ISOLASI & IDENTIFIKASI FLAVONOID

FITOKIMIA
STRUKTUR
Struktur utama
 FLA ANTHOC
FLAVANO FLAVANO ISOFLAV FLAVON
YANIDIN
N L VON ON OL
E
SIFAT-SIFAT
 SIFAT BERDASARKAN STRUKTUR

 Dalam tumbuhan :  Pada umumnya flavonoid

 bentuk aglikon dan glikosida  larut dalam air dan etanol
(polar),
 tidak larut dalam eter minyak
 Glikosida flavonoid:
bumi (non polar)
 O - glikosida (lebih umum
terdapat dialam)
 Memberikan Serapan kuat
 Mudah dihidrolisis
pada daerah spektrum UV
 C - glikosida (jarang dan tampak (sistem aromatik
ditemukan di alam) terkonjugasi / kromofor).
 Sulit dihidrolisis
METODE ISOLASI
Pendahuluan
Pemisahan flavonoid (awalnya):
 KLT
Waktu analisis singkat,
mudah, merupakan metode
yg fleksibel u/ pengerjaan
fraksinasi
 Elektroforesis Kertas
 Kromatografi Poliamida
 HPLC
 Di kopling dgn UV, MS & NMR, serta CE
 Salah satu fitur yang berperan besar
dalam analisis flavonoid adalah
keberadaan gugus cincin fenil dalam
strukturnya
 Berfungsi sebagai chromophore ,
yang bersifat UV active dan
mengakibatkan flavonoid mudah
untuk dideteksi
 Spektrum UV flavonoid sangat
informatif, memberikan informasi yang
cukup untuk dapat mengidentifikasi
jenis flavonoid dan pola oksidasi fenol.
Penyiapan Sampel
 Bisa berupa tumbuhan segar (bahan awal yang ideal untuk
menganalisis flavonoid)
 Bisa berupa tumbuhan yang dikeringkan (jika disimpan dlm
kondisi baik)
 Herbarium yg disimpan 100 th msh dpt digunakan
u/menganalisa flavonoid (Harborne, 1976)
 Niklas & Gianassi, 1978, dapat mengisolasi flavonoid dari fosil
yg berusia 25 juta th
 Tapi, dlm tumbuhan yg sudah lama ada kecenderungan glikosida
berubah mjd aglikon akibat pengaruh fungi
  Flavonoid (terutama dalam bentuk glikosida) dapat mengalami
degradasi oleh aktivitas enzimatik ketika bahan tanaman dalam
E keadaan segar.
K  Disarankan untuk menggunakan sampel beku atau kering.
 Setelah kering, bahan yang digunakan biasanya dibuat serbuk.
S  Untuk ekstraksi, pelarut yang dipilih tergantung pada jenis flavonoid
T yang dibutuhkan.

R Polaritas merupakan pertimbangan penting.

 Flavonoid yg kurang polar (misalnya, Isoflavon, flavanones, flavon
A dan metil flavonol) diekstraksi dengan kloroform, CH2Cl2, dietil
K atau etil asetat
 Glikosida flavonoid dan aglikon yang lebih polar diekstraksi dengan
S alkohol atau campuran alkohol-air. Ikatan glikosida meningkatkan
kelarutan dalam air dan larutan air-alkohol.
I  Ekstraksi kandungan flavonoid masih menggunakan metode ekstraksi
pelarut
 Metode Ekstraksi Flavonoid . . .

Serbuk  Menggunakan metode

Simplisia ekstraksi bertingkat
Diklorometan  Beberapa flavanon dan
glikosida chalcone sulit larut
Ekstrak dalam campuran metanol,
RESIDU
CH2Cl2 etanol atau alkohol-air.
Alkohol  Kelarutan flavanon tgt pada
•Flavonoid •Flavonoid pH larutan yg mgd air.
aglikon glikosida
•Senyawa2 krg •Senyawa2
polar polar
Cara Pemisahan Flavonoid
 KKt Preparatif
 Kertas Whatman No. 17 (kapasitas > Whatman No. 3, resolusi
<<)
 Kromatografi Kolom
 FG : Pelarut yg cocok diperoleh melalui pemantauan KLT
Umumnya menggunakan elusi landaian
 FD :
 Selulosa: memisahkan antar senyawa glikosida, memisahkan
glikosida dari aglikon. Kapasitas rendah
 Silika : memisahkan aglikon yg kurang polar, mis: isoflavon,
flavanon, flavonol
 Poliamida: cocok utk memisahkan semua flavonoid
Cara Pemisahan Flavonoid...
 KLT (untuk analisis cepat)
 FD : selulosa, poliamida, silika
 FG : tgt dari jenis FD
 KLT berfungsi juga utk:
 Mencari pelarut untuk Kromatografi Kolom
 Menganalisis fraksi yang keluar dari Krom. Kolom
 Melihat tjd perubahan reaksi spt hidrolisis atau metilasi
 Identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi
 Isolasi flavnonoid murni dlm skala kecil

