Kisman
6/6/2021 1
Tanaman Transgenik
6/6/2021 2
Global Area (Million Hectares) of Biotech
Crops, 1996 to 2004: Industrial and Developing
Countries
90
80
Total
70 Industrial
60 Developing
50
40
30
20
10
0
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
6/6/2021 3
Source: Clive James, 2004
Global Area of Biotech Crops in 2003 and 2004:
Industrial and Developing Countries
(Million Hectares)
Industrial
47.3 70 53.4 66 6.1 +13
Countries
Developing
20.4 30 27.6 34 7.2 +35
Countries
6/6/2021 4
Global Area (Million Hectares) of Biotech
Crops, 1996 to 2004: by Crop
60
Soybean
50
Maize
Cotton
40 Canola
30
20
10
0
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
6/6/2021 5
Source: Clive James, 2004
Global Area (Million Hectares) of Biotech Crops,
1996 to 2004: by Trait
70
Herbicide Tolerance
60
Insect Resistance
50 Herb Tolerance/Insect
resistance
40
30
20
10
0
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
6/6/2021 6
Source: Clive James, 2004
Global Adoption Rates (%) for Principal
Biotech Crops (Million Hectares), 2004
160
143
140
Non-transgenic
120
Transgenic
100 86
80
60
40 32
23
20
6/6/2021 8
Source: Clive James, 2004
Potensi Kerugian
Tanaman Transgenik
• Efek balik terhadap organisme non-target,
• Pembentukan hama resisten,
• Transfer gen yang tidak diinginkan yang
meliputi transfer gen ke tanaman liar sejenis,
• Transfer gen penyandi untuk produksi gen
toksik, dan
• Transfer gen resisten antibiotik melalui gen
penanda (marker) antibiotik. Tanaman Monster
6/6/2021 9
Peningkatan Kualitas Bahan Tanam
• peningkatan kualitas
pangan,
• resistensi terhadap
hama atau penyakit,
• toleransi terhadap stress
lingkungan, dan
• manajemen budidaya
(Huttner, 2003).
Contoh:
• ‘Golden Rice’ • Tanaman toleran herbisida
• Jagung Bt dan Kapas Bt
• Tanaman tahan cekaman Al dan
kekeringan
6/6/2021 10
6/6/2021 11
6/6/2021 12
6/6/2021 13
6/6/2021 14
6/6/2021 15
6/6/2021 16
6/6/2021 17
6/6/2021 18
6/6/2021 19
6/6/2021 20
6/6/2021 21
Rekayasa tanaman toleran defisit air
6/6/2021 22
Plasma Nutfah Tanaman
Tahapan in vitro
Induksi kultur embrio somatik
(ES) sebagai eksplan
Transformasi genetika:
Induksi gen P5CS menggunakan Agrobacterium, dilanjutkan
regenerasi tanaman transgenik dari sel transgenik T0 gen P5CS
6/6/2021
SKEMA STRATEGI MEREKAYASA TANAMAN TOLERAN KEKERINGAN 23
• Rekayasa genetik pada level faktor transkripsi cukup
menjanjikan untuk perbaikan toleransi tanaman thd
stress kekeringan, karena hampir semua faktor
transkripsi yang terkait stres berfungsi meregulasi gen-
gen target (regulated genes) yang produknya
berkontribusi thd toleransi thd sres.
• Contoh, over ekspresi CBF1, DREB1a dan CBF4
meningkatkan toleransi kekeringan / suhu rendah pada
tanaman Arabidopsis. Over ekspresi zinc finger dari
transcription factor (SCOF-1 dari tanaman kedelai)
meningkatkan toleransi thd suhu dingin pada tembakau
dan toleransi freezing pada tanaman Arabidopsis.
6/6/2021 24
• Telah dihasilkan padi transgenik toleran kekeringan
menggunakan protein homeodomain-leucine zipper (HD-
Zip).
• HD-Zip pada tanaman dicirikan dengan adanya DNA-
binding homeodomain yang terkait erat dgn motif
leucine-zipper, yang berfungsi dalam pembentukan
dimer.
• Ekspresi drought-responsive HD-Zip meliputi gen Athb-
6, Athb-7 dan Athb-12 dari tanaman Arabidopsis yang
diinduksi oleh stres dehidrasi atau ABA (asam absisat).
• Varietas padi yang digunakan Nipponbare dan Rojolele.
Konstruksi gen menggunakan strong promoter CaMV
35S dan gen reporter GUS.
