Minggu, 21 November 2021

Kromatografi

BAB I. PENDAHULUAN

Latar Belakang
Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia
(analit) berdasarkan perbedaan distribusi masing-masing komponen campuran
yang terpisah pada fase diam (stationary phase) dibawah pengaruh fase gerak
(mobile phase). Salah satu jenis kromatografi yang banyak digunakan pada saat
ini yaitu menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Metode
KCKT merupakan teknik yang direkomendasikan karena dapat digunakan untuk
pemisahan, identifikasi, dan kuantifikasi analit dari ekstrak tumbuhan, makanan,
produk farmasi dan cairan tubuh. Untuk menjamin bahwa metode yang digunakan
memberikan hasil pengukuran yang baik, maka harus dilakukan validasi metode
terlebih dahulu. Validasi metode dilakukan dengan menilai beberapa parameter
yaitu penentuan linearitas, Limit of Detection (LoD), Limit of Quantitation (LoQ),
presisi, dan persen perolehan kembali.
Sekarang ini deteksi sifat spesifik suatu senyawa menjadi sangat
penting,terutama dalam bidang farmasi, kimia, dan klinik, serta bidang lainnya.
Suatu analisis kimia seperti pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa
pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu
sebelum identifikasi dan pengukuran banyak dilakukan. Banyak metode analisis
seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya
membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil
analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Dengan alasan inilah penyusun
membahas tentang kromatografi, terutama kromatografi kolom. 
Tanpa teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni)
akan sangat sukar, dan dalam banyak kasus, hampir tidak mungkin. Pada
umumnya sebelum suatu senyawa diidentifikasi dan dapat di ukur kadarnya,
perlu di pisahkan dari matriknya. Oleh karna itu, pemisahan merupakan langkah
penting dalam analisi kualitatis. Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika
pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur.
Analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi
senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan
pengukuran. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan
teknik yang paling banyak di gunakan. Salah satunya yaitu kromatografi kolom..
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat.
Karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan
analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap
permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan
jika diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi
dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari
molekul. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik
kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat
kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Berdasarkan uraian tersebut, maka akan
membahas tentang metode kromatografi kolom.

