
dan penulis berharap adanya masukan berupa kritik dan saran yang membangun,
karena penulis sadari bahwa makalah ini masih belum sempurna.

Jakarta, 14 Desember 2020

Penulis

DISKUSI KELAS

1. (Penanya : Sakila dari kelompok 5) Mengapa pada jurnal HPLC yang

digunakan yaitu tipe fasa balik?
Jawab (Nahdah Asrinovindah dari kelompok 1) :
 Digunakan RP-HPLC karena pelarut yang digunakan pada penelitian
ini bersifat polar dan senyawa andrografolid bersifat semi polar, dimana hal
ini sesuai dengan prinsip penggunaan RP-HPLC sendiri adalah fase diamnya
non-polar, fase gerak relative lebih polar karena senyawa-senyawa polar akan
terelusi lebih awal dan peningkatan kepolaran fase gerak akan memperbesar
waktu elusi. Sehingga di penelitian ini senyawa andrografolid yang akan
diikat oleh fase diam dan akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan
bergerak lambat dalam kolom, dan berarti bahwa pelarut asetonitril yg bersifat
polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.
Disamping itu, di dalam jurnal disebutkan tujuan penggunaan RP-
HPLC sendiri untuk memvalidasi ketepatan metode RP-HPLC dalam
pemisahan senyawa andrografolid pada ekstrak tanaman sambiloto dan
binahong.

2. (Penanya : Safira Asyarisyah Putri dari kelompok 2) Apa saja hal yang
perlu diperhatikan dalam pemisahan RP-HPLC agar diperoleh hasil yang
optimal?
Jawab (Siska Nurul Fadhilah dari kelompok 1) :
Untuk memperoleh hasil yang optimal dalam penggunaan metode RP-
HPLC ini harus di perhatikan yaitu
a. Dalam pemilihan pelarut. Metode RP-HPLC merupakan teknik
pemisahan senyawa dimana fase gerak yang digunakan lebih
polar dari pada fase diam. Maka untuk memperoleh hasil yang
optimal Fase gerak atau larutan yang digunakan harus bersifat
polar yaitu seperti etanol, metanol, asetonitril. Peningkatan
kepolaran fase gerak akan memperbesar waktu elusi.
b. Pemilihan elusi yang digunakan yaitu elusi gradien, karena
dapat mempercepat waktu retensi
c. Pemilihan kolom, berdasarkan fase gerak yang digunakan
 d. Laju alir, karena kalau semakin dipercepat akan menghasilkan
overlaping sehingga tidak memperoleh hasil yang optimal
e. Panjang gelombang

3. (Penanya : Anis Pradiati dari kelompok 6) Mengapa asetonitril digunakan

sebagai fase gerak? Adakah alasan dalam penggunaan fase gerak tersebut?
Jawab (Krisdina Nada Nuraeni dari kelompok 1) :
Asetonitril digunakan sebagai fase gerak karena, asetonitril merupakan
senyawa polar. Asetonitril memiliki gugus nitril dan gugus CN yang
mengandung ikatan rangkap 3 dan bersifat menarik elektron. Berdasarkan
harga momen dipolnya, asetonitril mempunyai harga momen dipol sebesar
3,196 debye. Dan berdasarkan tetapan dielektrik yg dimiliki asetonitril yaitu
sebesar 38,8. Berdasarkan hal ini, asetonitril tergolong senyawa polar tinggi
bila dibandingkan dengan etanol dan metanol.

4. (Penanya : Sari Nofita dari kelompok 4) Pada aplikasi RP-HPLC fase gerak
diawali dengan elusi secara gradien yang dilanjutkan dengan elusi isokratik,
apakah bisa digunakan elusi isokratik terlebih dahulu?
Jawab ( Aditya Imam Saputra dari kelompok 1) :
Tidak dapat dilakukan karena akan mempengaruhi hasil nilai dari
waktu retensi nya akan semakin lama, nilai dari faktor tailing dan juga pelat
teoritis yg akan tidak sesuai atau dibawah standar maksimal nya, dan juga
mempengaruhi dari grafik regresi linear yg dihasilkan nya pada nilai r 2 nya
dan juga nilai slope nya

5. (Penanya : Rafida Aisyah fitri dari kelompok 3) Apakah pada penelitian ini
bisa mengguanakan kolom jenis lain?
Jawab (Prasetyo Alfaridzi Kuncoroyekti dari kelompok 1 ) :
 Pada penelitian ini digunakan kolom C18 karena senyawa
andrografolid ini merupakan senyawa duterpenoid lakton digunakan kolom
non polar C18 supaya terdapat interaksi antara senyawa andrografolid yg
lebih non polar dari fasa gerak dengan kolom dan senyawa tersebut tertahan
lebih lama di kolom sehingga dapat dideteksi. Mengapa tidak digunakan
kolom C8? Mungkin karena bila digunakan kolom C8 maka senyawa akan
terelusi lebih cepat dan dikhawatirkan pemisahannya kurang baik, karena
kolom C18 cenderung lebih lama menahan senyawa dari pada C8.
Mengapa tidak digunakn kolom polar? Karena dikhawatirkan senyawa
hidrokarbon dari ekstrak sampel tidak tertahan sehingga tidak dapat dideteksi.
mengapa tidak digunakan kolom penukar ion baik sax scx wax atau wcx
karena senyawa yg dipisahkan tidak memiliki ion yang dapat ditukar oleh
resin-resin pada kolom-kolom tersebut.

BAB I

PENDAHULUAN
Latar Belakang

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan menggunakan

fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya
sempit (kolom) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali
dengan memakai tekanan tinggi, sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi
tinggi dan waktu yang relative singkat (Hermanto, 2009).

HPLC fase terbalik atau RP-HPLC merupakan kebalikan dari HPLC fase
normal. Dimana fase diam yang digunakan bersifat non-polar dan fase geraknya
bersifat polar. Dalam hal ini pemisahan terjadi karena komponen sampel yang
bersifat kurang polar akan melewati kolom lebih lama dibandingkan sampel yang
bersifat lebih polar.

Aplikasi RP-HPLC salah satunya dalam penentuan kadar andrografolid dalam

tanaman sambiloto secara kuantitatif menggunakan metode RP-HPLC. Pemisahan
dilakukan pada kolom Sunfire C18 (150 × 4.6 mm, 5µm). Fase gerak yang
digunakan, yaitu asetonitril sebagai %A dan campuran 0.1% asam
trifloroasetat:methanol = 90 : 10 sebagai %B. Fase gerak dielusi secara gradien
dengan komposisi %A sebesar 10% dan %B sebesar 90% hingga menit ke 5
kemudian elusi menjadi isokratik dengan komposisi %A sebesar 30% dan %B
sebesar 70% hingga waktu akhir elusi. Volume injeksi contoh 20 µL dengan laju alir
fase gerak 1 mL/menit dan deteksi menggunakan detektor PDA (Photodiode Array)
pada panjang gelombang 230 nm.

Rumusan Masalah

1. Bagaimana prinsip HPLC?

2. Reverse Phase apakah yang digunakan dalam HPLC?
 3. Apa saja instrument HPLC?
4. Bagaimanakah aplikasi RP-HPLC?

Tujuan

1. Mengetahui prinsip HPLC

2. Mengetahui Reverse Phase yang digunakan
3. Mengetahui instrumentasi dari HPLC
4. Mempelajari aplikasi dari RP-HPLC

Domistik
Limbah Cair Rumah Sakit

Klinis
Proses Pengolahan
Bak Penampung Biologis

Lain-Lain
Disinfeksi