ARTIKEL ASLI

PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE RP-HPLC

UNTUK ANALISIS METFORMIN
M. SAEED ARAYNE, NAJMA SULTANA* DAN M. HASHIM ZUBERI
Departemen Kimia, Universitas Karachi, Karachi-75270, Pakistan
Lembaga Penelitian Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi,
Universitas Karachi, Karachi-75270, Pakistan

ABSTRAK
Metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik (RP-HPLC) telah dikembangkan untuk mengukur
metformin hidroklorida (MfCl) dalam bahan baku dan formulasi farmasi menggunakan C18 kolom analitik fase
terbalik. Diazepam digunakan sebagai standar internal. Fase gerak terdiri dari metanol-air (30:70 v/v), dipompa
pada laju aliran 0,5 ml/menit pada suhu sekitar dan waktu retensi sekitar 4,4 menit dengan puncak simetris.
(MfCl) dideteksi dengan absorbansi ultraviolet pada 233 nm tanpa gangguan eksipien yang umum digunakan.
Metode ini linier pada rentang konsentrasi 0,312–5 g/mL (R2 = 0,9995). Batas deteksi metformin adalah 0,1 g/
mL dan batas kuantitasi adalah 0,3 g/mL. Hasil yang diperoleh menunjukkan kesepakatan yang baik dengan
isi yang dinyatakan dalam hal formulasi farmasi. Metode yang diusulkan cepat, akurat, ekonomis dan selektif
dan dapat digunakan untuk analisis kuantitatif metformin dalam tablet Neodipar
karena sensitivitas dan reproduktifitasnya.

Kata kunci: RP-HPLC; metformin; tablet neodipar.

PENGANTAR dkk., 2001), elektroforesis kapiler (El-Khateeb dkk.,

Metformin, N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamida
hidroklorida (gbr. 1) adalah turunan biguanida, diketahui
memiliki aktivitas antihiperglikemik karena biasanya tidak
menyebabkan hipoglikemia. Ini menurunkan kadar glukosa
darah pada pasien NIDDM dengan menekan output glukosa
hati dan meningkatkan ambilan glukosa perifer dan
sensitivitas insulin. Mekanisme aksi melibatkan pengikatan
rantai samping hidrokarbon biguanida a-polar ke membran
fosfolipid, membangkitkan perubahan potensial permukaan
elektrostatik (Hermann, 1979). Selanjutnya, berbagai efek
metabolik ditimbulkan, tergantung pada sel target, jaringan,
organ, spesies (Bailey, 1985) dan regulasi metabolisme
(Hermann, 1981).
1988; Lagudkk., 1998), spektrometri NMR (El-Khateeb dkk.,
1988), fluorimetri (Hassan dkk., 1999), spektrofotometer UV-
tampak (Hassan dkk., 1999; Ashourdkk., 2003; El-Bardicy
dkk., 1989), potensiometri (Hassan dkk.,
1999), sensor membran PVC (Calatayud dkk., 1985; Rizki
1995), konduktometri (Calatayud dkk., 1985; Abudandkk.,
2001), voltametri (Liu dkk., 2001) oleh RP-HPLC dalam
bentuk sediaan multi komponen (Vasudevan dkk., 2001;
Schaffer, 1983) dalam bentuk sediaan gabungan (Koltedkk.,
2004; Khanolkardkk., 1999; Koltedkk., 2004) dalam serum
manusia (Zarghi dkk., 2003; Yuendkk., 2002; Yuendkk.,
1998; klipdkk., 1990; Tachedkk., 2001). Semua metode ini
memakan waktu, mahal, kompleks di alam dan merusak
rentan kolom. Dalam metode ini fase gerak yang
digunakan sebagian besar mahal dan berbahaya untuk
kesehatan dan efisiensi kolom (pelat teoritis). Akibatnya,
metode yang dikembangkan saat ini sederhana, efisien
dan ekonomis untuk penentuan metformin dalam obat
referensi dan dalam formulasi dosis.