A. Pengertian Kromatograf
Kromatografi merupakan suatu nama yang diberikan untuk teknik
pemisahan tertentu. Kromatografi pertama kali di perkenalkan oleh Michael
Tsweet pada tahun 1903 yang merupakan seorang di ahli botani dari rusia.
Dalam percobaannya Michael Tsweet berhasil memisahkan klorofil dan
pigmen pigmen warna lain dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan
serbuk kalsium karbonat yang di isikan ke dalam kolom kaca dan petroleum
eter sebagai pelarut. Proses pemisahan itu di awali dengan menempatkan
larutan cuplikan dengan menempatkan larutan cuplikan pada permukaan
atas kalsium karbonat, kemudian di alirkan pelarut petroleum eter, dan
hasilnya berupa pita pita warna yang terlihat sepanjang kolom sebagai hasil
pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak tumbuhan. Cara asli telah
diketengahkan pada tahun 1903 oleh Tsweet, ia telah menggunakannya
untuk menggunakan pemisahan senyawa-senyawa yang berwarna, dan nama
kromatografi diambil dari senyawa yang berwarna. Meskipun demikian
pembatasan untuk senyawa-senyawa yang berwarna tak lama dan hampir
kebanyakan pemisahan-pemisahan secara kromatografi sekarang
diperuntukkan pada senyawa-senyawa yang tak berwarna, termasuk gas.
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan
perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Atau
kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom,
perbedaan kemampuan absorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip
mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang di sebut
kromatogram. Pada dasarnya, semua kromatografi menggunakan dua fase
yaitu satu fase tetap (stationary) dan yang lain fase bergerak (mobile).
Pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan relative dari dua fase ini.
Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat fase
tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair.
       Jika fase tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai
kromatografi serapan, jika zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi.
Karena fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas maka semua ada empat
system kromatografi. Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya
distribusi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak berdasarkan
perbedaan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan.
1. Fase diam
Fasa diam atau adsorben (penjerap) dalam kromatografi kolom
adalah zat padat. Fasa diam yang paling umum untuk kromatografi
kolom adalah silika gel, diikuti dengan alumina. Serbuk selulosa pernah
banyak digunakan. Kromatografi kolom memungkinkan melakukan
teknik kromatografi pertukaran ion, kromatografi fasa
terbalik, kromatografi afinitas, atau penjerapan bed ekspansi (bahasa
Inggris: expanded bed adsorption, EBA). Fasa diam biasanya serbuk
 halus atau gel dan/atau mikropori untuk peningkatan permukaan,
meskipun dalam EBA digunakan bed berfulida. Ada rasio penting antara
berat fasa diam dan berat kering campuran analit yang dapat
diaplikasikan ke dalam kolom. Untuk kolom silika, rasio berada antara
20:1 hingga 100:1, bergantung pada kedekatan jarak elusi antar
komponen analit
2. Fase gerak
Fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarut murni atau campuran
pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilai faktor
retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk
meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama
kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya
sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif.
Optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil,
biasanya menggunakan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa
gerak yang sama.
Ada laju aliran optimum untuk masing-masing pemisahan.
Semakin cepat laju aliran eluen akan meminimalkan waktu yang
dibutuhkan untuk melalui kolom sehingga meminimalkan difusi,
menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Namun, laju aliran maksimum
perlu dibatasi karena analit memerlukan waktu tertentu untuk berada
pada kesetimbangan antara fasa diam-fasa gerak, lihat persamaan Van
Deemter. Kolom laboratorium sederhana bekerja dengan prinsip
aliran gravitasi. Laju aliran kolom semacam ini dapat dinaikkan dengan
menambah eluen baru di bagian atas fasa diam, atau diturunkan dengan
mengatur keran di bagian bawah. Laju aliran yang lebih cepat dapat
diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan (misalnya:
udara, nitrogen, atau argon) untuk menekan pelarut melalui kolom
(kromatografi kolom kilat).
Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom kilat biasanya
lebih halus daripada kromatografi kolom gravitasi. Misalnya, silika gel
 untuk kromatografi kilat berukuran antara 230 – 400 mesh (40 – 63 µm),
sementara untuk kromatografi gravitasi antara 70 – 230 mesh (63 –
200 µm).
Telah dikembangkan lembar lajur (spreadsheet) yang mendukung
suksesnya pengembangan kolom kilat. Lembar lajur memperkirakan
volume retensi dan pita volume analit, jumlah fraksi yang diperkirakan
untuk masing-masing kandungan analit, dan resolusi antara dua puncak
yang berdekatan. Informasi ini memungkinkan pengguna memilih
parameter optimal untuk pemisahan berskala preparatif sebelum
dicobakan pada kolom kilat.
3. Sistem Otomasi
Kromatografi kolom adalah tahapan yang sangat memakan waktu
dalam laboratorium apapun, dan dapat berubah menjadi suatu proses
leher botol dalam sekejap. Oleh karenanya, beberapa pabrikan seperti
Buchi, Interchim dan Teledyne Isco telah mengembangkan sistem
otomasi kromatografi kilat (biasanya dirujuk sebagai KCTR,
kromatografi cair tekanan rendah (bahasa Inggris: low pressure liquid
chromatography, LPLC) dengan tekanan antara 350–525 kPa atau 50,8–
76,1 psi, yang meminimalisir keterlibatan manusia dalam proses
pemurnian. Sistem otomasi meliputi komponen-komponen yang secara
normal ditemukan dalam sistem yang lebih mahal kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) seperti pompa gradien, port injeksi sampel,
detektor UV, dan pengumpul fraksi untuk mengoleksi eluen. Biasanya,
sistem otomatis ini dapat memisahkan sampel mulai beberapa miligram
hingga skala industri kilogram, dan menawarkan solusi yang lebih
murah dan cepat untuk melakukan injeksi multipel pada sistem KCKT-
preparasi.
(kemampuan memisahkan campuran) pada sistem LPLC pasti
lebih rendah daripada KCKT, karena bahan kemasan dalam kolom
KCKT dapat lebih kecil, biasnya hanya 5 mikrometer sehingga
meningkatkan luas permukaan fasa diam, meningkatkan luas permukaan
 interaksi dan pemisahan menjadi lebih baik. Namun, penggunaan media
berkemasan kecil ini menyebabkan tekanan balik yang tinggi dan itulah
mengapa disebut kromatografi cair tekanan tinggi. Kolom LPLC
biasanya dikemas dengan silika sekitar 50 mikrometer, sehingga
mengurangi tekanan balik dan resolusi, tetapi juga menghilangkan
kebutuhan pompa bertekanan tinggi yang mahal. Pabrikan juga sekrang
mulai berpindah kepada sistem kromatografi kilat bertekanan tinggi dan
memberinya nama sistem kromatografi cair tekanan menengah (bahasa
Inggris: medium pressure liquid chromatography, MPLC) yang
beroperasi pada tekanan di atas 1 Mpa (150 psi).
4. Perhitungan resolusi kromatogram
Ada juga kromatografi kolom yang dilengkapi dengan pompa
peristaltik, mengalirkan dapar dan larutan sampel melalui bagian atas
kolom. Larutan dan dapar mengalir melalui kolom hingga mencapai
pengumpul fraksi di bagian akhir kolom untuk mengumpulkan sampel
yang terelusi. Sebelum mencapai pengumpul sampel, sampel yang
dielusi dari kolom melewati suatu detektor
seperti spektrofotometer atau spektrometer massa sehingga konsentrasi
sampel yang sudah dipisahkan dalam campuran dapat ditentukan.
Sebagai contoh, jika kita ingin memisahkan dua protein yang
berbeda dengan kapasitas ikatan terhadap kolom yang berbeda dari suatu
larutan, jenis detektor yang baik adalah spektrofotometer dengan
panjang gelombang 280 nm. Semakin tinggi konsentrasi protein yang
melalui kolom, semakin besar absorbansinya pada panjang gelombang
tersebut. Oleh karena kromatografi kolom mempunyai aliran tetap untuk
semua eluat yang melalui detektor dengan berbagai macam konsentrasi,
harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi sampel terelusi
melawan waktu. Plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut
dengan kromatogram.
Tujuan utama kromatografi adalah untuk memisahkan komponen
yang berbeda dari suatu campuran larutan. Resolusi menyatakan daya
pemisahan antar komponen dalam campuran. Semakin tinggi resolusi
kromatogram, semakin baik pemisahan sampel yang dihasilkan oleh
kolom. Data ini adalah cara terbaik menentukan sifat pemisahan kolom
untuk sampel tertentu. Resolusi dapat dihitung dari kromatogram. Kurva
terpisah dalam diagram mewakili profil konsentrasi elusi sampel yang
berbeda selama proses, berdasarkan afinitasnya terhadap resin kolom.
Untuk menghitung resolusi, diperlukan waktu retensi dan lebar kurva.