• Diperoleh varietas Rojolele dan cv Nipponbare yang
toleran kekeringan
6/6/2021 25
Transformasi kopi robusta (Coffea
canephora) dengan gen kitinase
melalui Agrobacterium
tumefaciens LBA4404
Siswanto et al. 2003
26
• Bahan
– Eksplan kalus embriogenik dari eksplan daun kopi robusta
klon BP308.
– Vektor pCAMBIA1301 yang mengandung gen hptII dan
gen gus dan telah disisipi gen CHI (Gambar 1).
– Bakteri Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
• Medium seleksi:
– MS (Murashige & Skoog, 1962) yang dilengkapi dengan
vitamin B5 (Gamborg et al., 1968), 30 g/L sukrosa dan 2
mg/L gelrite + antibiotik higromisin konsenrasi tertentu .
27
28
• Kultur A. tumefaciens:
– A. tumefaciens yang mengandung pCAMBIA1301
ditumbuhkan pada medium LB yang mengandung 50 mg/L
kanamisin dan 50 mg/L rifampisin dan diinkubasi semalam
pada incubator shaker berkecepatan 150 rpm dengan
suhu 280C.
– Dilakukan pengenceran 1:3 dengan medium LB, kultur
diinkubasi kembali pada kondisi yang sama selama 3 jam.
– Kemudian campuran disentrifugasi dengan kecepatan
5000 rpm selama 10 menit.
– Pelet bakteri dipisahkan dari suspensi, kemudian
dilarutkan dalam 20 mL medium ½ MS cair yang
mengandung 5 mg/L BAP dan 100 mg/L asetosiringon.
Campuran tersebut siap digunakan untuk transformasi.
29
• Transformasi dan regenerasi planlet transforman
– Transformasi gen CHI ke dalam kalus embriogenik dg pengocokan eksplan
dalam suspensi A. tumefaciens kecepatan 60 rpm 30 menit.
– Setelah 3 hari ko-kultivasi pada medium MS + asetosiringon tingkat
konsentrasi tertentu, eksplan dicuci 3x dengan air steril, kmd 1x larutan 300
mg/L sefotaksim.
– Eksplan yang telah ditransformasi dipindahkan ke medium selektif yang
mengandung 300 mg/L sefotaksim dan higromisin.
– Pengamatan dilakukan terhadap eksplan yang tumbuh pada tiap medium
seleksi.
– Eksplan yang hidup pada medium seleksi dipindahkan ke medium
regenerasi yaitu medium ½ MS yang mengandung vitamin B5, 30 g/L
sukrosa dan 2 g/L gelrite.
– Untuk menginduksi pembentukan ES, ke dalam medium ditambahkan
kombinasi zat pengatur tumbuh 5 mg/L BAP dengan konsentrasi IAA
tertentu.
– Pengamatan persentase eksplan kalus yang membentuk ES dan rata-rata
ES yang terbentuk per eksplan kalus.
– Untuk regenerasi planlet, ES yang sudah mencapai fase kotiledon dipindah
ke medium ½ MS tanpa zat pengatur tumbuh.
– Pengamatan persentase ES yang berkecambah, planlet yang terbentuk,
planlet yang berakar dan tinggi rata-rata planlet.
30
31
32
Pengujian ekspresi gen GUS menggunakanlarutan X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-glucoronide)
33
Integrasi transgen dalam tanaman dianalisis dengan PCR menggunakan
primer CHI : 5’-GGGACCCATCCAGATCACCT-3’ dan 5’-GGTAGGGCCT
CTGGTTGTAC-3’.
Elektroforesis
34
Transformasi Padi dengan
Bombardmen
Mikroprojektil
Ida H. Somantri, A. Dinar Ambarwati, Iswari
S. Dewi, Aniversari Apriana, dan Tri J.
Santoso
35
Transformasi Padi dengan Bombardmen
Mikroprojektil (Somantri et al., 2003)
• Penelitian bertujuan untuk mendapatkan tanaman padi
transgenik yang tahan terhadap hama penggerek batang padi.
• Transformasi dilakukan dengan teknik bombardmen
mikroprojektil menggunakan plasmid pUBB dan pUBC yang
dikotransformasi dengan plasmid pRQ6.
• prosedur penembakan menggunakan partikel emas yang telah
dioven semalam pada suhu 180°C dan isopropanol untuk
preparasi DNA plasmid
• Plasmid pUBB dan pUBC masing-masing membawa gen
ketahanan terhadap penggerek batang padi yang disebut cry IAb
dan cry IAc.