EKSPERIMENTAL

Gambar 1. Struktur Metfomrin N,N-dimethylimidodi-
carbonimidic diamide hidroklorida.
Beberapa metode telah dilaporkan untuk penentuan
metformin dengan kromatografi gas (Tache dkk., 2001; Lin
Peralatan
Sistem kromatografi cair terdiri dari pompa gradien
Shimadzu LC-10AT VP, model Shimadzu SPD-10ADT VP
variabel panjang gelombang detektor UV-tampak (Shimadzu
Corporation, Kyoto, Jepang). Sistem kromatografi
terintegrasi melalui model Shimadzu CBM-102

Penulis yang sesuai: Telp.: +92-21-4610132; email: arayne@gawab.com

Pak. J. Farmasi. Sci., 2006, Vol.19(3), 231-235 231

Pengembangan dan validasi metode RP-HPLC

modul bus komunikasi. Analisis dilakukan pada HASIL DAN DISKUSI

OD-5-100, C18 -kolom bondapack (0,4 x 25cm) dengan 0,5
μm ukuran partikel pada suhu lingkungan. Sampel diperkenalkan Dalam penyelidikan ini, hasil optimal dicapai dengan
dalam sistem kromatografi yang dijelaskan dengan cara: menggunakan spesifikasi kolom dan sistem pelarut yang
katup injektor Rheodyne dengan 20 μL sampel lingkaran. dijelaskan. Diazepam tidak mengganggu analisis kami dan
digunakan sebagai standar internal. Di bawah kondisi
eksperimental yang sama, durasi pemisahan lebih pendek
Parameter Kondisi
dan simetri puncak yang diamati lebih baik. Waktu retensi
metode Kromatografi cair kinerja tinggi fase optimal (metformin = 4,4 menit dan diazepam = 6,1 menit)
terbalik tercapai.
Seluler Elusi gradien air-metanol (70:30)
tahap Prosedur pengujian dan validasi
Kolom OD-5-100, C18 -kolom bondapack (0,4 x 25cm) Fase gerak terdiri dari metanol: air (30:70 v/v) yang diberikan
dengan 0,5 μm ukuran partikel secara gradien pada 0,5 ml/menit, memiliki waktu retensi
4,4 menit dengan nilai standar deviasi relatif yang tidak
Laju aliran 0,5 ml/menit
signifikan (n = 80). Untuk mendapatkan waktu retensi
Deteksi Detektor UV, 233 nm optimum, komposisi fase gerak divariasikan dan hasil
200 – 800 nm untuk pengujian terbaik dicapai pada komposisi yang disebutkan di atas.
Sebuah kromatogram representatif yang menunjukkan
Kolom kemurnian puncak Suhu sekitar
pemisahan metformin dan standar internal diberikan pada
suhu
gambar 2. Hasil yang diberikan pada tabel 1 menunjukkan
Injeksi 20μl untuk pengujian dan kompatibilitas bahwa ketepatan metode ini dapat diterima. Untuk penilaian
Volume Sampel 50 μl untuk pembubaran presisi antar-hari dan intra-hari, set lengkap standar
referensi metformin dalam fase gerak disuntikkan (n = 80)
pada 4 waktu berbeda selama periode 12 jam selama empat
Bahan: hari.
Semua bahan kimia yang digunakan dalam metode ini adalah
HPLC grade dari Merck. Standar referensi metformin adalah
Akurasi dan presisi
hadiah dari Merck Marker Pakistan Ltd. dan Neodipar® tablet
Akurasi dan presisi dihitung untuk sampel QC selama intra-
(500mg) dibeli dari pasar yang diproduksi oleh Sanophy Aventis.
dan antar-hari berjalan diberikan dalam tabel 1. Akurasi
intra-hari (hari 1) berkisar dari -3,86% sampai 0,01%. Hasil
yang diperoleh dari presisi menengah (inter-day) juga
Persiapan larutan stok menunjukkan presisi metode yang baik. Semua data berada
Sampel dari berbagai konsentrasi referensi metformin disiapkan
dalam kriteria penerimaan.
dari larutan stok yang disiapkan dengan menimbang akurat
sekitar 10 mg metformin dan dipindahkan ke labu ukur 100 ml,
Kesesuaian sistem
kemudian ditambahkan metanol/air (50:50 v/v) sebagai
Kesesuaian sistem dinilai dengan lima ulangan
pengencer, sampel dilarutkan sepenuhnya dengan mengocok
analisis obat pada konsentrasi 5 g/ml. Koefisien
pada penangas ultrasonik, volume dibuat sampai tanda dengan
persen variasi (%CV) dari area puncak dan waktu
pengencer, dicampur dengan baik, disaring dan diencerkan
retensi untuk obat dan standar internal berada dalam
secara serial untuk membuat konsentrasi 5, 2,5, 1,25, 0,625 dan
± 2% yang menunjukkan kesesuaian sistem (tabel
0,312 g/ml. Ini kemudian disaring melalui filter membran 0,45
2).
mikron.

