Squalen Bull.of Mar. & Fish.Postharvest & Biotech.

ISSN: 2089-5690
E-ISSN: 2406-9272

SURAT PENGANTAR

Pemimpin Redaksi yang Terhormat,

Saya dengan ini melampirkan artikel penelitian,

Judul:
Deteksi Cholera rtxA Gene sebagai Biomarker Patogen ​Vibrio cholera​ dari Makanan Laut yang
Dibawa Menggunakan ​In Silico​ PCR Assay

Nama Pengarang:

Stalis Norma Ethica, Kazi Mohammad Zillur Rahman, Nur Hidayati, Hayatun Fuad, Muhammad
Arham, Rivana Ariyadi, Ellyka Purwaningrum

Alamat
(Isi nama dan alamat institusi Anda, ponsel pribadi Anda, dan email)
Program Magister Ilmu Laboratorium Medis, Universitas Muhammadiyah Semarang, Jl.
Kedungmundu Raya No. 18, Semarang, 50273, Indonesia; 08979308992, norma@unimus.ac.id.

Kebaruan:
(sebutkan kebaruan yang Anda klaim dari temuan versus pengetahuan saat ini)
Kami melaporkan primer PCR yang baru dirancang, yang dapat digunakan untuk memperkuat gen
virulensi rtxA dari Vibrio cholerae dan secara teoritis menunjukkan bahwa gen tersebut adalah
biomarker dari bakteri patogen berdasarkan studi ​in silico.

Daftar lima pengulas potensial

(Isi lima nama pengulas potensial yang setuju untuk meninjau naskah Anda dan alamat email
mereka. Ia harus memiliki ID Scopus dan berasal dari lembaga berbeda dari penulis)
1.
2.
3.
4.
5.

Tempat dan Tanggal:

Semarang, 8 Desember 2019

Hormat kami,
(isi nama Anda, tidak perlu tanda tangan)

Stalis Norma Ethica

 Squalen Bull.of Mar. & Fish.Post.& Biotech.

Deteksi Cholera rtxA Gene sebagai Biomarker

Patogen ​Vibrio cholera​ dari Makanan Laut yang
Dibawa Menggunakan ​In Silico​ PCR Assay
Stalis Norma Ethica​1*​, Nur Hidayati​1,2​, ​Hayatun Fuad​1​, ​Muhammad Arham​1​, ​Rivana
Ariyadi​3​, ​Ellyka​4​,​ Kazi Mohammad Zillur Rahman​5
1 Program Magister Ilmu Laboratorium Medis, Universitas Muhamamdiyah Semarang, Jl. Kedungmundu Raya no. 18, Semarang, 50273, Indonesia
2Rumah Sakit Anugerah Pekalongan Jl. Perintis Kemerdekaan no. 3, Pekalongan, 51145, Indonesia
3Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Muhammadiyah Ciamis, Jl. K.H Ahmad Dahlan no. 20, Ciamis, 46216, Indonesia
4 Fakultas Kedokteran, Universitas Wahid Hasyim Semarang, Jl. Kolonel Warsito, Semarang, 50232, Indonesia
5Centre untuk Ilmu Pengetahuan Laut dan Inovasi, Universitas New South Wales, Level 5 East, Ilmu Biologi Utara (D26), Kensington, New South Wales, 2052,
Australia

* Penulis Berkorespondensi: norma@unimus.ac.id

Sejarah artikel:
Diterima: ………. Direvisi: ………… Diterima: …………….

