REVIEW JURNAL INTERNASIONAL

Tugas Mata Kuliah Kimia Organik

Dosen Pengampu: Arman Rusman, S.Pd., M.Pharm., Sci

Disusun oleh:
KELOMPOK 2
MARCHA RESKIANI
MUHAMMAD FADRIANSYAH AKBAR
NURLISA RASYID FAISAL
NUR ASIAH
RAHMA BUNGA SARI
RENYATI PUSPITA MAHMUD

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN PELITA IBU
KENDARI
2021
 REVIEW ARTIKEL INTERNASIONAL

Judul Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its
elimination by mutagenesis
Artikel Nature
Volume & Halaman Volume (571) & Halaman 275-278
Tahun 2019
Penulis Changyang Zhou, Yidi Sun, Rul Yan, Yajing Liu, Erwei Zuo, Chan
Gu, Linxiao Han, Yu Wei, Xinde Hu,Rong Zeng, Yixue Li, Haibo
Zhou, Fan Guo & HuiYang
Reviewer Kelompok 2
Tanggal 22 Juli 2021

Abstrak Artikel yang berjudul “Off-target RNA mutation induced by DNA

base editing and its elimination by mutagenesis” ini berisi tentang
meneliti metode mutasi RNA diluar target yang diinduksi oleh
pengeditan basis DNA dan elemniasi oleh mutagenesis.
Abstrak atau bagian Pendahuluan yang disajikan penulis hanya
menggunakan Bahasa inggris (Bahasa Internasional). Secara
keseluruhan isi dari abstrak atau bagian pendahuluan ini langsung
menuju ke topic bahasan yang dibahas dalam jurnal ini, yang
menurut saya pembaca menjadi mudah memahami jurnal ini.
Pengantar Didalam Paragraf pertama, penulis menegaskan bahwa Metode
pengeditan basa DNA yang dikembangkan baru-baru ini
memungkinkan generasi mutasi titik yang diinginkan dalam DNA
genom tanpa menghasilkan jeda untai ganda (DSB)1–3 , tapi
masalahnya pengeditan di luar target telah membatasi penerapan
metode ini. Meskipun beberapa penelitian sebelumnya telah
mengevaluasi off-target mutasi pada DNA4-8 . genomic , sekarang
jelas bahwa deaminase yang merupakan bagian integral dari editor
basa DNA yang umum digunakan sering mengikat RNA9–13.
Misalnya, sitosin deaminase APOBEC1, yangdigunakan dalam
editor basa sitosin (CBE), menargetkan DNA dan RNA12, dan
adenin deaminase TadA, yang digunakan dalam adenine editor
dasar (ABEs), menginduksi pembentukan inosin spesifik situs pada
RNA9,11. Namun, setiap mutasi RNA potensial yang disebabkan
oleh DNA editor dasar belum dievaluasi. Virus terkait adeno adalah
sistem pengiriman yang paling umum untuk terapi gen yang
melibatkan penyuntingan DNA; virus ini dapat mempertahankan
ekspresi gen jangka panjang in vivo, jadi sejauh mana potensi
mutasi RNA yang diinduksi oleh DNA editor dasar menjadi
perhatian besar14–16. Di sini kami mengevaluasi secara kuantitatif
Variasi nukleotida tunggal RNA (SNV) yang diinduksi oleh CBE
atau ABE. Baik editor basa sitosin BE3 dan basa adenine editor
ABE7.10 menghasilkan puluhan ribu SNV RNA di luar target.
Selanjutnya, dengan deaminase teknik, kami menemukan bahwa
tiga CBE varian dan satu varian ABE menunjukkan pengurangan
RNA di luar target SNV ke baseline sambil mempertahankan DNA
tepat sasaran aktivitas. Studi ini mengungkapkan aspek off- efek
target dalam pengeditan DNA dan juga menunjukkan bahwa efek
tersebut dapat dihilangkan dengan deaminase teknik.
Paragraf selanjutnya, penulis menjelaskan Untuk mengevaluasi efek
off-target editor dasar di tingkat RNA, kami mentransfeksi satu jenis
CBE (BE3; APOBEC1–nCas9–UGI) atau ABE (ABE7.10; TadA–
TadA*–nCas9), bersama dengan GFP dan dengan atau tanpa RNA
pemandu tunggal (sgRNA) ke dalam sel HEK293T yang dikultur .
Pertama, kami memvalidasi target tinggi efisiensi pengeditan DNA
oleh BE3 dan ABE7.10 di HEK293T . ini sel menggunakan
pengurutan Sanger. Kami selanjutnya melakukan RNA sequencing
(RNA-seq) pada kedalaman rata-rata 125× pada sampel ini. RNA
SNV dipanggil dari RNA-seq data di setiap ulangan secara terpisah,
dan setiap SNV yang diidentifikasi dalam tipe liar sampel disaring.
Paragraf selanjutnya, penulis menemukan 742 ± 113 (rata-
rata ± s.e.m.) RNA SNV di GFP saja sel kontrol (Gbr. 1f–h, Tabel
Tambahan 2), tetapi diamati jumlah RNA SNV yang lebih tinggi
dalam sel dari sampel berikut following kelompok: APOBEC1, BE3