Batas deteksi dan kuantitasi

Dua puluh tablet Neodipar (masing-masing mengandung 500 mg
Jumlah analit terendah dalam sampel yang dapat dideteksi
aktif) ditimbang secara akurat dan dibubuk halus. Jumlah yang
tetapi tidak perlu diukur atau LOD dinyatakan sebagai
setara dengan 10 mg metformin dilarutkan dalam rendaman
konsentrasi yang memberikan rasio sinyal terhadap noise
ultrasonik selama 20 menit dan diencerkan hingga 100 ml dengan
2:1 atau 3:1 (Aboudan dkk., 2001). Jumlah analit terendah
metanol: air (50:50 v/v). Ini selanjutnya diencerkan sepuluh kali lipat
dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan
dan pengenceran konsentrasi yang diketahui dalam kisaran 0,312 -
akurasi yang dapat diterima di bawah kondisi eksperimental
5µg/ml disiapkan. Diazepam ditambahkan sebagai standar internal
yang dinyatakan atau batas kuantisasi LOQ diukur dalam
(40µg/ml). Solusi yang dihasilkan disuntikkan ke dalam kolom.
rasio sinyal terhadap noise 10:1 (Aboudan
dkk., 2001). Dengan demikian, LOD dan LOQ dihitung
sebagai berikut:

232 Pak. J. Farmasi. Sci., 2006, Vol.19(3), 231-235

 M. Saeed Arayne dkk.

3.3 10 kurva kalibrasi yang dihasilkan pada empat hari yang berbeda adalah
LD = –––––– dan LOQ = –––––– 0,002 dan 0,012, masing-masing. Koefisien korelasi (r2)
S S dari semua kurva kalibrasi secara konsisten lebih besar
dari 0,9995.
Dimana, dan S adalah simpangan baku dan kemiringan
masing-masing. Batas bawah deteksi dan kuantisasi Penerapan metode untuk formulasi dosis
untuk MfCl ditemukan 0,1 dan 0,3μg/ml, masing-masing. Metode HPLC yang dikembangkan ini sensitif dan spesifik
untuk penentuan kuantitatif metformin dari formulasi
Linearitas (kurva kalibrasi) sediaan. Metode ini diterapkan untuk estimasi obat dalam
Kurva kalibrasi dibangun dengan lima konsentrasi tablet 'Neodipar. Jumlah MfCl yang ada dalam formulasi
termasuk LOQ mulai dari 0,312 hingga 5 g/ml dievaluasi dalam tablet kekuatan 250 mg yang diproduksi
(gambar 3). Area puncak obat terhadap konsentrasi oleh Sanophy Aventis. Setiap sampel dianalisis dalam
dipertimbangkan untuk memplot grafik linieritas. rangkap tiga setelah persiapan sampel seperti yang
Standar deviasi kemiringan dan intersep untuk disebutkan di bagian eksperimental. Pemulihan metformin

