ACARA I (PENGENALAN LABORATORIUM DAN STERILISASI)

i. Tujuan
Mengenalkan ruangan laboratorium kultur jaringan kepada mahasiswa serta
kegunaannya.

ii. Dasar Teori

Kultur jaringan merupakan teknik untuk menumbuhkembangkan bagian tanaman
baik berupa sel, jaringan ataupun organ dalam keadaan aseptik secara in vitro, yang
ditandai dengan kondisi kultur aseptik, penggunaan media buatan yang
mengandungan nutrisi lengkap, Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) serta kondisi ruang
kultur, suhu dan pencahayaan yang terkontrol. Kultur jaringan didasarkan pada
prinsip totipotensi sel. Menurut prinsip tersebut, sebuah sel atau jaringan tumbuhan
yang diambil dari bagian manapun, akan dapat tumbuh menjadi tumbuhan sempurna
jika ditumbuhkan dalam media yang cocok (Bustami, 2011).
Berhasilnya kultur jaringan banyak ditentukan oleh media tanam yang di
pengaruhi oleh beberapa faktor lingkunan, salah satunya yaitu pH, cahaya,
temperatur, sterilisasi, dan pemilihan eksplan. Faktor lain yang mempengaruhi
pembelahan yang menyebabkan faktor genetik lebih dominan terhadap pembelahan
tunas dan akar. Media tanam pada kultur jaringan berisi kombinasi dari asam amino
esensial, garam-garam anorganik, vitamin-vitamin, larutan buffer, dan sumber energi
(glukosa). Media berbahan dari agar biasanya ditambahkan untuk mendapatkan media
yang berbentuk semi padat, fungsinya adalah untuk meletakkan dan membenamkan
eksplan suatu tanaman (Puspita, 2017).
Di dalam memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan
peralatan. Ukuran ruang yang diperlukan dapat disesuaikan dengan volume aktivitas
kultur jaringan yang akan dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk kegiatan kultur
jaringan yaitu laboratorium yang ideal yang memiliki: 1.) Ruang persiapan yang di
dalamnya terdapat timbangan analitik, lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven,
pH meter, alat-alat gelas standar (labu takar, pipet volume, erlenmeyer, gelas piala,
batang pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), alat untuk mencuci (washtaple),
 lemari untuk alat dan bahan kimia, sentrifuse, fumehood, destilator, dan kereta
dorong; 2.) Ruang transfer yang di dalamnya terdapat laminar air flow, dissecting,
mikroskop, alat diseksi, lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, dan timbangan
kecil. 3.) Ruang kultur yang dilengkapi dengan rak kultur dan lampu fluorescent,
timer untuk mengatur lama penyinaran, AC untuk mengontrol temperatur, mikroskop
binokuler, dan shaker. (Barahima, 2011).

iii. Daftar Pustaka

Barahima Abbas, 2011. Prinsip Dasar Teknik Kultur Jaringan. Alfabeta. Bandung.

Bustami, M. U. (2011). Penggunaan 2,4-D Untuk Induksi Kalus Kacang Tanah.

Media Litbang Sulteng, IV(2), 137-141.

Puspita, A. (2017). Potensi Biosida Ekstrak Akar dan Batang Pisang Kepok Untuk
Pertumbuhan Biji Kacang Hijau Secara In Vitro. Skripsi Pendidikan Biologi UMS pp.
1-13.
ACARA II (PENGENALAN ALAT DAN STERILISASI)

