Mikroorganisme termofilik dan hipertermofilik ekstrim adalah mereka yang beradaptasi untuk

tumbuh pada suhu dari 110OC. Sebagian besar mikroorganisme eksotik ini bersifat heterotrofik dan
mampu menyerang berbagai substrat polimer seperti pati, hemiselulosa, dan protein. Baru-baru ini,
sejumlah enzim ekstraseluler baru seperti a-amilase, pullulanase, xilanase, dan proteinase telah
dimurnikan dan dipelajari secara rinci. Dengan menerapkan teknologi gen, dimungkinkan juga untuk
memurnikan enzim yang stabil terhadap panas setelah ekspresi gen mereka dalam inang mesofilik.
Enzim-enzim baru ini pada umumnya dicirikan oleh suhu optimum sekitar 90-105OC dan derajat
termostabilitas yang tinggi. Aktivitas enzim masih dapat dideteksi bahkan pada 13OOC dan dengan
adanya deterjen. Karena sifat luar biasa dari enzim ini, mereka juga menarik untuk aplikasi
bioteknologi.

Sejumlah mikroorganisme termofilik ditemukan untuk menghasilkan enzim ekstraseluler yang

mampu menghidrolisis polimer seperti pati, selulosa, hemiselulosa, dan protein. Mayoritas
organisme ini tumbuh optimal antara 60 dan 75OC. Namun, sedikit yang diketahui tentang enzim
mikroorganisme hipertermofilik yang tumbuh optimal di atas 85OC. Hanya dalam dekade terakhir
telah dimungkinkan untuk mengisolasi mikroorganisme yang dapat tumbuh secara optimal bahkan
di atas l00OC [ 1, 21. Sebagian besar kelompok yang berkembang di atas suhu didih air termasuk
archaea. Namun, beberapa mikroorganisme ini juga termasuk dalam kingdom bakteri. Perwakilan
termofilik dari bakteri yang hidup optimal di atas 65OC terdiri dari empat genera, yaitu Thermotoga,
Thermosipho, Fervidobacteriurn (ordo Thermotogales) dan Aquifex (ordo Aquificales). Suhu
optimum untuk pertumbuhan mikroorganisme ini berkisar antara 65 dan 9OOC. Di sisi lain,
perwakilan termofilik dari archaea terdiri lebih dari 19 genera yang termasuk dalam ordo berikut:
Sulfolobales, Pyrodictiales, Thermoproteales, Thermococcales, Archaeglobales, Thermoplasma, dan
metanogen Methanobacteriales dan Methanococcales. Mayoritas mikroorganisme adalah
heterotrofik dan anaerobik; hanya sedikit yang merupakan autotrof ketat (Tabel 1). Sebagian besar
mikroorganisme eksotis ini telah diisolasi dari berbagai habitat panas bumi seperti mata air panas,
ladang sulfat, dan lubang hidrotermal laut dalam. Yang sangat menarik adalah enzim yang dibentuk
oleh mikroorganisme termofilik dan hipertermofilik ekstrim. Beberapa enzim yang baru-baru ini
dipelajari bahkan aktif pada suhu 130 oC[ Substrat polimer berlimpah di alam dan menyediakan
sumber karbon yang berharga dan terbarukan serta energi untuk berbagai mikroorganisme yang
menopang kehidupan pada suhu tinggi. Organisme ini mampu menyerang substrat polimer
kompleks dengan memproduksi enzim dengan berbagai spesifisitas.