Tabel 1

Konsentrasi nominal
0,312 g/ml 0,625 g/ml 1,25 g/ml 2,50 g/ml 5,00 g/ml
Hari 1
Berarti 0,300 0,623 1.247 2.500 5.011
SD 0,008 0,002 0,002 0,000 0,007
CV 2.823 0.246 0,151 0,005 0,148
%Bias - 3.84 - 0,346 - 0,21 - 0,01 - 0,21
Hari ke-2

Berarti 0.309 0,603 1.221 2.448 4.936

SD 0,002 0,016 0,020 0,037 0,046
CV 0,784 2.600 1.663 1.509 0,918
%Bias - 1.09 - 3.55 - 2.23 - 2.09 - 1,28
Hari ke-3

Berarti 0.309 0,619 1.232 2.495 4.997

SD 0,002 0,004 0,014 0,003 0,002
CV 0,785 0,637 1.033 0,133 0,047
%Bias - 1.09 - 0,89 - 1,44 - 0.19 - 0,07
Hari 4
Berarti 0.309 0,625 1.060 2.263 5.033
SD 0,002 0,000 0,134 0,164 0,023
CV 0,678 0,046 12.67 7.397 0,463
%Bias - 0,95 - 0,07 - 15.19 - 9.47 - 0,66

Setiap nilai rata-rata adalah hasil dari analisis rangkap tiga.

Meja 2

Metformin (5,0 g/ml) Standar internal (40,0 g/ml)

Waktu retensi (menit) Daerah puncak Waktu retensi (min) Daerah puncak

Rata-rata (n= 5) 4.4 459411,2 6.1 75035.15

SD 0,014 1142.58 0,006 1327,33
% CV 0.32 0.249 0,10 1.785

Pak. J. Farmasi. Sci., 2006, Vol.19(3), 231-235 233

Pengembangan dan validasi metode RP-HPLC

hidroklorida dalam 'tablet Neodipar' ditemukan 98,88% karena pemisahan dan resolusi puncak kromatografi yang
(tabel 3). Tak satu pun dari eksipien tablet mengganggu baik dengan waktu retensi optimum 4,4 menit. Metode ini
puncak analit. memungkinkan penentuan metformin, secara linier
serendah 0,3μg dengan simpangan baku relatif hingga ±0,1,
Tabel 3: Karakteristik pemulihan metformin dalam dosis sedangkan metode ini berlaku efektif untuk LOD 0,1 μg.
formulasi Tidak ada gangguan dari berbagai parameter yang diamati
selama variasi antar-pribadi dan antar-operator, penentuan
Ditemukan kons. Persen antar-hari dan intra-hari seperti yang dilaporkan dalam tabel
konsentrasi g/ml Daerah puncak
(µg/ml) Pemulihan 1. Hasil yang diperoleh sesuai dengan konten statistik dan
Farmakoepial yang dinyatakan. Oleh karena itu, ketepatan,
0,312 28843 0,324 103,90
keandalan, kecepatan, kesederhanaan, sensitivitas dan sifat
0,625 57441 0,618 98,88 ekonomis dari metode HPLC ini membuatnya
1.25 106445 1.248 99.87 menguntungkan bagi teknik HPLC lain yang dilaporkan
2.50 225490 2.502 100,07 untuk penetapan kadar metformin.