1. Tinjauan Pustaka (diringkas lagi)

Sterilisasi merupakan tehnik membersihkan dan membebaskan suatu benda dari
segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi adalah
tahap kunci keberhasilan dalam metode kultur jaringan. Sterilisasi ini meliputi sterilisasi
ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi eksplan. (Edhi
Sandra, 2013)
a. Sterilisasi Ruang
Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang
digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. terilisasi ruangan dilakukan dengan
menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang dibasahi
dengan alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang ruang
inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi ruang,
dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta
dimatikan saat masuk dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).
b. Sterilisasi Alat Inokulasi
Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan laminar
sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan alkohol 70%.
Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan juga dinyalakan
selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan laminar. Hal
serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau inokulasi. Laminar
harus tetap dijaga kebersihannya.
c. Sterilisasi Alat dan Media
Alat-alat logam dan gelas yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat
disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan dengan autoclave
pada temperatur 121oC dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi
bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat- alat seperti pinset dan scalpel selain
disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas api bunsen.
Botol-botol yang akan 8 disterilisasi sebelumnya ditutup dengan aluminium foil atau
 plastik dan diikat dengan karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama 30
menit.
d. Sterilisasi Eksplan
Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat berupa
organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan, misalnya :
daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung pada jenis
tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya, umur
tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan), musim
saat pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi eksplan
adalah mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan eksplannya
(Edhi Sandra, 2013).
Peralatan yang mutlak dimiliki untuk memulai melakukan kegiatan kultur jaringan
yaitu: timbangan analitik, destilator, pH meter, autoclaf, laminar air flow, dan gelas-
gelas standar. Peralatan ini kemungkinan dapat menimbulkan resiko pada pemakainya
atau menimbulkan kerusakan apabila salah prosedur dalam mengoperasikannya.
(Barahima, 2011).
Di dalam memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan
peralatan. Ukuran ruang yang diperlukan dapat disesuaikan dengan volume aktivitas
kultur jaringan yang akan dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk kegiatan kultur
jaringan yaitu laboratorium yang ideal yang memiliki: 1.) Ruang persiapan yang di
dalamnya terdapat timbangan analitik, lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven, pH
meter, alat-alat gelas standar (labu takar, pipet volume, erlenmeyer, gelas piala, batang
pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), alat untuk mencuci (washtaple), lemari untuk
alat dan bahan kimia, sentrifuse, fumehood, destilator, dan kereta dorong; 2.) Ruang
transfer yang di dalamnya terdapat laminar air flow, dissecting, mikroskop, alat diseksi,
lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, dan timbangan kecil. 3.) Ruang kultur yang
dilengkapi dengan rak kultur dan lampu fluorescent, timer untuk mengatur lama
penyinaran, AC untuk mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker.
(Barahima, 2011).
Autoklaf adalah alat pemanas tertutup yang fungsinya untuk mensterilkan suatu
benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi biasanya suhu yang digunakan
 121°C dan bertekanan 15 kg/cm2 yang dilakukan selama kurang lebih 15 menit.
Keunggulan autoklaf adalah dapat mensterilkan alat dan bahan hingga tidak ada
organisme yang hidup lagi. Autoklaf memerlukan waktu yang singkat untuk sterilisasi.
Autoklaf menggunakan suhu dan tekanan tinggi sehingga memberikan kekuatan yang
lebih besar untuk membunuh sel dibandingkan dengan udara panas biasa. Autoklaf
memiliki kelebihan yaitu alat perebus yang  bertekanan tinggi. Kekurangan autoklaf
adalah harus menggunakan air mendidih karena uapnya memenuhi kompartemen
autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Autoklaf membutuhkan sumber panas
yang terus menerus. Autoklaf membutuhkan peralatan yang butuh perawatan terus
menerus (Permatasari dkk, 2013)

2. Daftar Pustaka
Barahima Abbas, 2011. Prinsip Dasar Teknik Kultur Jaringan. Alfabeta. Bandung,

Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. IPB Press.

Permatasi, dkk., 2013. Uji Pembuatan Marning Jagung dengan Menggunakan Autoclave
. Jurnal Keteknikan Pertanian Tropis dan Biosistem. Vol. I. No.1
ACARA III (PEMBUATAN MS DAN ALAMI)

1. Tinjauan Pustaka
Media merupakan tempat jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang
mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang
diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan
media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan
gel, seperti agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air (Mahmoud, 2013).
Bahan-bahan yang diperlukan dan biasa digunakan dalam metode kultur jaringan
adalah media MS (Murashige and Skoog), yang terdiri dari makronutrien, mikronutrien,
vitamin, iron, zat pengatur tumbuh (ZPT), myoinositol, sukrosa dan agar. Bahan-bahan
seperti makronutrien, mikronutrien, vitamin, zpt, dan iron biasanya dibuat dalam bentuk
larutan stok (media yang lebih pekat), sehingga pada saat akan membuat media, cukup
mengambil larutan stok yang sudah dibuat. Pembuatan stok bertujuan untuk
mempermudah dibandingkan setiap kali membuat media harus menimbang (Edhi Sandra,
2013).
Media MS (Murashige & Skoog) merupakan salah satu formula yang digunakan
untuk hampir semua macam tanaman pada teknik kultur jaringan. Media MS
mengandung garam-garam mineral dalam jumlah yang tinggi dan senyawa N dalam
bentuk NO3- dan NH4+. Pada media juga ditambahkan zat pengatur tumbuh yang
diperlukan bagi pertumbuhan dan diferensiasi eksplan. Ada 2 jenis hormon tanaman yang
sekarang banyak dipakai dalam propagasi secara in vitro, yaitu auksin dan sitokinin
(Herawan, 2015).
Media tanam yang termasuk dalam kategori bahan organik
u m u m n y a  berasal dari komponen organisme hidup antara lain1 daun, batang, bunga,
akar,dan kulit tanaman. penggunaan media bahan organik sudah menyediakan
cara bagi tanaman. Selain itu bahan organic mempunyai pori-pori makro dan mikroyang
hampir seimbang sehingga sirkulasi udara yang dihasilkan cukup banyak  dan daya
serap air yang tinggi. untuk meningkatkan budidaya tersebut diperlukan pemeliharaan yang
 benar, salah satunya dengan menggunakan media organic yangdapat memenuhi unsur hara
yang dibutuhkan tanaman. Media organi% yang seringdipakai antara lain, arang kayu, arang
sekam, moss, dan cocopeat (Rossa, 2011).

