TUGAS FITOKIMIA

Pemisahan Dan Pemurnian Isolat Aktif Dari Simplisia Tanaman Daun

Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.)

Nama : Rada Parasmita

NIM : F1F120054
Kelas : B

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS
JAMBI
2021
 Pemisahan Dan Pemurnian Isolat Aktif Dari Simplisia Tanaman Daun Pegagan
(Centella asiatica (L.) Urban.)

• Pendahuluan

Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.) adalah salah satu tanaman obat Indonesia
yang secara tradisional digunakan oleh penduduk untuk menyembuhkan luka, anemia,
asma, bronkitis, selulit, kolera, konstipasi, diare, dll. (WHO, 1999). Seiring
perkembangan jaman yang semakin modern, tanaman pegagan telah banyak digunakan
sebagai bahan pembuatan pada beberapa produk kosmetik di pasaran yang diklaim dapat
merawat kulit agar tetap halus dan mengatasi jerawat. Hal ini didukung dengan adanya
aktivitas antioksidan dan dapat meningkatkan jumlah kolagen pada kulit. Pada projek ini
mengidentifikasi isolat aktif dari tanaman pegagan. Bagian yang digunakan yaitu
daunnya. Isolat yang didapat dan berperan aktif terhadap aktivitas yang ada merupakan
golongan senyawa terpenoid.

Ekstrak
Daun Pegagan
Antioksidan&Antibakteri
Fraksi

Isolat
 • Alur Kerja Penelitian

Pengumpulan dan
pengolahan bahan

Pembuatan serbuk simplisia

Ekstraksi:
Susut pengeringan serbuk • Maserasi menggunakan
simplisia etanol 90% v/v
• evaporasi

Ekstrak kental
Susut pengeringan ekstrak
kental

Uji kualitatif aktivitas Isolasi senyawa aktif

Uji aktivitas Uji aktivitas UV Uji aktivitas

penangkap radikal protection metode antibakteri
bebas menggunakan inhibition of bleaching menggunakan metode
metode DPPH of β-caroten bioautografi

Uji kualitatif aktivitas pada isolat Identifikasi golongan

senyawa aktif isolat
secara kualitatif
Uji aktivitas Uji aktivitas UV Uji aktivitas menggunakan reagen
penangkap protection metode antibakteri semprot
radikal bebas inhibition of menggunakan
menggunakan bleaching of β- metode
metode DPPH caroten bioautografi
• Alur Pengerjaan isolasi senyawa

Ekstrak kental

Triturasi

Fraksi heksan Fraksi CHCl3:MeOH Fraksi CHCl3:MeOH

(95:5v/v) (9:1v/v)

Kromatografi kolom

Isolat 1 Isolat 2

Uji Kulitatif aktifitas pada isolat

Formulasi

Kimia Aktifitas Fisika

Farmakologi
• Alur Ekstraksi (Metode Maserasi)

Simplisia daun pegagan

dirajang

Simplisia yang telah dirajang

kemudian ditimbang sebanyak 50 g

Direndam pada maserator dengan

etanol 90% selama 24 jam

Disaring menggunaka kain Ampas

mori

Dimaserasi kembali

Filtrat 2
Filtrat 1

Dicampur dan disaring

menggunakan kertas saring

Dipekatkan dengan alat

evaporator pada suhu 60°𝐶

Ekstrak Kental
Penjelasan

A. Penyiapan Bahan
Bahan yang digunakan untuk penelitian merupakan bagian daun dari tanaman
pegagan
B. Pembuatan Ektrak Etanolik Daun Pegagan
Bahan penelitian yang digunakan selanjutnya adalah ekstrak etanolik daun
pegagan. Ekstrak etanolik daun pegagan dibuat melalui proses ekstraksi dengan
metode maserasi dan menggunakan etanol 90% v/v sebagai pelarut. Metode
maserasi dipilih untuk preoses ekstraksi dengan tujuan menghindari adanya
perubahan senyawa kimia yang mungkin terjadi karena adanya pemanasan dapat
menyebabkan kerusakan senyawa kimia.
Hasil ekstraksi yang sudah disaring dibuat ekstrak kental menggunakan
bantuan alat rotary vaccuum evaporator dengan suhu 60℃.