ABSTRAK

Wabah yang disebabkan oleh makanan laut yang disebabkan oleh ​Vibrio cholera telah menyebabkan meningkatnya
kebutuhan akan penilaian risiko keamanan pangan dari produk-produk laut. Investigasi ​in silico tentang potensi gen
virulensi dari ​V.cholerae​, rtxA, sebagai biomarker dari bakteri toksigenik telah dilakukan. Tujuannya adalah untuk
menentukan biomarker bakteri, yang penting untuk memfasilitasi diagnosis cepat awal infeksi koleral. Lima pasang primer
spesifik dirancang dari bingkai pembacaan terbuka rtxA DNA dari ​Vibrio cholerae O1 biovar El Tor str. DNA genom
N16961 menggunakan Primer3Plus. Selanjutnya, dalam uji PCR (Polymerase Chain Reaction) silico dilakukan dengan
menggunakan primer yang baru dirancang dan 25 DNA genom dari vibrios (semua spesies) yang diambil dari dalam basis
data silico. Salah satu dari lima pasang primer yang dirancang, RtxAOF-RtxAOR: ‘5-CGCAAAACAGTTTCAGCCGA-3
'dan 5'-AGGTTGGTCTTTTTGTGGCCA-3 ', dapat menghasilkan satu amplikon DNA berukuran 518 bp hanya dari spesies
V.cholera. Tidak ada pita amplikon yang dihasilkan dari 24 genom vibrio lain yang dipelajari menggunakan primer
RtxAF-RtxAR yang serupa. Pemeriksaan lebih lanjut menunjukkan bahwa amplikon benar-benar merupakan bagian dari
gen rtxA dari ​V.cholerae​. Berdasarkan ini dalam penelitian silico, gen rtxA tampaknya menjadi biomarker DNA dari ​V.
colerae​, yang berpotensi untuk memfasilitasi diagnostik cepat bakteri virulensi.

Kata kunci: Infeksi melalui makanan laut, ​Vibrio cholera​, DNA biomarker, desain primer, rtxA

INTRODUCTION1*
Produk makanan laut memainkan peran penting di pasar ekonomi karena dikonsumsi secara luas di
seluruh dunia (Bonnin-Jusserand et al., 2019). Per kapita, konsumsi makanan laut telah meningkat secara
global selama beberapa dekade terakhir. Impor hasil laut dan pertanian akuakultur domestik juga meningkat.
Namun sejumlah wabah gastroenteritis manusia baru-baru ini telah dikaitkan dengan konsumsi makanan laut
yang terkontaminasi (Elbashir et al., 2018).
Penyakit menular diklasifikasikan sebagai penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme patogen

1
*​ ​Corresponding author.
E-mail: ​norma@unimus.ac.id
Copyright © 2016, Squalen BMFPB.
 Squalen Bull.of Mar. & Fish.Postharvest & Biotech.

