Metode Penelitian

Preparation of aqueous two-phase systems

Dua langkah ekstraksi yang berurutan dan gabungan menggunakan file ATPS.
Semua ATPS dihomogenisasi secara vertikal selama 15 menit pada 15 rpm dan
selanjutnya disentrifugasi selama 5 menit pada 1000 rpm, untuk menyelesaikan
kesetimbangan pemisahan fasa dengan suhu konstan (22 ± 1 ◦ C). Terakhir, fase atas
dan bawah setiap sistem dipisahkan. Xilanolitik dan aktivitas enzimatik selulolitik,
adanya pigmen, mereduksi gula dan kandungan protein terlarut ditentukan pada setiap
fase sebagai dijelaskan di atas. Koefisien partisi didefinisikan sebagai

Kp = [P] T / [P] B,

Enzyme assay and analytical determinations

Aktivitas xilanolitik dan selulolitik ditentukan dengan larutan beech xilan

(1%) dan karboksimetilselulosa (1%). Campuran reaksi yang mengandung 10-200 µL
ekstrak enzim dan 1 mL substrat yang sesuai dicampur dalam 250 µL dari 50 mM
sitrat, penyangga pH 5,30 dan diinkubasi pada 50 ℃ selama 10 menit. Kemudian 1
mL reagen DNS ditambahkan ke setiap tabung dan sampel dipanaskan selama 10
menit. Gula pereduksi yang dihasilkan ditentukan oleh metode DNS (Miller,
1959). Absorbansi diukur pada Panjang gelombang 560 nm (Taddia dkk, 2019). D-
glukosa digunakan sebagai standar, sampel dihitung dengan kurva kalibrasi yang
sesuai. Kandungan protein ekstraseluler total diukur menggunakan metode bicin-
choninic acid (Sigma Aldrich, USA) dimana serum sapi albumin digunakan sebagai
protein standar. Absorbansi diukur pada 562 nm (Walker, 2009).

Ion exchange chromatography analysis

Percobaan kromatografi pertukaran ion dilakukan dengan menggunakan

sistem Äkta prime plus (GE Healthcare, Uppsala, Swedia). Sebuah sampel dari 0,1
mL fase atas yang kaya akan PEG1450 dari sistem gabungan (UCON / Sitrat-
PEG1450 / Sitrat) dianalisis menggunakan kolom Q-sepharose XL (HiTrap 17-6002-
33, 1 mL; GE Healthcare, Uppsala, Swedia). Kolom tersebut diimbangi dengan 5
volume kolom sebesar yang berisi 20 mM Buffer Tris pH 8.0 (Buffer A) dan dielusi
dengan 20 mM buffer Tris pH 8.0 dengan 1 M NaCl (Buffer B). Semua buffer
disaring melalui filter milipore ukuran 0.22- μm. Percobaan dilakukan di suhu kamar,
menggunakan laju aliran sama dengan 1 mL / menit dalam 100 μL loop
injeksi. Absorbansi dipantau pada 280 nm. Fraksi dikumpulkan sebanyak 1mL. dan
konduktivitasnya juga dipantau.

Purification parameters

Persentase aktivitas enzimatik (R) dan faktor pemurnian (PF) dievaluasi pada setiap
tahap. Indikator ini dihitung menurut persamaan berikut:
Total activity ∈the purification stage
Recovery (%) = x 100
Total activity∈initial extract

Specific activity ∈the purification stage

PF = x 100
Specific activity∈initial extract

Mass spectrometry
Fase atas dan bawah dari ekstraksi gabungan oleh ATPS dan elusi yang
diperoleh dari kromatografi pertukaran ion dianalisis dengan menggunakan
spektrometri massa. Untuk mendapatkan elektroforesis tunggal pita yang berisi
semua protein dan larutan enzimatik, dioperasikan Gel elektroforesis SDS-PAGE
hingga 1 cm setelah memasukkan resolusi gel, dilakukan pengamatan dengan
Coomassie brilian Blue.  Kromatografi fase terbalik dilakukan dengan kolom EASY-
Spray Accucore (C18, 50 m × 150 mm, 2 μ partikel m, 100 Å pori ukuran, Thermo
Scientific) beroperasi pada 300 nL / menit pada 35 ℃.