tanpa sgRNA, dan BE3 dengan situs 3 atau 3 protein jari manis 2
(RNF2) sgRNA (5–40 kali lipat dari sel khusus GFP. Demikian
pula, sejumlah besar RNA SNV (5–10 kali lipat dari sel khusus
GFP) juga ditemukan dalam sel yang hanya mengekspresikan
TadA–TadA*, ABE7.10 dengan- sgRNA keluar, dan ABE7.10
dengan sgRNA situs 1 atau situs 2. Khususnya, transfeksi
APOBEC1 atau TadA–TadA* menginduksi jumlah terbesar RNA
greatest SNV dibandingkan dengan kelompok transfeksi lainnya,
menyiratkan bahwa peningkatan SNV dalam sel yang diobati
dengan CBE atau ABE kemungkinan disebabkan oleh overex-
penekanan deaminase APOBEC1 atau TadA. Apalagi jumlah RNA
SNV yang tidak sesuai target meningkat ketika tingkat CBE yang
lebih tinggi atau ABE diekspresikan.
Pada paragraf berikutnya, penulis menegaskan bahwa Khususnya,
hampir 100% dari RNA SNV yang diidentifikasi dalam perlakuan
BE3 sel adalah mutasi dari G ke A atau C ke U; tingkat ini secara
signifikan lebih tinggi daripada di sel kontrol khusus GFP. Bias
mutasi ini sama dengan itu dari APOBEC1 itu sendiri ,
menunjukkan bahwa mutasi ini tidak spontan neous melainkan
diinduksi oleh BE3 atau APOBEC1. Demikian pula, 95% dari
mutasi yang diinduksi ABE7.10 adalah A ke G atau U ke C,
konsisten dengan aksi TadA. Kami mencatat bahwa Kelompok GFP
juga menunjukkan beberapa bias terhadap mutasi A ke G dan U ke
C. Mungkin karena preferensi mutasi bawaan17–19. Kita teramati
27,7 ± 3,6% (rata-rata ± s.e.m.) atau 51,0 ± 3,3% (rata-rata ± sem.)
tumpang tindih antara dua sampel dari BE3- atau ABE7.10-
transfected kelompok, masing-masing, dan SNV yang tumpang
tindih ini secara substansial diperkaya untuk gen dengan tingkat
ekspresi tinggi . Selain itu, kami menemukan bahwa motif
konsensus ACW (W = A atau U) atau TAW (W = C atau T)
 biasanya terjadi di BE3- atau ABE7.10- RNA SNV yang diinduksi,
masing-masing. Namun, tidak ada yang keluar jalur dapatkan situs
tumpang tindih dengan prediksi mutasi di luar target dan kami
mengamati tidak ada kesamaan antara urutan off-target dan on-
target.
Pembahasan Pada bagian pembahasan, penulis membagi sub pokok bahasan
menjadi beberapa bagian, yaitu :
Metode :
Plasmid dibangun menggunakan NEBuilder HiFi DNA Assembly
Master Mix (New England Biolabs) menurut protokol standar. Sel
HEK293T (Bank Sel SIBCB, CAS) diautentikasi disertifikasi oleh
pemasok dan bebas dari kontaminasi mikoplasma. Mikoplasma
kontaminasi ditentukan oleh PCR dari supernatan sel HEK293T. Sel
HEK293T diunggulkan dalam cawan 10 cm dan dikultur di
Dulbecco yang dimodifikasi Medium Eagle (DMEM, Thermo
Fisher Scientific) dilengkapi dengan 10% FBS (Thermo Fisher
Scientific) dan penisilin/streptomisin pada 37 °C dengan 5% CO2.
Sel ditransfeksi dengan 30 g plasmid menggunakan Lipofectamine
3000 (Thermo Fisher Ilmiah). Tiga hari setelah transfeksi, sel
dicerna dengan 0,05% tripsin (Thermo Fisher Scientific) dan
disiapkan untuk FACS. Sel-sel GFP-positif diurutkan dan disimpan
dalam DMEM atau Trizol (Ambion) untuk penentuan pengeditan
basa DNA atau RNA-seq. Untuk menentukan efisiensi pengeditan
basa DNA, sel dilisiskan menggunakan Kit Genotipe Tikus Satu
Langkah (Vazyme) dan selanjutnya disiapkan untuk Sanger
pengurutan dan kuantifikasi menggunakan EditR 1.0.8
(https://moriaritylab.shinyapps.io/ editor_v10/). Semua percobaan
pada Gambar. 1b-e, 4a-d dilakukan secara bersamaan. Dengan
demikian, data untuk GFP dan BE3-situs 3 di lokus situs 3
digunakan pada Gambar. 1b dan 4a, dan data untuk GFP dan
ABE7.10-situs 1 di situs 1 lokus digunakan pada Gambar. 1 hari dan
4c. Untuk RNA-seq, ~500.000 sel (sinyal GFP 5% teratas)
dikumpulkan dan RNA adalah diekstraksi sesuai dengan protokol
standar. Untuk konstruksi perpustakaan, mRNA terfragmentasi dan
diubah menjadi cDNA menggunakan heksamer acak atau oligo(dT)
primer. Ujung cDNA 5′ dan 3′ diikat dengan adaptor, dan dengan
benar fragmen cDNA yang diikat diperkaya dan diamplifikasi
dengan PCR. Konsentrasi perpustakaan dinilai menggunakan
Bioanalyzer.