ISSN: 2089-5690
E-ISSN: 2406-9272

termasuk bakteri. Penyakit seperti itu telah menjadi ancaman utama di seluruh dunia dan berdampak besar
pada kesehatan masyarakat dan perekonomian dunia (Hwang et al., 2018). Penyakit infeksi yang disebabkan
oleh makanan laut adalah bahaya kesehatan masyarakat yang utama di seluruh dunia. Wabah yang
disebabkan oleh makanan laut yang disebabkan oleh bakteri telah menyebabkan meningkatnya kebutuhan
untuk penilaian risiko keamanan pangan dari produk laut. Pemantauan kontaminasi bakteri secara
terus-menerus dalam produk akuatik dan identifikasi faktor risiko sangat penting untuk memastikan
keamanan makanan (Xu et al., 2019).
Investigasi penyakit yang ditularkan melalui makanan laut yang disebabkan oleh norovirus, bakteri
dan virus membutuhkan pengetahuan konkret tentang sifat patogenisitas dan virulensi dari agen etiologi
(Elbashir et al., 2018; Iwamoto et al., 2010). Di antara bakteri beracun yang mencemari makanan laut, ​V.
cholera adalah spesies vibrio utama yang bertanggung jawab untuk peningkatan dramatis infeksi yang
ditularkan dari makanan laut di seluruh dunia (Bonnin-Jusserand et al., 2019). ​V. cholerae terkenal sebagai
agen penyebab kolera, penyakit diare yang parah, yang bisa berakibat fatal jika tidak diobati. Biasanya
ditularkan melalui air yang terkontaminasi dan kontak orang-ke-orang (Baker-Austin et al. 2018). Sekitar 2,9
juta kasus kolera dan 95.000 kematian telah terjadi setiap tahun di seluruh dunia antara 2008 dan 2012 (Ali et
al. 2015).
Sampai saat ini, lebih dari 200 serogrup ​V. cholerae telah dikenali, berdasarkan pada komposisi
antigen O somatik variabel; O1 adalah satu-satunya serogrup epidemi yang diketahui dari ​V. cholerae hingga
1991. Pada tahun 1992, serogrup O139 diidentifikasi sebagai serogrup epidemi kedua dari ​V. cholerae
(Albert et al., 1993; Shimada et al., 1993). Di dalam serogroup ​V. cholerae O1 ada dua biotipe yang sudah
mapan: klasik dan El Tor. Strain Vibrio cholerae dari serogrup O1 yang biasanya menyebabkan epidemi
kolera dapat diklasifikasikan menjadi dua biotipe, klasik dan El Tor. Biotipe El Tor muncul pada tahun 1961
dan kemudian menggantikan biotipe klasik sebagai penyebab kolera di seluruh dunia (Pradhan et al., 2010).
Biotipe klasik dan El Tor dibedakan satu sama lain dengan sejumlah sifat, termasuk aglutinasi sel darah
merah ayam, kerentanan terhadap polimiksin B dan fag spesifik biotipe, hemolisis sel darah merah domba,
dan reaksi Voges-Proskauer (Kaper et al., 1995). Strain ​V. cholerae dari biotipe El Tor mengawali pandemi
kolera ketujuh, yang masih berlanjut. Sampai saat ini, strain ​V. cholerae O1, yang termasuk biotipe El Tor
telah menyebabkan wabah di seluruh dunia dengan efek bencana.
Di antara faktor virulensi kunci dari ​V. cholerae adalah elemen genetik toksin kolera (CTX) dan
pengulangan dalam cluster toksin (RTX) (Davis et al., 2000). CTX dan RTX adalah kelompok gen virulensi
utama dan dikelompokkan bersama (Cheng et al., 2014). Kelompok racun RTX umumnya diproduksi oleh
beberapa bakteri patogen Gram-negatif. Racun RTX mewakili keluarga faktor virulensi penting yang telah
menyebar luas di antara bakteri Gram-negatif. Dalam V. cholerae, kluster gen toksin RTX mengkodekan
sitotoksin dugaan ​(rtxA), asiltransferase ​(rtxC), dan sistem transporter kaset pengikat ATP terkait (dua
protein untuk transportasi toksin, RtxB dan RtxD) (Chou et al., 2001; Lin et al., 1999).
Pencarian untuk biomarker yang ideal pada penyakit menular (dengan sensitivitas tinggi, spesifisitas,
dan kapasitas prediksi) pada awalnya harus difokuskan pada deteksi dan identifikasi agen infeksi (Mohan &
Harikrishna, 2015). Urutan genomik ​V. cholerae memberikan titik awal untuk memahami bagaimana
organisme yang hidup bebas dan lingkungan muncul menjadi patogen bakteri manusia yang signifikan
(Heidelberg et al., 2000). Urutan genom lengkap dari Gram-negatif, gamma-Proteobacterium ​V.cholerae El
Tor N16961 telah dilaporkan memiliki panjang 4.033.460 pasangan basa (bp). Namun, banyak mutasi telah
dilaporkan pada strain V. cholerae O1 yang meliputi gen, yang mengkode faktor virulensi termasuk
pengulangan dalam racun ​(rtxA). ​Dalam kasus penyakit infeksi yang ditularkan melalui makanan laut,
deteksi dan identifikasi agen infeksi ​V. cholera perlu dilakukan. Dalam penelitian ini, rtxA​, anggota RTX
virulence gene cluster, diuji potensinya sebagai biomarker DNA dari V.cholerae. Biomarker seperti ini
bermanfaat untuk memfasilitasi diagnosis cepat awal infeksi ​V. cholerae​ menggunakan PCR in vitro.

BAHAN DAN METODE

Studi literatur pada awalnya dilakukan untuk mendapatkan informasi terkait dengan fitur fenotipik
V.cholerae yang paling unik, terutama pada racun spesifik yang dihasilkan spesies. Selanjutnya, fitur
genotipe seperti gen yang terkait dengan protein yang menggarisbawahi fenotipe unik menjadi sasaran.
 Squalen Bull.of Mar. & Fish.Post.& Biotech.