 KCKT
 Menggunakan kolom fase balik
METODE IDENTIFIKASI
 Metode Identifikasi Flavonoid
Spektrofotometri UV-sinar tampak
 Merupakan cara yg paling banyak digunakan
u/menganalisis struktur flavonoid dalam hal
mengidentifikasi jenis & menentukan pola oksigenasi
flavonoid
 Posisi hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat
ditentukan dgn menambahkan pereaksi geser.
 Scr tdk langsung dapat digunakan u/menentukan posisi
gula/metil yg terikat pd salah satu ggs hidroksil fenol
 Kelebihan: jumlah flavonoid yg digunakan sedikit (0,1 mg)
 Spektrofotometri UV-sinar tampak u/flavonoid
Spektrum flavonoid umum
 Biasanya ditentukan dlm larutan MeOH
 Spektrum khas tdd 2 pjg gelombang maksimal:
 240 – 285 (pita II)
 300 – 550 (pita I)
 Ciri khas:
 Serapan pita I yg rendah pd dihidroflavon, dihinroflavonol,
isoflavon
 Serapan pita I yg kuat pd khalkone, auron, antosianin
Spektrum Serapan UV-Sinar Tampak Flavonoid
 Gambaran Spekrum UV-Sinar Tampak Flavonoid
Secara Umum
 Perubahan di cincin A tercermin pada serapan pita II,
perubahan di cincin B dan C tercermin pada pita I
 Oksigenasi tambahan (terutama OH) umumnya
mengakibatkan pergeseran pita yg sesuai pd pjg gelombang
yg lebih tinggi
 Metilasi atau glikosilasi (terutama pd posisi 3,5,7, 4’-OH)
mengakibatkan pergeseran pita ke pjg gelombang lebih
rendah
 Pada flavon dan flavonol, adanya 3’, 4’-di OH, dapat
dibuktikan dgn adanya puncak kedua di pita II (kdg2 berupa
bahu)
 Spektrofotometri UV-sinar tampak u/flavonoid
 Pereaksi geser yg biasa digunakan:
 Natrium metoksida (NaOMe)
 Natrium asetat (NaOAc)
 Alumunium klorida (AlCl3)
 Asam klorida (HCl)
 Asam borat (H3BO3)
 Spektrofotometri UV-sinar tampak u/flavonoid
Tahapan kerja menggunakan pereaksi geser
 Ukur spektrum cuplikan dalam pelarut MeOH (spektrum
MeOH), kmd tambahkan 3 tts prx NaOMe u/memeriksa
apakah tjd penguraian. Inkubasi selama 5 menit, ukur kembali
spektrum NaOMe, cuplikan dibuang. Diisi lagi dgn larutan
persediaan flavonoid
 Tambahkan 6 tts prx AlCl3 ke dlm larutan flavonoid, ukur
spektrum AlCl3 kmd tambahkan 3 tts HCl, campur, ukur
spektrum AlCl3/HCl. Buang cuplikan
 Tambahkan NaOAc ke dlm larutan flavonoid, ukur spektrum
NaOAc, tmbhkan H3BO3, ukur spektrum NaOAc/ H3BO3
 Penafsiran Spektrum
 Spektrum NaOMe:
 Merupakan spektrum batas
ttt ionisasi flavonoid (posisi
3, 4, 7 & 4’ hidroksil)
 Merupakan petunjuk sidik
jari pola hidroksilasi
flavonoid.
Penafsiran Spektrum...
 Spektrum NaOAc
 Mendeteksi adanya gugus
7-hidroksil bebas
 Spektrum NaOAc/H3BO3
 Menjembatani kedua gugus
hidroksil pd gugus o-
dihidroksi
Penafsiran Spektrum...
 Spektrum AlCl3/HCl
 Adanya gugus OH bebas pada
C5 flavon diketahui
berdasarkan:
 1. penambahan AlCl3 + HCI
pada larutan metanol,
memberikan pergeseran
bathokromik 35-55 nm pita I
 2. Bentuk spektrum dalam
metanol setelah penambahan
AlCl3 + HCI terdiri dari
empat puncak (pita Ia dan lb
serta lla dan llb)
Spektrum AlCl3-HCl
 Hidrolisis & Analisis Glikosida
 Hidrolisis Asam
Waktu yg diperlukan u/hidrolisis :
 Tidak hanya ditentukan kekuatan asam, tp juga
ditentukan oleh sifat gula
(mis: glukuronida>glukosida=galaktosida>ramnosida)
 Juga ditentukan oleh posisi substitusi gula
(mis: 7-O-glikosida>4’-O-glikosida>3-O-glikosida)
Hidrolisis & Analisis Glikosida...
 Hidrolisis Enzim
 Berguna untuk menentukan sifat ikatan antara gula dan
flavonoid (alfa atau ß)
 Secara teori dpt digunakan untuk memutuskan monosakarida
khas dari flavonoid O-glikosida
 Kenyataan: sulit menemukan sediaan enzim yang memadai
 Contoh enzim:
 ß-glukosidase: menghidrolisis ß-D-glikosida, kec. Antosianin
 ß-galaktosidase
 Pektinase
Hidrolisis & Analisis Glikosida...
 Hidrolisis Basa
 Jarang digunakan untuk menghidrolisis flavonoid
glikosida
 Tapi efektif untuk memutus gula secara selektif dari
posisi 7 atau 4’
Wassalam