degradasi pati

Pati terdiri dari amilosa (15-25070) dan amilopektin (75-85%). Amilosa adalah makromolekul linier
yang terdiri dari residu a-D-glukopiranosa yang berkedip-kedip. Panjang rantai bervariasi dari
beberapa ratus hingga 6000 residu. Arah rantai dicirikan oleh ujung pereduksi dan bukan pereduksi.
Ujung pereduksi dibentuk oleh gugus Cl hidroksil bebas. Seperti amilosa, amilopektin terdiri dari
molekul glukosa yang terikat a-l,6, tetapi selain itu juga terjadi titik percabangan dengan ikatan a-l,6.
Titik percabangan terjadi pada setiap 17-26 molekul glukosa, sehingga kandungan a-ly6-linkages
dalam amilopektin sekitar 5%. Karena massa molekul lo6 hingga lo9, amilopektin adalah salah satu
molekul biologis terbesar.
Enzim yang terlibat dalam konversi substrat ini menjadi senyawa dengan berat molekul rendah
seperti glukosa, maltosa, dan oligosakarida dengan berbagai rantai adalah a-amilase, 0-amilase,
glukoamilase, enzim pemecah cabang (pullulanase), dan a-glukosidase. Enzim yang mampu
menghidrolisis ikatan a-1,6-glikosidik pada pullulan dan amilopektin didefinisikan sebagai enzim
pemecah cabang atau pullulanase. Aksi koordinasi dari banyak enzim biasanya diperlukan untuk
konversi makromolekul yang efisien. Kemampuan untuk memanfaatkan pati sebagai sumber karbon
dan energi tersebar luas di antara mikroorganisme seperti bakteri, jamur, dan khamir [4]. Juga telah
ditunjukkan bahwa pati merangsang pertumbuhan sejumlah mikroorganisme termofilik dan
hipertermofilik ekstrim. Baru-baru ini sejumlah mikroorganisme termofilik dan hipertermofilik
ekstrim ditemukan menghasilkan enzim amilolitik termoaktif baru dengan sifat-sifat khusus.
Mikroorganisme ini termasuk dalam genus Thermotoga, Desulfurococcus, Staphylothermus,
Thermococcus, PyroCOCCUS, dan Sulfolobus [3 Studi rinci dapat dilakukan setelah pemurnian
sejumlah enzim ini untuk homogenitas. Amilase paling termostabil yang diketahui sejauh ini telah
dimurnikan dari Pyrococcus woesei dan P. furiosus [ 3, 51. P. woesei dan P. furiosus, yang tumbuh
optimal pada pati pada suhu 100 °C, memiliki amilase, pullulanase, dan a-glucosidase

Untuk memurnikan a-amilase dari P. woesei, supernatan bebas sel dikonsentrasikan dan enzim
diadsorpsi ke pati terlarut pada 4OC. Pelepasan enzim dari pati dicapai dengan perebusan dan
desorpsi akhir dengan elektroelusi. Enzim asli terdiri dari rantai polipeptida tunggal dengan massa
molekul 68 kDa. Aktivitas enzim terdeteksi bahkan setelah perlakuan enzim yang dimurnikan dengan
SDS (1%) dan merkaptoetanol (2070) selama 10 menit pada 100 °C. Enzim ini mampu menghidrolisis
ikatan a-1,4-glikosidik secara acak pada berbagai polimer glukosa seperti amilopektin, glikogen, dan
amilosa, membentuk berbagai oligosakarida. Selain polisakarida larut, a-amilase P. woesei dapat
menghidrolisis pati asli secara efisien. Berbeda dengan enzim dari sumber lain, glukosa tidak
terbentuk sebagai produk akhir. Substrat terkecil yang dapat diserang oleh enzim adalah
maltoheptaose (DP7) yang diubah menjadi DP2 dan DP5. Karena organisme ini tidak dapat
memanfaatkan glukosa sebagai sumber karbon, kemungkinan besar produk degradasi pati (dekstrin
a-limit) langsung diangkut ke dalam sel dan selanjutnya dihidrolisis secara intraseluler. Enzim baru
ini menampilkan suhu optimum 100 °C dan aktif dari 40 hingga 140OC. Hampir 20% aktivitas a-
amilase terdeteksi bahkan pada suhu 130OC. Untuk inaktivasi lengkap a-amilase, 10 jam autoklaf
pada 120OC diperlukan. pH optimum untuk aktivitas enzimatik adalah 5,5; sekitar 50% aktivitas
diukur pada pH 4,5 dan 7 Dari data ini terlihat bahwa kondisi pertumbuhan yang berlaku di habitat
panas bumi optimal untuk enzim ekstraseluler ini dilepaskan ke lingkungan. Studi in-vitro tambahan
telah menunjukkan bahwa penambahan ion logam tidak diperlukan untuk aktivitas katalitik enzim
yang dimurnikan.