Primer kemudian dirancang dari bagian internal bingkai bacaan terbuka dari sekuens gen yang ditargetkan
menggunakan Primer3Plus ​https://primer3plus.com/ at (Untergasser ​et al​., 2007; Ethica ​et al.​ , 2013; 2014;
2014; 2019). Pasangan primer yang memiliki paling sedikit kemungkinan pembentukan formasi hairpin (jepit
rambut), saling melengkapi diri, dan dimerisasi dipilih (Ethica ​et al.​ , 2017). Primer yang baru dirancang
kemudian digunakan sebagai input untuk PCR berbasis ​in silico berbasis web dari perangkat lunak berbasis
web di ​http://insilico.ehu.es/PCR/ menggunakan genom vibrio (semua spesies) yang disimpan dalam
database program (Bikandi ​et al., 2004; San Millán et al., 2013; Ethica ​et al​., 2019). Analisis akhirnya
dilakukan untuk mengkonfirmasi apakah produk PCR ​in silico (amplikon) khusus untuk spesies ​V.cholerae
dan benar-benar bagian dari gen yang ditargetkan sebagai biomarker DNA.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Wabah infeksi serius sering muncul dari ikan dan makanan lain yang menciptakan tantangan
diagnostik bagi dokter. Ada panduan resmi terbatas untuk membantu dokter memutuskan biomarker mana
yang membantu dalam diagnosis infeksi bakteri (Rogers ​et al., 2011). Namun, pengembangan biomarker
DNA bakteri untuk mendeteksi ​V. cholera telah dilakukan dalam penelitian ini. Diharapkan dalam kasus
wabah infeksi diare, keterlibatan ​V.cholerae dapat ditentukan dengan mendeteksi keberadaan biomarker
DNA mereka.
Dari studi literatur, diketahui bahwa gen rtxA, anggota cluster gen RTX, adalah di antara fitur
genotip yang berbeda dari bakteri menular Vibrio cholerae (Lin ​et al., 1999). Keunikan gen membuatnya
berpotensi untuk ditargetkan sebagai biomarker DNA spesies ​V. cholerae​. Urutan gen ​rtxA kemudian diambil
dari genbank NCBI (Pusat Nasional untuk Informasi Bioteknologi) dari urutan genom ​Vibrio cholerae O1
biovar strain El Tor N16961 (NCBI. str. N16961] (Urutan Referensi NCBI: NP_231094.1). Struktur 3-D
protein kolera RtxA (nomor aksesi UniProt: Q9KS12) sebagai produk gen ​rtxA​ ditunjukkan pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur 3-D protein kolera RtxA (produk gen rtxA) divisualisasikan oleh Litemol (Nomor Akses
UniProt: Q9KS12)

Menggunakan primer3Plus (Untergasser et al., 2007), pasangan primer diperoleh dengan menggunakan
urutan DNA sagC dan sagD sebagai input (masing-masing Gambar 1 dan 2) tercantum pada Tabel 1.

Tabel 1. Primer dirancang menggunakan Primer3Plus dari urutan DNA rtxA.

Amplico
DNA of ​V.cholerae​ strains 
Primer   Forward Primer  Reverse Primer  n 
amplified (code number) 
Size (bp) 
ACCGACATGCCATCACCAA
Pair 1  GCGCGAACGTAATAACCCAC  508  4,5, and 7-9 
T 
 Squalen Bull.of Mar. & Fish.Postharvest & Biotech.