Instrumen ; Sekuensing mRNA throughput tinggi (RNA-seq)

dilakukan menggunakan Illumina Hiseq pada cakupan rata-rata
125×. FastQC (v0.11.3) dan Trimmomatic (v0.36) digunakan untuk
kontrol kualitas. Bacaan yang memenuhi syarat dipetakan ke
referensi genom (Ensemble GRCh38) menggunakan STAR
(v2.5.2b) dalam mode two-pass dengan parameter yang
diimplementasikan oleh proyek ENCODE. Alat Picard (v2.3.0) saat
ituditerapkan untuk mengurutkan dan menandai duplikat file BAM
yang dipetakan. BAM yang disempurnakan file tunduk pada
pembacaan terpisah yang membentang persimpangan sambungan,
penataan kembali lokal, kalibrasi ulang dasar dan panggilan varian
dengan SplitNCigarReads, IndelRealigner, Alat BaseRecalibrator
dan HaplotypeCaller dari GATK (v3.5), masing-masing. Untuk
mengidentifikasi varian dengan keyakinan tinggi, kami memfilter
kluster yang terdiri dari setidaknya lima SNV yang berada dalam
jendela 35 pangkalan dan mempertahankan varian dengan skor
kualitas dasar >25, skor kualitas pemetaan >20, nilai untai Fisher
(FS) >30,0, Qual By Depth nilai (QD) <2.0 dan kedalaman
sequencing >20. Saat mRNA diubah menjadi cDNA sebelum
pengurutan, baik nukleotida dan basa komplementernya dapat
diurutkan. Misalnya, jika ada C dalam mRNA, cDNA memiliki C
dan G di situs tertentu. Ketika genom referensi adalah C, urutannya
akan dibaca sebagai C, dan jika referensinya adalah G di situs, G
akan dibaca sebaliknya. Oleh karena itu, kami menghitung jumlah
mutasi C ke T + G ke A sebagai pengeditan BE3 dan jumlah dari A
ke G + T ke C untuk pengeditan ABE7.10. RSEM (v1.2.21)
digunakan untuk memperkirakan tingkat ekspresi gen pada align-
file ment dengan parameter default36 dan kelimpahan gen
dilaporkan di TPM (transkrip per juta kilobase). SNV RNA di luar
target yang diidentifikasi dalam BE3- atau Sel-sel yang ditransfeksi
ABE7.10 dipetakan ke tingkat gen. Kami memilih secara acak
jumlah gen yang sama dari transkriptom di setiap sampel SNV di
luar target, dan kemudian membandingkan tingkat ekspresi antara
kedua kelompok dengan nilai TPM yang diubah log2.