• Sedangkan pRQ6 mengandung gen penanda gus dan
penyeleksi higromisin.
• medium regenerasi RNB (NB + BAP 4 mg/l + NAA 0,8 mg/l) dan
NK1N0,5 (NB + Kinetin 1 mg/l + NAA 0,5 mg/l) yang dapat
menghasilkan planlet dari kalus hasil transformasi
36
Figure 1. Gene structure.
(A) Schematic structure of the CIG-B genome. Box region represents ORF including NLS motif
(stripe) and ERF/AP2 DNA binding domain (white).
B) Constructs for transformation of tobacco (pSMAK-CIGBpro::GFP) and particle bombardment
assay (p35S::CIGB390-GFP). 35S, CaMV 35S promoter; LB, left border of T-DNA; RB, right
border of T-DNA; GFP, green fluorescence protein
(C) Comparison of the 5-upstream sequences between CBF2/DREB1C and CIG-B. Regions
designated ICEr1 and ICEr2 are boxed. Stars represent identical sequences.
37
Transformasi gen P5CS pada tanaman kacang
tanah dan regenerasi tanaman transgenik
• Prosedur transformasi:(Riduan, 2007)
– Introduksi gen P5CS dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens
– Di potong kecil-kecil eksplan embrio somatik, diletakkan di media
transformasi, tuang suspensi bakteri sampai kalus terendam
– Eksplan yg sdh diinokulasi dipindah ke media regenerasi (MR) (MS-16)
dan dikokultivasi 2 hari dengan suhu 24-25oC kondisi cahaya 16 jam.
– Ekspan dicuci dalam media MS cair + antibiotik cefotaxime 300 mg/l
kmdn ditanam pd media MR selektif + cefotaxime 300 mg/l
– Embrio berbentuk terpedo dipindah dalam media MSC (media MS-0
dan 3 g/l Charcoal) selama 2-4 minggu
– Planlet diakarkan dalam media MS + NAA (10 mg/l) selama 1 minggu.
– Planlet dipelihara dalam media MSC sampai diperoleh tanaman
lengkap.
– Aklimatisasi dengan memindahkan planlet ke media greenleaf pada plot
plastik di ruang kultur selama 2 minggu serta diberi cahaya terus
menerus.
– Bibit dipindah ke rumah kaca dan dipelihara selama 2 minggu. Minggu
ke 4 bibit dipindah ke polybag berisi kompos:pasir (1:1) dan dipelihara
sampai menghasilkan benih.
38
Integrasi gen P5CS ke dalam genom
tanaman tembakau (Sudarsono et al., 1996)
• Prosedur transformasi:
– Introduksi gen P5CS dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens
– Di potong kecil-kecil daun tembakau, direndam dalam suspensi
Agrobacterium selama 15 menit
– Ditanam dalam media MS + BAP 0.5 mg/l dan agar-agar 8 g/l.
– Kokultivasi jaringan eksplan dan Agrobacterium dalam medium MR
selama 2-3 hr
– Eksplan potongan daun dicuci dengan media MS cair + antibiotik
cefotaxime 300 mg/l kmdn ditanam pd media MS-0 + antibiotik
cefotaxime 300 mg/l g/l dan kanamisin 100 mg/l (MR selektif)
– Setelah ditanam dalam MR selektif selama 1-2 bulan tunas mulai
tumbuh dari eksplan.
– Setelah mencapai 5 cm, planlet ditanam pada pot plastik berisi media
campuran kompos:pasir (1:1) steril, diaklimatisasi selama 2 minggu.
– Selanjutnya tembakau T0 dipindahkan ke polybag media
tanah:kompos:pasir (2:1:1) dipelihara di rumah kaca hingga
menghasilkn benih
• Analisis ekspresi gen P5CS
– Menggunakan total nucleic acid PCR dengan primer spesifik untuk gen
P5CS 39
TRANSGENIC BREEDING FOR DROUGHT TOLERANCE
contoh pada tanaman padi
40
6/6/2021 41
6/6/2021 42
6/6/2021 43
6/6/2021 44
Merekayasa tanaman gandum toleran frost
menggunakan gen master switch
6/6/2021 45
• Menggunakan promoter dengan cis acting elemen dari
low-temperature-responsive gene: C-repeat/dehydration-
responsive element (DRE).
• Elemen ini mempunyai 5-bp core sequence CCGAC,
yang merupakan bagian dari low temperature dan
dehydration-regulated gene.