ISSN: 2089-5690
E-ISSN: 2406-9272

Pair 2  CGCAAAACAGTTTCAGCCGA  AGGTTGGTCTTTTGTGGCCA  518  4-11 (all ​V.cholerae)​  

Pair 3  GTGGCGCGAACGTAATAACC  AGATGTTGACGTTCCCCACC  597  4,5, and 7-9 
Pair 4  TAGCGGTGAAAGCTCAGGTG  GTTATTACGTTCGCGCCACC  585  4,5, and 7-9 
Pair 5  GCGCATTTACTGGCTTACGG  TGGTGAAGATGTTACCCGCC  559  4-9 

Dalam uji PCR ​in silico menggunakan pasangan 2 primer dan DNA genom dari 25 streptokokus
dijalankan pada ​http://insilico.ehu.es/PCR/​. Pengujian menghasilkan 8 pita DNA 518-bp tunggal (Gambar 2)
milik semua ​V. colerae atau spesies no 4 hingga 11 (Tabel 2, disorot). Menurut Tabel 2, spesies ​V.cholerae
nomor 4-11 adalah ​Vibrio cholerae,​ ​V.cholerae str. IEC224, ​V.cholerae str. LMA3984-4, ​V.cholerae str.
M66-2, ​V.cholerae str. MJ-1236, ​V.cholerae O1 str. 2010EL-1786, ​V.cholerae str. O395, dan ​V.cholerae str.
Kromosom O395 1.

Tabel 2. Daftar DNA genom Vibrio (semua spesies) yang digunakan seperti pada template PCR ​in silico 
No.  Complete list of Vibrio strains in the database used as ​in silico​ PCR templates 
1.  Vibrio alginolyticus NBRC 15630 = ATCC 17749 
2.  Vibrio anguillarum 775 
3.  Vibrio campbellii ATCC BAA-1116 
4.  Vibrio cholerae 
5.  Vibrio cholerae IEC224 
6.  Vibrio cholerae LMA3984-4 
7.  Vibrio cholerae M66-2 
8.  Vibrio cholerae MJ-1236 
9.  Vibrio cholerae O1 str. 2010EL-1786 
10.  Vibrio cholerae O395 
11.  Vibrio cholerae O395 chromosome 1 
12.  Vibrio fischeri ES114 
13.  Vibrio fischeri MJ11 
14.  Vibrio furnissii NCTC 11218 
15.  Vibrio harveyi ATCC BAA-1116 
16.  Vibrio parahaemolyticus BB22OP 
17.  Vibrio parahaemolyticus O1:K33 str. CDC_K4557 
18.  Vibrio parahaemolyticus O1:Kuk str. FDA_R31 
19.  Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 
20.  Vibrio sp. EJY3 
21.  Vibrio sp. Ex25 
22.  Vibrio splendidus LGP32 
23.  Vibrio vulnificus CMCP6 
24.  Vibrio vulnificus MO6-24/O 
25  Vibrio vulnificus YJ016 
 Squalen Bull.of Mar. & Fish.Post.& Biotech.

Gambar 2. Dalam pengujian PCR ​in silico ​menggunakan pasangan 2 primer dan 25 genom DNA vibrio
menghasilkan 7 pita DNA 518-bp tunggal milik semua spesies ​V. colera

Setelah melakukan uji PCR ​in silico​, perlu untuk memeriksa apakah produk amplikon terlihat pada
virtual gel electrophoresis (Gambar 2) benar berdasarkan posisi primer. Analisis dilakukan dengan mudah
dengan mengklik ukuran amplikon yang muncul di jendela hasil PCR ​in silico​. Tab baru kemudian muncul
menunjukkan bahwa dalam silico amplikon benar-benar bagian dari fragmen gen ​rtxA (Gambar 3). Urutan
DNA yang terlihat pada Gambar 3 merupakan salah satu dari 8 amplikon PCR yang dijalankan dalam ​in
​ CR menggunakan pasangan 2 primer yang dipilih (lihat Tabel 1) dan genom vibrios (nomor spesies 4,
silico P
lihat Tabel 2).

Gambar 3. Dalam amplikon PCR ​in silico dengan urutan genome ​V.cholerae sebagai templat menggunakan
pasangan 2 primer yang dirancang dalam penelitian ini.

Primer yang dirancang untuk memperkuat gen ​rtxA dari ​V.cholerae sebenarnya telah dilaporkan
sebelumnya. Menurut laporan sebelumnya, sepasang primer yang dirancang., RtxA-F
5'-GGGATACAATGCCCTCTGGCA-3 'rtxA-R 5'-TGGGTTGGATTTGGATTTTAC-3', berhasil digunakan
 Squalen Bull.of Mar. & Fish.Postharvest & Biotech.