Prosedur; Analisis pengeditan RNA oleh RNA-seq. Kami

menggunakan empat belas kelompok sel yang ditransfeksi: sel yang
hanya mengekspresikan GFP (36 jam dan 72 jam), APOBEC1 atau
TadA–TadA*, sel yang diekspresikan BE3, BE3 dengan situs 3
sgRNA (36 jam dan 72 jam), BE3 dengan RNF2 sgRNA2 , BE3
(FNLS)31 dengan situs 3 sgRNA, ABE7.10, ABE7.10 dengan situs
1 sgRNA (36 jam dan 72 jam)3 , ABE7.10 dengan sgRNA situs 2
dan ABEmax32 dengan situs 1 sgRNA.
Analisis Statistik; Analisis statistik. Semua nilai ditampilkan
sebagai mean ± s.e.m. Uji-t Student Tidak Berpasangan (dua sisi)
digunakan untuk perbandingan dan P < 0,05 dianggap statistic
signifikan. Rincian nilai statistik disediakan dalam Tabel Tambahan.
Eksperimen tidak diacak dan para peneliti tidak dibutakan alokasi
selama eksperimen dan penilaian hasil. Ringkasan pelaporan.
Informasi lebih lanjut tentang desain penelitian tersedia di
Ringkasan Pelaporan Nature Research yang ditautkan ke makalah
ini. ketersediaan data

Hasil ; Konstruksi perpustakaan untuk RNA-seq full-length dari sel

tunggal. Individu sel HEK293T manusia diambil secara manual
setelah FACS, dilisiskan dan dikenai untuk sintesis cDNA
menggunakan protokol Smart-seq238. cDNA sel tunggal kemudian
diperkuat dan terfragmentasi seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Perpustakaan pengurutan adalah dibangun (New England Biolabs),
kualitas diperiksa dan diurutkan dengan pasangan-end Pembacaan
150-bp pada platform Illumina HiSeq X-Ten (Novogene). Kami
tampil RNA-seq sel tunggal dari 96 sel HEK293T individu, di
antaranya 16 adalah dihasilkan dari sel tipe liar tunggal, 16
dihasilkan dari sel GFP + tunggal, 32 dihasilkan dari sel BE3-GFP+
tunggal, dan 32 dihasilkan dari sel tunggal sel ABE-GFP+. Setelah
pemeriksaan kualitas semua perpustakaan, 91 perpustakaan sel
tunggalmelewati kriteria kami dan menjadi sasaran pengurutan
mendalam. Semua data pengurutan disimpan di SRA di bawah
PRJNA528561. Dengan demikian, RNA SNV di luar target yang
diinduksi oleh CBE dan ABE tidak bergantung pada sgRNA dan
disebabkan oleh ekspresi berlebih dari APOBEC1 dan TadA–
TadA*, masing-masing. Dengan sekuensing Sanger validasi, kami
menemukan bahwa SNV ini hanya dapat dideteksi dalam RNA,
tetapi tidak dalam DNA. Selain itu, tidak tepat sasaran RNA SNV
ditemukan dalam urutan pengkodean dan non-pengkodean. Selain
itu, ABE7.10menginduksi 56 dan 12 RNA SNV non-sinonim dalam
onkogen dan gen penekan tumor, masing-masing, dan banyak di
 antaranya menunjukkan tingkat pengeditan lebih tinggi dari 40%,
meningkatkan kekhawatiran tentang risiko onkogenik pengeditan
basis DNA.

Dalam sub pokok bahasan diatas penulis menjelaskan dengan sangat

rinci bagaimana penelitian tersebut dilaksanakan. Pembahasan yang
dilakukan oleh penulis mudah dipahami maksud dan tujuannya oleh
pembaca .
Simpulan Pada bagian kesimpulan, penulis membuktikan dan menjelaskan
bahwa Hasil penelitian ini RNA luar target yang diinduksi oleh
DNA tidak bergantung pada sgRNA dan disebabkan oleh ekspresi
berlebih dari APOBEC1 dan TadA–TadA*, masing-masing. Dengan
sekuensing Sanger validasi, masing-masing, dan banyak di
antaranya menunjukkan tingkat pengeditan lebih tinggi dari 40%,
meningkatkan kekhawatiran tentang risiko onkogenik pengeditan
basis DNA.
Kekuatan Penelitian 1.Teori dan model analisis yang diguakan tepat
2.Bahasa yang digunakan  oleh penulis mudah dipahami maksud
dan tujuannya oleh pembaca. Analisisnya sangat rinci dan mudah
dipahami
Kelemahan Penelitian 1. Penulis kurang lengkap dalam menyimpulkan keseluruhan isi dari
artikrl ini.
2. penulis kurang detail dalam memberikan hasil yang didapat dalam
melakukan penelitiannya.

DAFTAR PUSTAKA
Zhou, C, Yidi Sun, Rul Yan, Yajing Liu, Erwei Zuo, Chan Gu, Linxiao Han, Yu Wei, Xinde
Hu,Rong Zeng, Yixue Li, Haibo Zhou, Fan Guo & HuiYang. 2019. Off-target RNA
mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Natur
Volume (571) & Halaman 275-278.