Penambahan 1 sampai 5 mM C?, Cuz+, FeZ+, dan Znz+ menyebabkan penghambatan enzim; Ion
Caz+ (sampai 7 mM), bagaimanapun, menyebabkan sedikit stabilisasi enzim. Analisis komposisi asam
amino dari a-amilase tidak menunjukkan fitur yang tidak biasa bila dibandingkan dengan enzim dari
bakteri mesofilik dan termofilik. Strategi lain untuk pemurnian enzim stabil panas adalah penerapan
teknologi gen. Upaya dilakukan untuk mengkloning gen, mengkodekan enzim termostabil dalam
inang mesofilik. Baru-baru ini, pengkodean DNA pullulanase yang sangat termostabil dari P. woesei
dikloning dan diekspresikan dalam Escherichia coli. Karena termostabilitas pullulanase,
dimungkinkan untuk memurnikan enzim dengan cara yang paling luar biasa. Pemurnian enzim yang
diekspresikan dicapai dengan merebus kaldu fermentasi, denaturasi protein inang, dan pemulihan
enzim termostabil dalam supernatan (Tabel 2). Aktivitas enzim tertinggi pada dan 40% aktivitas
enzim terdeteksi pada 120OC; pH optimum adalah 5,5 (Gbr. 1). Tidak ada perbedaan yang diamati
pada sifat fisikokimia enzim asli dan enzim kloning. Berbeda dengan a-amilase dari organisme yang
sama, aktivitas pullula- nase dirangsang oleh penambahan ion kalsium. . Penambahan 0,2 mM Caz+
menyebabkan peningkatan aktivitas enzim hingga empat kali lipat. Pullulanase P. woesei mampu
menghidrolisis a-l ,6-linkage dan a-1,4-linkage pada oligo- dan polisakarida bercabang dan karenanya
dapat diklasifikasikan sebagai pulluanase tipe I1 (juga disebut amylopullulanase). Produk hidrolisis
adalah glukosa, maltosa, dan berbagai oligosakarida linier. Analisis HPLC juga menunjukkan bahwa
pullula- nase mampu menyerang a-l,64 tinta pullulan secara endo, membentuk campuran DP3, DP6,
DP9 dan DP12 (DP adalah derajat polimerisasi). Tidak seperti pullulanase yang diketahui selama ini,
enzim termoaktif dari P. woesei juga mampu menyerang ikatan a-l ,6 dalam panose, membentuk
maltosa dan glukosa sebagai produk akhir. Karena spesifisitas ganda enzim ini, aksinya
menyebabkan konversi pati menjadi gula kecil secara lengkap dan efisien tanpa memerlukan enzim
amilolitik lainnya. Karena enzim hidrolitik yang disebutkan di atas aktif secara optimal di bawah
kondisi yang sama, mereka dapat diterapkan dalam proses satu langkah untuk biokonversi industri
pati. Peningkatan proses konversi pati dengan menemukan enzim baru yang efisien dan termoaktif
akan secara signifikan menurunkan biaya produksi sirup gula.

Degradasi xilan

Hemiselulosa adalah polisakarida dengan berat molekul rendah nonselulosa yang ditemukan
bersama dengan selulosa dalam jaringan tanaman. Di dinding sel tanaman darat, xilan adalah
polisakarida hemiselulosa yang paling umum, mewakili lebih dari berat kering. Kebanyakan xilan
adalah heteropolisakarida yang terdiri dari residu 6-D-xylopyranosil yang terikat 1,4. Rantai tulang
punggung ini disubstitusi dengan residu asetil, arabinosil, dan glukoronosil. Karena heterogenitas
xilan, hidrolisisnya memerlukan aksi sistem enzim xilanolitik yang terdiri dari aktivitas P-1,4-
endoxylanase, P-xylosidase, a-L-arabinofuranosidase, a-glucuronidase, dan acetyl xylan esterase.
Aksi bersama dari enzim-enzim ini mengubah xilan menjadi gula penyusunnya. Enzim pengurai xilan
telah dilaporkan terdapat pada bakteri laut dan terestrial, bakteri rumen dan ruminansia, jamur,
ganggang laut, protozoa, siput, krustasea, serangga, dan biji tanaman terestrial. Xilanase termoaktif,
arabinofuranosidase, dan 0-xylosidase baru-baru ini dikarakterisasi dari bakteri termofilik ekstrim,
yaitu dari Thermotoga maritima, T. neapolitana, T. thermarum, dan Thermotoga sp. FjSS3-B.l [ 11;
Sunnah dkk., disampaikan]. Xilanase yang diisolasi dari strain terakhir memiliki massa molekul 31
kDa dan aktif secara optimal pada pH 5,0-5,5 dan 100OC. Xilanase dari T. neapolitana, T. thermarum,
dan T. maritima dan 6-xylosidase dari T. thermarum menunjukkan aktivitas optimal pada suhu 90°C.
Di atas 80% aktivitas enzimatik masih dapat dideteksi pada 105OC. Arabinofuranosidase dari
organisme yang terakhir kurang termoaktif dan menunjukkan aktivitas maksimal pada 7OOC. Uji
spesifisitas substrat dengan sistem enzim T. thermarum menunjukkan bahwa xilan kayu birch
komersial maupun xilan dari proses industri (Lenzing AG) merupakan substrat yang paling sesuai.
Oat spelt dan xylan larchwood kurang cocok. Ketika diinkubasi dengan hidroksietil selulosa atau
kertas saring, sistem enzim xilanolitik tidak menunjukkan aktivitas selulase. Xilanase dari T.
thermarum mampu menghidrolisis xilan beech yang tidak larut serta xilan kayu birch yang larut
sebagian untuk menghasilkan terutama xylobi-ose, xylotriose, xylotetraose, dan rantai
xylooligosaccharides yang lebih panjang. Oleh karena itu hal ini membuktikan adanya suatu
depolimerisasi endo-l,4-/3-xilanase. Massa molekul pita protein utama dengan aktivitas xilanolitik
adalah 40 kDa. Aplikasi yang menarik dari enzim tersebut adalah pemutihan pulp dengan bantuan
enzim.