ISSN: 2089-5690
E-ISSN: 2406-9272

untuk mendeteksi ​rtxA dari ​V.cholerae (Xu et al., 2019; Rivera et al., 2001). Namun, ketika diuji
menggunakan ​in silico PCR dalam penelitian ini, primer gagal untuk memperkuat gen ​rtxA dari strain kolera
LMA3984-4 meskipun dapat menghasilkan amplikon 977 bp dengan strain kolera lainnya. Jika sepasang
primer secara teoritis gagal untuk memperkuat urutan DNA yang ditargetkan dalam PCR ​in silico,​ maka
mereka kemungkinan besar gagal untuk memperkuat urutan yang sama dalam PCR in vitro.
Dalam penelitian ini, potensi gen rtxA sebagai DNA biomarker DNA untuk ​V. cholera diuji dengan
melakukan uji PCR ​in silico​. Untuk membuktikan hipotesis, 5 pasang primer berhasil dirancang
menggunakan perangkat lunak Primer3Plus berbasis web menggunakan ​rtxA sekuens gen lengkap-panjang
dari ​V. cholerae O1 biovar El Tor str. N16961. Di antara 5 pasang primer yang diperoleh, sepasang primer
baru (pasangan 1 berdasarkan Tabel 1) dinamai RtxAOF-RtxAOR: '5-CGCAAAACAGTTTCAGCCGA-3'
dan 5'-AGGTTGGTCTTTTTGTGGCCA-3 dipilih berdasarkan jepit rambut dan kesesuaian diri lainnya.
hasil tes. Selain itu, primer spesifik yang baru dirancang dan dipilih, RtxAOF-RtxAOR, mampu memperkuat
secara selektif bagian internal dari fragmen gen ​rtxA dari semua sekuens genomik dari ​V. cholera,​ tetapi
tidak dengan vibrios lainnya. Penting juga untuk menggarisbawahi bahwa uji PCR in silico yang
dikembangkan dalam penelitian ini untuk rtxA dapat mengidentifikasi strain ​V. cholerae yang memproduksi
RtxA,​ tidak hanya dari O1, tetapi juga serogrup non-O1. Hasil kami menyimpulkan bahwa:
1. Gen ​rtxA adalah biomarker untuk ​Vibrio cholera,​ yang membedakan spesies bakteri yang menular dari
vibrios lainnya. Sebagai biomarker bakteri, gen ​rtxA berpotensi bermanfaat untuk memfasilitasi
diagnosis cepat infeksi koleral.
2. RtxAOF-RtxAOR yang baru dirancang berpotensi untuk digunakan sebagai primer untuk mendeteksi
keberadaan ​V. cholera​ dalam sampel bakteri menggunakan PCR in vitro.

KESIMPULAN
Berdasarkan pada uji PCR ​in silico yang dilakukan dalam penelitian ini, gen ​rtxA secara
teoritis terbukti sebagai biomarker DNA dari bakteri patogen hasil laut ​Vibrio cholera​, yang dapat digunakan
untuk membedakannya dari spesies vibrio lainnya. Primer yang baru dirancang dirancang dari gen
mengandung potensi sebagai komponen PCR in vitro untuk memfasilitasi diagnosis cepat awal infeksi
koleral.

PENGANTAR

Karya ini merupakan bagian dari hasil kolaborasi antara 2 institusi, Universitas Muhammadiyah
Semarang dan Pusat Penelitian untuk Pengolahan dan Bioteknologi Produk Kelautan dan Perikanan,
Kementerian Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia.
.
REFERENSI