5.00 455857 5.017 100.34

REFERENSI

Aboudan M, Ashour S dan Aboudan H (2001). Titrasi

konduktometri metformin dalam bentuk murni dan dalam
sediaan farmasi menggunakan natrium tetrafenilborat
dan setilpiridinium bromida.Asia J. Chem.
metformin 13(1): 1.
Ashour S dan Kabbani R (2003). Spektrofotometri
langsung penentuan metformin hidroklorida dalam
Diazepam
bentuk murni dan dalam formulasi obat surat analitik
36(2): 361-370.
Bailey CJ (1985). Tindakan anti-hiperglikemik metformin.
Di: Kran HMJ (ed.). Diabetes dan metformin, penelitian
dan pembaruan klinis, Royal Society of Medicine
International Congress and Symposium Series, No.79,
Gambar 2: Kromatogram representatif yang menunjukkan pemisahan Royal Society of Medicine, London, pp.17-26.
metformin dan standar internal. Calatayud JM, Falco PC dan Pascual MC Marti (1985).
Penentuan metformin dan moroksidan dengan Cu(II).
1000000
dubur. Lett.18(B11): 1381.
Calatayud JM, Marti MCP dan Falco PC (1985).
800000
Konstruksi dan karakteristik kinerja a
metformin elektroda di itu metformin
Area di bawah kurva (AUC)

berdasarkan

600000 asosiasi ion keadaan fosfotung. Analis (London)

110(8): 981.
400000
El-Bardicy MG, El-Khateeb SZ, Ahmad AKS dan Assaad
HN (1989). Penentuan spektrofotometri Metformin
200000 melalui kompleks transfer muatan dengan yodium.
spektroskopi. Lett.,22(9): 1173.
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
El-Khateeb SZ, Assaad HN, El-Bardicy MG dan Ahmad AS
Konsentrasi (1988). Penentuan metformin hidroklorida dalam
(ppm) tablet dengan spektrometri resonansi magnetik nuklir,
Analitika. Chimika. Akta.,208: 321-324.
Gambar 3: Linearitas metformin dalam metanol: air (30: 70 El-Khateeb SZ, Assaad HN, El-Bardicy MG dan Ahmad AS
v/v). (1988). Penentuan metformin dalam plasma dengan
elektroforesis kapiler menggunakan teknik field-amplified
KESIMPULAN sample stacking.dubur. Chim. Akta.,208(1-2): 321.
Hassan SSM, Mahmoud WH, Elmosallamy MAF dan
Metode RP-HPLC yang dikembangkan mampu menentukan Othman AHM (1999). Penentuan metformin dalam
metformin dalam bahan baku dan dalam semua formulasi dosis sediaan farmasi menggunakan potensiometri, spektro-