• Elemen ini akan binding dengan C-repeat/DRE binding
factor (CBF1).
• Tanaman transgenik yang over ekspresi CBF1
menunjukkan toleransinya thdp frost.
• CBF1 merupakan master switch, terbukti promoter dari
gen wcs120 mengandung dua C-repeat/DREs dan
menunjukkan low-temperature responsiveness.
6/6/2021 46
6/6/2021 47
6/6/2021 48
6/6/2021 49
6/6/2021 50
Merekayasa tanaman toleran
osmotic stress
6/6/2021 51
6/6/2021 52
6/6/2021 53
6/6/2021 54
6/6/2021 55
6/6/2021 56
6/6/2021 57
6/6/2021 58
6/6/2021 59
6/6/2021 60
6/6/2021 61
6/6/2021 62
6/6/2021 63
6/6/2021 64
6/6/2021 65
6/6/2021 66
6/6/2021 67
6/6/2021 68
6/6/2021 69
Pembentukan Buah Partenokarpi
melalui Rekayasa Genetika
Saptowo Jumali Pardal
Buletin AgroBio 4(2):45-49
(2001)
6/6/2021 70
• Pendekatan I melalui penggunaan gen yang bersifat
merusak sel (cytotoxic), yang menghasilkan senyawa
toksik terhadap sel-sel embrio/biji sehingga menghambat
bahkan merusak perkembangan embrio/biji.
Pertumbuhan buah tetap berlangsung, tetapi tidak
menghasilkan biji.
– Contoh, gen barnase diisolasi dari bakteri Bacillus
amyloliquefaciens atau kombinasi gen sitotoksik, misalnya gen
iaaM dan iaaH. Kombinasi ekspresi dua gen ini akan merubah
triptofan menjadi IAA melalui senyawa indoleacetamide. Kadar
IAA tinggi bersifat toksik thdp sel-sel biji atau embrio tanaman.
• Pendekatan II melalui ekspresi senyawa IAA pada
bagian bakal buah (ovary). Tomes et al. (1996a) telah
berhasil menginduksi buah partenokarpi melalui
penggunaan gen giberelin, giberellin 20-oxidase yang
diekspresikan pada bagian serbuk sari sebelum polinasi
(di bawah kontrol promoter spesifik bagian polen).
6/6/2021 71
• Li (1997) berhasil menggunakan gen pengkode auksin, giberelin
atau sitokinin (iaaM, iaaH atau ipt) dari Agrobacterium tumefaciens
di bawah kontrol sequen regulator spesifik bagian ovary.
• Gen iaaM mengkode senyawa triptofan 2-monooxigenase yang
akan merubah triptofan menjadi indoleacetamide (IAM), lalu menjadi
indole acetic acid (IAA) dan amonia menggunakan promoter GH3
dari kedelai atau AGL5 (Agamous-like 5) dari Arabidopsis atau
PLE36 dari tembakau. GH3 merupakan promoter inducible auksin di
bagian ovary, AGL5 spesifik pada perkembangan karpela dan PLE
36 spesifik untuk ovary.
• Rotino et al. (1997) berhasil menggunakan promoter bagian
regulator defh9 (deficiens homologue 9) dari Antirrhinum majus
untuk mengekspresikan gen iaaM (pengkode IAA) dari
Pseudomonas syringae pv savastanoi pada bagian plasenta dan
bakal biji. Gen kimerik defh9-iaaM (Gambar 1) ini telah berhasil
menginduksi buah partenokarpi pada beberapa tanaman dari famili
Solanaceae seperti terung, tembakau, dan tomat.
6/6/2021 72
Rekayasa komposisi protein
tanaman untuk menaikkan gizi
6/6/2021 73
• Meningkatkan gizi (nutrisi)
– Beberapa sifat kualitas yang ditargetkan untuk
perbaikan nutrisi : karbohidrat, protein, lemak,
vitamin, Fe, dan asam amino. Contoh: padi
transgenik “golden rice”, yang mengandung beta-
carotene, untuk mengatasi kekurangan vitamin A.
– Merubah komposisi asam lemak sehingga kandungan
polyunsaturated (e.g. linoleic acid) dikurangi
sementara kandungan mono-unsaturated (e.g. oleic
acid) ditingkatkan sehingga sehingga tidak diperlukan
hidrogenasi dan menghindari asam lemak yang tidak
diinginkan.
– Jumlah asam amino ensensial seperti lysine,
methionine, threonine, dan tryptophan dapat
ditingatkan untuk menambah kualitas nutrisi biji
tanaman serealia. Tanaman transgenik juga dibuat
untuk meningkatkan rasio amilose dengan
amilopektin.