Bikandi, J., Millán, R. S., Rementeria, A., & Garaizar, J. (2004). In silico analysis of complete bacterial
genomes: PCR, AFLP–PCR and endonuclease restriction. ​Bioinformatics,​ ​20​(5), 798-799.
Bonnin-Jusserand, M., Copin, S., Le Bris, C., Brauge, T., Gay, M., Brisabois, A., ... & Midelet-Bourdin, G.
(2019). Vibrio species involved in seafood-borne outbreaks (​Vibrio cholerae,​ ​V. parahaemolyticus and
V. vulnificus​): Review of microbiological versus recent molecular detection methods in seafood
products. ​Critical reviews in food science and nutrition​, ​59​(4), 597-610.
Cheng, C., Zhou, Y., Kan, B., Wang, Q., & Rui, Y. (2014). Construction and characterization of a Vibrio
cholerae serogroup O139 vaccine candidate by genetic engineering. ​Molecular medicine reports,​ ​9(​ 6),
2239-2244.
Chow, K. H., Ng, T. K., Yuen, K. Y., & Yam, W. C. (2001). Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae
by PCR. ​Journal of clinical microbiology,​ ​39(​ 7), 2594-2597.
 Squalen Bull.of Mar. & Fish.Post.& Biotech.

Davis, B. M., Moyer, K. E., Boyd, E. F., & Waldor, M. K. (2000). CTX prophages in classical biotype
Vibrio cholerae: functional phage genes but dysfunctional phage genomes. ​Journal of
bacteriology,​ ​182(​ 24), 6992-6998.
Ethica, S. N. (2014). ​Detection of genes involved in glycerol metabolism of Alcaligenes ​sp. JG3 (Doctoral
dissertation, Universitas Gadjah Mada).
Ethica, S. N., Hammi, M. K., Lestari, P., Semiarti, E., Widada, J., & Raharjo, T. J. (2013). Amplification of
Azospirillum sp. JG3 ​glpd gene fragment using degenerate primers generated by web-based tools. ​The
Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences,​ ​3(​ 3), 231.
Ethica, S. N., Semiarti, E., Widada, J., Oedjijono, O., & Joko Raharjo, T. (2017). Characterization of moaC
and a nontarget gene fragments of food​-b​ orne pathogen ​Alcaligenes sp. JG3 using degenerate colony
and arbitrary PCRs. ​Journal of food safety​, ​37​(4), e12345.
Ethica, S. N., Sulistyaningtyas, A. R., & Darmawati, S. (2019, June). ​In-silico Specificity Comparison
between GMF-GMR and JMF-JMR Primers for Detecting ​moaC Genes of Food Spoilage Bacteria
Pseudomonas spp. In ​IOP Conference Series: Earth and Environmental Science​ (Vol. 292, No. 1, p.
012033). IOP Publishing.
Iwamoto, M., Ayers, T., Mahon, B. E., & Swerdlow, D. L. (2010). Epidemiology of seafood-associated
infections in the United States. ​Clinical microbiology reviews,​ ​23(​ 2), 399-411.
Lin, W., Fullner, K. J., Clayton, R., Sexton, J. A., Rogers, M. B., Calia, K. E., ... & Mekalanos, J. J. (1999).
Identification of a Vibrio cholerae RTX toxin gene cluster that is tightly linked to the cholera toxin
prophage. ​Proceedings of the National Academy of Sciences​, ​96​(3), 1071-1076.
Pradhan, S., Baidya, A. K., Ghosh, A., Paul, K., & Chowdhury, R. (2010). The El Tor biotype of Vibrio
cholerae exhibits a growth advantage in the stationary phase in mixed cultures with the classical
biotype. ​Journal of bacteriology,​ ​192​(4), 955-963.
San Millán, R. M., Martínez-Ballesteros, I., Rementeria, A., Garaizar, J., & Bikandi, J. (2013). Online
exercise for the design and simulation of PCR and PCR-RFLP experiments. ​BMC research notes,​ ​6​(1),
513.
Untergasser, A., Nijveen, H., Rao, X., Bisseling, T., Geurts, R., & Leunissen, J. A. (2007). Primer3Plus, an
enhanced web interface to Primer3. ​Nucleic acids research​, ​35​(suppl_2), W71-W74.
Xu, M., Wu, J., & Chen, L. (2019). Virulence, antimicrobial and heavy metal tolerance, and genetic diversity
of Vibrio cholerae recovered from commonly consumed freshwater fish. ​Environmental Science and
Pollution Research​, ​26​(26), 27338-27352.