C. Optimasi Fase Gerak

Pada penelitian, pemisahan senyawa bioaktif dilakukan menggunakan fase

diam yaitu pelat aluminium TLC Silica gel 60 F254 karena partikel silika pada pelat
KLT dapat dikontrol keseragamannya sehingga pemisahan yang akan
ditujukan dengan nilai Rf 0,2 – 0,8, untuk mendapatkan pemisahan yang baik maka
terbentuk semakin optimal dan efisien. Pemisahan yang optimal pada KLT
perlu dilakukan optimasi fase gerak. Optimasi fase gerak dilakukan dengan
mencoba menggunakan 5 macam fase gerak, yaitu n-heksana : etil asetat (2:3 v/v)
; kloroform : metanol (7:3 v/v) ; kloroform : metanol (9:1 v/v) ; kloroform : metanol
(95:5 v/v) ; etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air (100:11:11:20 v/v). Pada
Tabel 1, dapat dilihat hasil KLT yang menunjukkan bahwa pada fase gerak etil
asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air (100:11:11:20 v/v) dapat memisahkan
senyawa dengan sempurna menjadi 11 spot pemisahan. Akan tetapi, fase gerak
yang dipilih untuk penelitian selanjutnya adalah kloroform : metanol (95:5 v/v).
Pemilihan fase gerak ini karena fase gerak dapat memisahkan senyawa aktif dengan
optimal setelah fase gerak etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air
(100:11:11:20 v/v) yaitu didapatkan 6 spot pemisahan dengan bercak yang lebih
jelas. Pada fase gerak etil asetat:asam formiat:asam asetat glasial:air (100:11:11:20
 v/v) tidak dipilih dengan pertimbangan pada saat uji aktivitas selanjutnya akan
sangat sulit menghilangkan pelarut karena fase gerak tersebut mengandung
komponen pelarut yang susah menguap.

D. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Ekstrak Etanolik

Optimasi fase gerak yang telah dilakukan ini sekaligus untuk uji kualitatif
aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan DPPH sebagai sumber radikal
bebas. Aktivitas antioksidan suatu senyawa aktif ditunjukkan melalui perubahan
warna DPPH yaitu violet yang mengalami pemudaran menjadi warna kuning
akibat adanya aktivitas penangkapan radikal bebas oleh suatu antioksidan Hasil
elusi KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95:5 v/v) yang
ditunjukkan pada Gambar 6, mendapatkan spot pemisahan pada Rf 0,14; 0,36;
0,46; 0,75; 0,88; 0,92 yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dengan
munculnya bercak senyawa aktif berwarna kuning setelah disemprot
menggunakan DPPH.

E. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection Ekstrak Etanolik

Mekanisme reaksi senyawa aktif pada ekstrak etanolik daun pegagan yang
memiliki aktivitas UV protection belum dapat diketahui dengan pasti, namun
aktivitas ini dapat dikaitkan dengan adanya aktivitas antioksidan yang terdapat
pada spot pemisahan senyawa pada Rf 0,14 dan 0,75. Aktivitas antioksidan ini
dapat menghambat terjadinya pemutusan rantai akibat oksidasi paparan sinar UV
sehingga warna dari β-karoten dapat dipertahankan.

F. Uji Kualitatif Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanolik Menggunakan Metode

Bioautografi.

Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak etanolik daun pegagan dilakukan

menggunakan metode bioautografi. Bioautografi merupakan teknik pengujian
antibakteri terhadap pemisahan senyawa bioaktif pada suatu pelat KLT.

Berbeda dengan hasil pengujian ekstrak etanolik terhadap bakteri S. aureus

memiliki aktivitas antibakteri dengan terbentuknya zona hambat sesuai dengan
spot pemisahan. Spot pemisahan senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas
 antibakteri ditunjukkan pada Rf 0,16- 0,17; 0,21-0,23; 0,29-0,34; 0,51-0,53. Zona
hambat yang terbentuk tidak dapat dihitung secara pasti karena zona jernih yang
terbentuk tidak rata dan saling berhimpit namun dapat terlihat secara kasat mata
bahwa seiring dengan adanya peningkatan mass loading besar zona hambat yang
terbentuk juga semakin besar. Walaupun, jika dibandingkan dengan amoxicillin
efek antibakteri yang ditunjukkan efek antibakteri ekstrak etanol tidak sebaik
amoxicillin, tapi dengan dilakukannya metode bioatugrafi dapat memberikan
informasi bahwa pada mass loading 75μg ekstrak etanolik sudah dapat
menghambat pertumbuhan bakteri.