234 Pak. J. Farmasi. Sci., 2006, Vol.19(3), 231-235


fluorimetri dan spektrofotometri UV-tampak. dubur.
Chim. Akta.,378(1-3): 299.
Hassan SSM, Mahmoud WH, Elmosallamy MAF dan
Othman AHM (1999). Penentuan metformin dalam
sediaan farmasi menggunakan potensiometri,
spektrofluorimetri dan spektrofotometri UV-tampak.
dubur. Chim. Akta.,378(1-3): 299.
Hassan SSM, Mahmoud WH, Elmosallamy MAF dan
Othman AHM (1999). Penentuan metformin dalam
sediaan farmasi menggunakan potensiometri,
spektrofluorimetri dan spektrofotometri UV-tampak
dubur. Chim. Akta.,378(1-3): 299.
Hermann LS (1979). Metformin: Tinjauan sifat
farmakologis dan penggunaan terapeutiknya.
Metabolisme Diabetes, 5: 233-245.
Hermann LS (1981). Efek metabolik metformin dalam
kaitannya dengan efek klinis dan efek samping.Di: van
der Kuy A, Hulst SGT (ed). Terapi Biguanide hari ini,
Royal Society of Medicine International Congress and
Symposium Series, No.48, Academic Press, Grune &
Stratton, London, pp.17-48.
Khanolkar DH dan Shinde VM (1999). Metode RP-HPLC
untuk estimasi glibenklamid dan metformin HCL dari
bentuk sediaan gabungan.Obat India, 36(12): 739-
742.
Klip A dan Leiter LA (1990). Mekanisme seluler aksi
metformin.Perawatan Diabetes, 13(6): 696-704.
Kolte BL, Raut BB, Deo AA, Bagool MA dan Shinde DB
(2004). Penentuan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
simultan dari pioglitazone dan metformin dalam
bentuk sediaan farmasi.Jurnal Ilmu Kromatografi,
42(1): 27-31.
Kolte BL, Raut BB, Deo AA, Bagool MA dan Shinde DB
(2004). Penentuan metformin secara simultan dalam
kombinasi dengan rosiglitazone dengan kromatografi cair
fase terbalik.J. Kromatografi. ilmu pengetahuan.,42(2): 70-3.
Lin MC, Lin JH dan Wen KC (2001). Deteksi dan
penentuan phenformin dalam kapsul obat Cina oleh
GC-MS dan HPLC.Jurnal Analisis Makanan dan Obat-
obatan, 9(3): 139-144.
Liu YG dan Li GZ (2001). Faktor-faktor yang mempengaruhi pembentukan
nitrit dalam reaktor biofilm nitrifikasi.Cina J. Anal. Kimia
29(9): 1027.
Pak. J. Farmasi. Sci., 2006, Vol.19(3), 231-235
Viie
ewwppu
ubbliiccaattiiodin ssttaattss
M. Saeed Arayne dkk.
Rizk MS (1995). Elektroda membran polivinil klorida (PVC)
selektif metformin berdasarkan pasangan ion
metforminium fosfomolibdat.Elektroanalisis, 7(7): 687.
Schaffer G (1983). Biguanides: tinjauan riwayat
farmakodinamik dan terapi.Diabetes dan Metabolisme,
9: 148-163.
Lagu JZ, Chen HF, Tian SZ dan Sun ZP (1998). Penentuan
metformin dalam plasma dengan elektroforesis kapiler
menggunakan teknik field-amplified sample stacking
Journal of Chromatography B:Ilmu dan Aplikasi
Biomedis, 708(1-2): 277-283.
Tache F, David V, Ferca A dan Medvedovici A (2001).
Penentuan HPLC-DAD Metformin dalam plasma manusia
menggunakan derivatisasi denganp-nitrobenzoil klorida
dalam sistem bifasik. mikrokimia. J.,68(1): 13.
Tache F, David V, Farca A dan Medvedovici A (2001).
Penentuan HPLC-DAD metformin dalam plasma manusia
menggunakan derivatisasi dengan p-itrobenzoil klorida
dalam sistem bifasik.mikrokimia. J.,68(1): 13-19.
Vasudevan M, Ravi J, Ravisankar S dan Suresh B (2001).
Teknik kromatografi cair pasangan ion untuk estimasi
metformin dalam bentuk sediaan multikomponennya.
J. Farmasi. Bioma. Ana.,25(1): 77-84.
Yuen KH dan Peh KK (1998). Metode kromatografi cair
kinerja tinggi sederhana untuk penentuan metformin
dalam plasma manusia.J. Kromatografi. B. Bioma. Sci.
Aplikasi,710(1-2): 243-246.
Yuen KH, Zhang M, Moore GA, Lever M, Gardiner SJ,
Kirkpatrick CM dan Begg EJ (2002). Uji kromatografi
cair kinerja tinggi yang cepat dan sederhana untuk
penentuan metformin dalam plasma manusia dan ASI.
J. Kromatografi. B. Analisis. teknologi. Bioma. Ilmu
Kehidupan.,766(1): 175-9.
Zarghi A, Foroutan SM, Shafaati A dan Khoddam A (2003). Penentuan
cepat metformin dalam plasma manusia menggunakan HPLC
pasangan ion.J. Farmasi. Bioma. anal.,31(1): 97-200.
Diterima: 16-07-2006 – Diterima: 08-08-2006
235