DEGRADASI PROTEIN

Protein adalah molekul organik yang paling melimpah dalam sel hidup dan menyusun lebih dari 50%
berat keringnya. Berat molekul protein yang terdiri dari satu atau lebih rantai polipeptida dapat
bervariasi dari beberapa ribu hingga lebih dari satu juta. Konformasi tiga dimensi protein dapat
bervariasi. Protein globular (bulat atau globular) larut dan biasanya memiliki fungsi dinamis. Protein
berserat, di sisi lain, terjadi sebagai lembaran atau batang, tidak larut, dan berfungsi sebagai elemen
struktural. Enzim yang menghidrolisis ikatan peptida dalam protein didefinisikan sebagai proteinase.
Mereka diklasifikasikan menjadi empat kelompok tergantung pada sifat pusat aktif mereka.

1. Proteinase serin memiliki residu serin di pusat aktifnya dan dihambat oleh DFP
(diisopropylphosphofluoride) dan PMSF (phenylmethylsulfonylfluoride).

11. Proteinase sistein memiliki gugus SH di pusat aktifnya dan dihambat.

111. Aktivitas proteinase logam bergantung pada kation divalen yang terikat erat.

IV. Proteinase aspartat (proteinase asam) jarang ditemukan pada bakteri dan mengandung satu atau
oleh reagen tiol, ion logam berat, zat alkilasi, dan zat pengoksidasi.

Mereka diinaktivasi oleh agen pengkelat. lebih banyak residu asam aspartat di pusat aktifnya.
Inaktivasi enzim dapat dicapai dengan alkilasi residu asam aspartat dengan DAN (diazoacetyl-DL-
norleucine methyl ester) [7 Beberapa mikroorganisme termofilik dan hipertermofilik ekstrim yang
diisolasi dari lubang hidrotermal bawah laut, bidang solfataric, dan mata air alkali tumbuh lebih
disukai pada media kompleks yang mengandung protein dan peptida, dan karenanya menghasilkan
proteinase termoaktif. Proteinase termoaktif telah diidentifikasi baru-baru ini dari sejumlah archaea
termofilik dan hipertermofilik ekstrim seperti Pyrococcus furiosus, P. woesei, Desulfurococcus
mucosus, Thermococcus celer, T. stetteri, T. litoralis, Thermococcus sp. AN1, Staphylothermus
marinus, Sulfolobus acidocaldarius, dan S. solfataricus. Sebagian besar enzim yang terbentuk
tampaknya terkait dengan sel. Dari P. furiosus dan P. woesei proteinase tipe serin (pirolisin) telah
diidentifikasi dan dikarakterisasi [8-10]. Pirolisin adalah proteinase yang terkait dengan amplop sel
dan menampilkan aktivitas tinggi pada 110OC; waktu paruh pada 100°C adalah 4 jam. Sistem enzim
aktif antara pH 6,5 dan 10,5. Pewarnaan zymogram menunjukkan adanya beberapa pita protease
mulai dari 65 hingga 140 kDa. Eksperimen lebih lanjut dengan ekstrak sel P. furiosus telah
menunjukkan bahwa setidaknya dua proteinase tahan terhadap denaturasi SDS. Resistensi enzim
terhadap deterjen dan munculnya beberapa pita dalam gel poliakrilamida tampaknya tidak biasa
untuk enzim termoaktif. Protease serin lainnya terdeteksi pada archaea T. celer, T. stetteri,
Therrnococcus sp. AN1, T. litoralis, dan S. marinus [ 121. Enzim ini menunjukkan aktivitas optimal
antara 80 dan 95OC. pH optimum adalah netral (T. celer, T. ANI) atau basa. Proteinase ini
menunjukkan preferensi terhadap fenil alanin di situs karboksilat peptida. Pewarnaan zymogram
juga menunjukkan beberapa pita untuk semua strain yang diselidiki.