G. Isolasi Senyawa Aktif Pada Ekstrak Etanolik Daun Pegagan

Ekstrak etanolik daun pegagan mengandung pigmen warna klorofil yang

dapat mengganggu pengamatan dalam pemisahan senyawa aktif karena klorofil
dapat menutupi senyawa aktif lainnya yang memiliki Rf yang sama dengan
klorofil. Triturasi membantu dalam pemurnian senyawa aktif dari adanya klorofil
dengan pelarut n-heksana karena klorofil merupakan senyawa non polar dan larut
dengan n-heksana. Triturasi juga dilakukan menggunakan pelarut kloroform :
metanol (95:5 v/v) dan kloroform : metanol (9:1 v/v) untuk mengambil senyawa
yang bersifat semipolar. Pada penelitian ini, triturasi juga dapat digambarkan
sebagai suatu cara dalam melakukan fraksinasi senyawa aktif ekstrak etanolik
daun pegagan menggunakan sample dan pelarut yang sedikit. Fraksinasi
dilakukan dengan tujuan untuk dapat memisahkan senyawa aktif yang
bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection,
dan antibakteri dari campuran ekstrak.
Hasil triturasi didapatkan 3 fraksi, yaitu fraksi n-heksana, fraksi
kloroform:metanol (95:5 v/v), dan fraksi kloroform:metanol (9:1 v/v) dengan
rendemen 15,59% b/b, 5,06% b/b, dan 0,41% b/b dari 300 mg ekstrak etanolik.
Hasil fraksinasi ini dipantau menggunakan pemisahan pada pelat KLT dengan
fase gerak kloroform:metanol (95:5 v/v).
Setelah fraksinasi dilakukan maka proses isolasi senyawa dilanjutkan dengan
metode kromatografi kolom dengan teknik elusi step gradient chromatography
menggunakan fraksi kloroform:metanol (95:5 v/v) karena rendemen yang didapat
cukup banyak dan klorofil juga sudah dapat dikurangi.
1. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas

Isolat yang sudah didapatkan diuji aktivitas penangkap radikal bebas

menggunakan metode DPPH, di mana volume penotolan pada pelat KLT
diukur dan dapat diketahui mass loading isolat yang ditotolkan yaitu 10
μg, 20 μg, 30 μg sehingga dapat menggambarkan konsentrasi minimum
yang dapat memberikan aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH.
Hasil pengujian aktivitas penangkap radikal bebas isolat ini dapat
memberikan informasi bahwa pada mass loading terendah, yaitu 10μg
saja sudah mampu memberikan aktivitas penangkap radikal bebas
walaupun kerjanya lemah namun seiring dengan kenaikan jumlah mass
loading maka kerja aktivitas antioksidan semakin kuat. Berbeda dengan
ekstrak dengan mass loading 10 μg pemudaran pada tiap spot dapat
terlihat dengan jelas mulai dari 2 menit saja. Perbandingan aktivitas
dilakukan menggunakan ekstrak etanolik dapat menunjukkan bahwa
masih terdapat senyawa aktif penangkap radikal bebas lainnya yang tidak
terisolasi. Isolat yang didapatkan terbukti dapat berperan terhadap adanya
aktivitas antioksidan pada ekstrak etanolik daun pegagan.

2. Uji kualitatif aktifitas UV protection isolate

Isolat yang sudah didapatkan diuji aktivitas UV protection

menggunakan metode inhibition of bleaching of β-caroten dengan cara
menghitung volume penotolan dari konsentrasi isolat 1 mg/mL sehingga
didapatkan mass loading, yaitu 10 μg, 20 μg, dan 30 μg. Perbandingan
aktivitas dilakukan menggunakan ekstrak etanolik dengan mass loading
10 μg.
Hasil dari penelitian ini dapat memberikan informasi bahwa isolat 1
dan 2 tidak memiliki peran yang bertanggung jawab terhadap adanya
aktivitas UV protection pada ekstrak etanolik daun pegagan karena
memang yang memiliki aktivitas UV protection pada ekstrak etanolik
merupakan senyawa bioaktif dengan Rf 0,14 dan 0,74, sedangkan isolat
yang didapat merupakan senyawa dengan Rf 0,34-0,36
3. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolate menggunakan Metode Disc

Diffusion.

Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode Disc Diffusion

merupakan salah metode difusi dengan prinsip kerja meletakkan
paperdisc yang mengandung senyawa antibakteri pada permukaan media
padat yang sudah diinokulasikan bakteri uji di mana akan terlihat
zona hambat berupa zona jernih sebagai parameter positif karena
adanya difusi dari senyawa aktif.
Isolat 1 hasil yang ditunjukkan tidak memiliki aktivitas antibakteri
karena tidak terlihat adanya zona hambat yang terbentuk di area sekitar
paper disc. Berbeda dengan isolat 2, pada isolat 2 dengan massa 200 μg
memiliki aktivitas antibakteri yang ditunjukan dengan adanya zona
hambat yang terbentuk dengan diameter rata-rata sebesar 5,3 mm.
Menurut Davis dan Stout (1971), kriteria kekuatan aktivitas antibakteri
yang ditunjukkan dengan adanya zona jernih.

4. Uji kualitatif identifikasi senyawa aktif pada ekstrak etanolik dan isolate

menggunakan reagen semprot

Identifikasi golongan senyawa pada ekstrak etanolik dilakukan

menggunakan reagen semprot pada pelat KLT yang sudah terbentuk spot
pemisahan senyawa bioaktif. Reagen yang digunakan adalah sebagai
berikut.
• FeCl3
Reagen FeCl3 digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa golongan
fenolik dengan reaksi positif berupa warna biru keunguan.
Hasil uji identifikasi dari pemisahan ekstrak etanolik menunjukkan
bahwa tidak adanya kandungan senyawa fenolik karena tidak ada
perubahan warna menjadi biru-keunguan.
• AlCl3
Regen AlCl3 digunakan dalam identifikasi senyawa golongan
flavonoid dengan hasil positif berupa adanya pendaran warna kuning pada
saat dibawah sinar UV. Isolat yang sudah disemprot menggunakan reagen
 AlCl3 tidak menunjukkan perubahan warna kuning saat dibawah sinar UV,
dengan demikian kedua isolat yang didapat tidak menunjukkan senyawa
golongan flavonoid.
• Dragendroff
Reagen Dragendroff digunakan sebagai pereaksi semprot dalam
identifikasi golongan senyawa aktif untuk mendeteksi adanya golongan
senyawa alkaloid dan senyawa yang memiliki gugus nitrogen.Hasil positif
yang menandakan adanya golongan senyawa alkaloid atau senyawa
bergugus nitrogen adalah terbentuknya warna orange pada spot pemisahan.
isolat yang didapat pun menunjukkan hal yang negatif terhadap
reagen Dragendorff sehingga dapat dipastikan bahwa senyawa isolat bukan
merupakan senyawa golongan alkaloid maupun senyawa dengan gugus
nitrogen.
• Vanillin asam sulfat
Analisis identifikasi golongan senyawa terpenoid dapat dilakukan
menggunakan reagen semprot Vanilllin-asam sulfat dengan hasil positif
berwarna ungu setelah beberapa saat dipanaskan
menggunakan oven pada suhu 100℃.
Hasil dari pengamatan menunjukkan bahwa senyawa yang terisolasi
merupakan senyawa terpenoid dengan hasil positif terbentuk warna ungu
pada spot pemisahan dengan Rf 0,31 dan spot pemisahan pada Rf 0,80
muncul pada saat disemprot menggunakan reagan semprot Vanillin-asam
sulfat setelah penambahan volume penotolan yang mengidentifikasikan
bahwa kedua isolat yang didapat merupakan golongan senyawa terpenoid.
• Sitroborat
Identifikasi golongan senyawa aktif juga menggunakan reagen
semprot sitroborat untuk mendeteksi adanya senyawa flavonoid.
Hasil identifikasi golongan senyawa pada ekstrak etanolik
menunjukkan tidak adanya perubahan warna yang terjadi sehingga dapat
menunjukkan bahwa komponen senyawa aktif dalam ekstrak etanolik tidak
mengandung golongan senyawa flavonoid.