2. Daftar Pustaka
Mahmound, O., & Kosar, M. (2013). Regeneration and Histological of plants Derived
From Leaf Explants In Vitro Culture of Strawberry. Agricultural Biotechnology Research
Institute of Iran.

Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. IPB Press.

Herawan, T., Na'iem, M., Indrioko, S., & Indrianto, A. (2015). Kultur Jaringan Cendana
(Santalum album L.) Menggunakan Eksplan Mata Tunas. Jurnal Pemuliaan Tanaman
Hutan, 9(3), 177-188.

ACARA IV (BUDIDAYA EMBRIO)

ACARA V (INDUKSI KALUS)
1. Tinjauan Pustaka
Pertumbuhan kalus terbagi menjadi 5 fase, yaitu : 1) fase lag, dimana sel-sel mulai
membelah, 2) fase eksponensial, dimana laju pembelahan sel mengalami perlambatan
tetapi laju ekspansi sel meningkat, 4) fase deselerasi, dimana laju pembelahan dan
pemanjangan sel menurun, 5) fase stationer, dimana jumlah dan u
kuran sel tetap. (Luqman, 2012).
Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin
endogen Secara in-vitro (Dewi et al.,2012). Pembentukan dan pertumbuhan kalus dipengaruhi
oleh beberapa faktor, diantaranya komposisi media tumbuh.Setiap jenis tanaman memiliki
respons yang berbeda terhadap zat pengatur tumbuh yang diberikan (Lina et al., 2013).

ACARA VI (ORGANOGENESIS)

1. Tinjauan Pustaka

ACARA VII (SUB KULTUR)

ACARA VIII (AKLIMATISASI)
1. Tinjauan Pustaka
Aklimatisasi adalah proses pengkondisian planlet atau tunas mikro (jika
pengakaran dilakukan secara ex-vitro) di lingkungan baru yang aseptik di luar botol,
dengan media tanah, atau pakis sehingga planlet dapat bertahan dan terus menjadi bibit
yang siap ditanam di lapangan. Dalam kata lain, aklimatisasi merupakan kegiatan
memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptik ke lahan budidaya (Koeswianti, 2013).
Tahapan ini dilakukan agar tanaman yang sebelumnya ditumbuhkan dalam botol
kultur dengan suplai media lengkap tetap dapat bertahan hidup secara mandiri dan
berfotosintesis pada kondisi lingkungan eksternal (Yosepa et al., 2012). Menurut Nova
dan Sitti Fatimah (2012) keberhasilan aklimatisasi planlet sungkai dipengaruhi oleh cara
penanganan saat pengeluaran plantlet dari botol kultur, media tumbuh saat di rumah kaca
(harus steril) dan lingkungan mikro plantlet (disungkup selama 2 minggu sampai muncul
daun baru).

2. Daftar Pustaka
Koeswianti, T. 2013. Biologi Kultur Jaringan, Bahan Ajar Kuliah Bioteknologi Fakultas
Pertanian Universitas Hasanuddin.

Nova Kristina dan Sitti Fatimah. 2012. Induksi Perakaran dan Aklimatisasi Tanaman
Tabat Barito Setelah Konservasi In Vitro Jangka Panjang. Bl. Littro. Vol. 23 No. 1, 11 –
20

Yosepa, T., C. Siregar, E. Gusmayanti. 2012. Pengaruh penggunaan jenis media terhadap
aklimatisasi anggrek Dendrobium sp. (hibrida). J. Sains Mahasiswa Pertanian. 2(2): 1-2.