6/6/2021 74
• Lysine dan methionine merupakan asam amino
esensial yg cukup penting
• Biji tanaman sereal umumnya rendah lysine
kaya methionenine, sementara tanaman legum
kurang methionine kaya lycine
• Sunarpi (2002) berhasil membuat kedelai
transgenik kaya sistein dan metionin dgn
memasukkan gen albumin yang diisolasi dari
bunga matahari lokal dengan bantuan PCR
dengan primer spesifik yang didesain dari full
length sequence SFA8.
6/6/2021 75
GEN YANG TELAH BERHASIL DIINTRODUKSI KE
DALAM GENOM TANAMAN PADI MENGGUNAKAN
TRANSFORMASI AGROBACTERIUM
6/6/2021 80
• Metode seleksi keberadaan transgen:
menggunakan gen-gen seleksi: neomycin
phosphotransferase (nptII), hygromycin
phosphotransferase (hph), phosphinothricin
acetyltransferase (pat).
• Gen nptII memberi ketahanan thdp antibiotik
aminoglycoside seperti kanamycin, gen hph
thdp antibiotik hygromycin dan gen pat thdp
phosphinothricin herbisida.
• Metode lain didasarkan atas visible reaction,
seperti luciferase dan β- glucuronidase.
6/6/2021 81
• Untuk meningkatkan kandungan amilosa
– Konstruksi beberapa gen inverted repeat: BEI, BEII dan R1
ditransformasikan menggunakan particle bombardment ke
friable embryogenic callus (FEC) kasava cultivar Adira 4 dan
TMS60444 menggunakan particle bombardment untuk membuat
tanaman transgenik dengan kandungan amilosa tinggi.
• Untuk meningkatkan kandungan amilopektin
– Gen inverted repeat ditransformasi menggunakan
Agrobacterium ke kultur friable embryogenic callus (FEC)
cassava Adira 4.
– Seleksi jaringan dan tanaman transgenic menggunakan gen pat.
• Analisis keberadaan DNA vektor. 13 tanaman bebas
DNA vektor. Jumlah kopy transgen ditentukan
menggunakan analisis Southern blot (Fig. 2).
6/6/2021 82
Figure. 2 Southern blot analysis of vector free, amylose free plants
obtained after Agrobacterium mediated transformation of the
Indonesian cassava cultivar Adira4.
6/6/2021 83
HASIL KEGIATAN BIOTEKNOLOGI
MODERN DI BIDANG PERTANIAN
GMO - Genetically modified organisms
Suatu jasad yang memiliki sifat baru, yang
sebelumnya tidak dimiliki oleh jenis jasad tersebut,
sebagai hasil penambahan gen yang berasal dari
jasad lain. Juga disebut organisme transgenik
Jagung tahan serangga
Normal Transgenic
HASIL KEGIATAN BIOTEKNOLOGI
MODERN DI BIDANG PERTANIAN
GMO - Genetically modified organisms
Suatu jasad yang memiliki sifat baru, yang
sebelumnya tidak dimiliki oleh jenis jasad tersebut,
sebagai hasil penambahan gen yang berasal dari
jasad lain. Juga disebut organisme transgenik
Tanaman tahan virus
Bunga matahari
Tahan jamur putih
Gen ketahanan berasal dari gandum
Generasi Organisme Tansgenik
Berikutnya di bidang Pertanian
Rumput lapangan golf
Tahan herbisida
Tumbuh lambat
mengurangi pemangkasan
mengurangi polusi
Uji Lapangan Tanaman Transgenik
Organisasi Jumlah uji
2002-03 (%)
Monsanto 1480 (58%)
Universities 329 (13%)
Scotts 84 (3%)
Aventis 78 (3%)
Sygenta 69 (3%)
Dow 63 (2%)
USDA/ARS 60 (2%)
Prodigene 25 (1%)
Bioremediasi
• Polusi air, tanah dan udara menjadi masalah
• Tanaman dapat membantu degradasi senyawa polutan
tersebut
Dibutuhkan tanaman yang dapat membantu degradasi
senyawa polutan dan aman terhadap lingkungan
Tanaman yang kandungan nutrisinya diperkaya
• Malnutrisi meluas
• Malnutrisi dapat menyebabkan berbagai penyakit ikutan
Dibutuhkan modifikasi tanaman pangan untuk mengatasi
masalah tersebut