Beberapa proteinase dari hipertermofil, bagaimanapun, telah dimurnikan dan dipelajari secara rinci.
Enzim (archaelysin) yang dimurnikan dari Desulfurococcus mucosus memiliki massa molekul 52 kDa
dan aktif secara optimal pada 100 °C [ 131. Studi spesifisitas substrat dari enzim tipe serin ini
menunjukkan preferensi untuk residu hidrolitik pada C- sisi terminal dari titik pemisahan. Baru-baru
ini proteinase tipe serin dari T. stetteri dimurnikan dengan elektroforesis gel SDS preparatif.
Proteinase, dengan massa molekul 68 kDa, dimurnikan 67 kali lipat. Aktivitas maksimal diukur pada
85OC, dan 40% aktivitas diukur pada 100OC. Enzim ini aktif pada kisaran pH yang luas antara 5 dan
11. Untuk pemetaan situs pengikatan P1, p-nitroanilida terproteksi-N yang berbeda diuji. Turunan
dari glisin, alanin dan asam aspartat tidak terhidrolisis. Aktivitas tertinggi diperoleh pada turunan
arginin dan fenilalanin. Konstanta kinetik yang ditentukan disajikan pada Tabel enzim memiliki
aktivitas esterase. Nilai KJK, untuk Z-Phe-ONp empat kali lipat lebih tinggi jika dibandingkan dengan
Suc-Phe-pNA. Anilida asam amino dengan gugus amino yang tidak dilindungi tidak dihidrolisis.
Menariknya, enzim pada berbagai suhu sangat stereoselektif dan menghidrolisis secara eksklusif
bentuk-L dari Bz-Arg-pNa, fenil glisin amida, fenil alanin amida, dan arginin amida. Selanjutnya,
protein serin termoaktif dengan aktivitas maksimal pada 8OoC diselidiki dari bakteri yang baru
diisolasi dari pulau Azores. Organisme ini tumbuh optimal pada suhu 7oC dan diidentifikasi sebagai
Fervidobacterium pennavorans. Sistem enzim mampu mendegradasi protein tidak larut yang berasal
dari bulu ayam, rambut, atau wol. Enzim pendegradasi keratin aktif dalam kisaran suhu dan pH yang
luas; 50-10O0C dan pH 6,0-1 1 .O. Berbeda dengan proteinase yang dijelaskan di atas, sistem enzim
Sulfolobus acidocaldarius, yang tumbuh optimal pada 7OoC dan pH 2.0, tidak dipengaruhi oleh
inhibitor protease serin. Proteinase S. acidocaldarius aktif di bawah nilai pH yang sangat rendah dan
suhu tinggi, yaitu pH dan 90°C

Kesimpulan

Peningkatan yang stabil dalam jumlah mikroorganisme termofilik yang baru diisolasi
mendokumentasikan peningkatan minat komunitas ilmiah pada hipertermofil. Meskipun kemajuan
besar telah dibuat dalam dekade terakhir, pengetahuan kita tentang fisiologi, metabolisme,
enzimologi, dan genetika dari kelompok organisme yang menarik ini masih terbatas. Namun,
informasi mendalam tentang sifat molekuler enzim dan gennya harus diperoleh untuk menganalisis
struktur dan fungsi protein yang berfungsi bahkan di atas 100OC. Penelitian di masa depan harus
mengungkapkan strategi mana yang dikembangkan oleh archaea khas evolusioner untuk
memastikan termostabilitas yang luar biasa dari enzim mereka. Ada sedikit keraguan bahwa
kelompok organisme ini akan memasok katalis baru dengan sifat unik yang juga akan memberikan
dorongan kuat untuk pengembangan aplikasi baru. Karena sifat yang tidak biasa dari enzim ini,
mereka diharapkan untuk mengisi kesenjangan antara proses industri biologi dan kimia.