com
Artikel asli
*Kepada siapa korespondensi harus ditujukan. Dr Marı́a José Buitrago. Servicio de Micologı́a. Centro Nacional de
Microbiologı́a. Instituto de Salud Carlos III. Carretera Majadahonda-Pozuelo Km2. 28220 (Madrid), Spanyol.
Telp: +34-91-8223425; Faks: +34-91-5097919; Surel:buitrago@isciii.es
Diterima 7 Oktober 2016; Revisi 2 Desember 2016; Diterima 31 Mei 2017; Keputusan Redaksi 23 Januari 2017
Abstrak
Isolasi jamur patogen Histoplasma capsulatum dari kultur bersama dengan visualisasi ragi
intraseluler khas dalam jaringan adalah metode standar emas untuk diagnosis
histoplasmosis. Namun, budaya memakan waktu, memerlukan penahanan level 3 dan
personel yang berpengalaman, dan biasanya memerlukan tes konfirmasi tambahan. Matrix-
Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-ToF MS) telah
ditetapkan sebagai alat yang cocok untuk identifikasi mikroba di beberapa laboratorium
klinis. Sebuah database referensi telah dibangun untuk mengidentifikasiH. capsulatum oleh
MALDI-ToF MS dengan menggunakan enam H. capsulatum strain yang sebelumnya
diidentifikasi dengan metode molekuler. Untuk validasi, 63 galur jamur milik Koleksi Pusat
Mikrobiologi Nasional Spanyol diuji terhadap database referensi baru yang dikombinasikan
dengan database komersial dan internal lainnya. Dalam uji buta, semua
H. capsulatum regangan (n = 30) diidentifikasi dengan benar oleh database dan 86,6% memiliki
skor di atas 1,7. Mempertimbangkan kedua fase jamur untuk galur yang sama, hasil yang paling
dapat diandalkan diperoleh dengan fase miselium, dengan hanya 13,3% isolat yang memiliki skor
di bawah 1,7. Basis data baru mampu mengidentifikasi kedua fase morfologi jamur. Teknologi
MALDI-ToF menghasilkan identifikasi yang cepat dan sederhana dariH. capsulatum bentuk ragi
dan kultur miselium awal. Ini memungkinkan untuk mengurangi waktu respons dan mengurangi
risiko manipulasi jamur.
Kata kunci: Spektrometri massa MALDI-ToF, Histoplasma capsulatum, identifikasi jamur, database referensi,
mikosis endemik.
©
C Penulis 2017. Diterbitkan oleh Oxford University Press atas nama Masyarakat Internasional untuk Mikologi Manusia dan Hewan. 307
Seluruh hak cipta. Untuk izin, silakan email:journals.permissions@oup.com
308 Mikologi Medis, 2018, Jil. 56, No.3
Tabel 1. H. capsulatum strain yang digunakan untuk membangun database referensi untuk identifikasi MALDI-ToF.
AIdentifikasi berdasarkan analisis molekuler dan sekuensing DNA diberikan. Hcc, Histoplasma capsulatum var. capsulatum; Hcd, Histoplasma capsulatum var.
duboisii; Hcf, Histoplasma capsulatum var. farciminosum. [Nomor aksesi GenBank: KR674032, KR674033, KR674034, KR674035, KR674036, KR674037]
BKedua fase morfologi, M (miselium) dan Y (ragi), diwakili dalam database untuk tiga galur.
BAS, sekret bronkoalveolar; ATCC, Koleksi Budaya Tipe Amerika (Manassas, VA, USA); CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrech, Belanda).
kualitas yang cukup untuk menghasilkan spektrum utama (MSP) dan pasien imunosupresi menunjukkan jumlah negatif palsu yang
membangun database referensi MS. Sebagai catatan, spektrum yang tinggi dan orang-orang yang berasal dari daerah endemik dapat
diperoleh untuk semua isolat yang termasuk dalam database referensi memberikan hasil positif palsu. Deteksi antigen adalah metode
menunjukkan keragaman yang besar (Gbr. S1). Untuk analisis, yang berguna dalam infeksi diseminata tetapi tidak tersedia di
database referensi baru ini digabungkan dengan beberapa database banyak laboratorium klinis.25 Beberapa metode molekuler juga
yang mencakup sejumlah besar spesies jamur (lihat validasi database telah dikembangkan baru-baru ini, tetapi tidak ada konsensus di
Referensi MS di bagian Metode). antara laboratorium dan tidak ada metode komersial terkini yang
tersedia.26 Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi MALDI-ToF
telah terbukti menjadi alat yang andal dan memadai untuk
Validasi dari H. capsulatum database referensi mengidentifikasi mikroorganisme patogen. Selain itu, teknik ini
Hasil identifikasi MALDI-ToF untuk 63 galur yang termasuk dalam tidak memerlukan teknisi berpengalaman dan mengurangi biaya
uji validasi dirangkum dalam Tabel 2. Pertama, strain spesies serta waktu respons. Banyak kelompok penelitian telah
Meja 2. Rincian 63 galur jamur yang termasuk dalam panel spesifisitas dan identifikasinya oleh MALDI-ToF MS ketika dianalisis terhadap
database referensi MS untuk H. capsulatum dikombinasikan dengan database MS komersial dan internal lainnya.
Meja 2. (Lanjutan).
AIdentifikasi berdasarkan analisis molekuler dan sekuensing DNA diberikan. Hcc, Histoplasma capsulatum var. capsulatum; Hcd, Histoplasma capsulatum var.duboisii; Hcf,
Histoplasma capsulatum var. farciminosum.
BKedua fase morfologi, M (miselium) dan Y (ragi), dirinci untuk jamur dimorfik.
CSkor log kecocokan terbaik dan identifikasi yang disediakan oleh sistem untuk analisis MALDI-ToF disertakan untuk setiap galur. Setiap strain diuji dalam rangkap dua dan 2-3
pengulangan pengujian dilakukan. dalam kasusH. capsulatum strain, keadaan morfologi skor log kecocokan terbaik juga ditentukan di antara tanda kurung. Untuk galur yang tidak
terwakili dalam basis data apa pun, baik identifikasi maupun skor log tidak dicantumkan.
ATCC, Koleksi Budaya Tipe Amerika (Manassas, VA, USA); CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrech, Belanda); Tidak ada DB, regangan tidak terwakili dalam
database yang dianalisis.
Tabel 3. Sensitivitas dan spesifisitas sesuai dengan nilai batas cutoff ke 1,6, sensitivitas naik drastis menjadi 93,3% di H.
MALDI-ToF yang berbeda untuk semua H. capsulatum isolat (ragi capsulatum ketegangan.
dan miselia). Skor buruk yang diperoleh dengan beberapa isolat ragi,
bahkan ketika ekstraksi protein berulang, dapat dijelaskan oleh
Nilai potong Sensitivitas (%) Spesifisitas (%)
kesulitan untuk mendapatkan konversi murni dari miselium
1.4 100 100 menjadi ragi. Faktanya, konversi fase ragi dicapai hanya untuk
1.5 95.5 100 hampir 50% dari semuaH. capsulatum strain termasuk dalam
1.6 88.6 100
pekerjaan ini. Selain itu, keterbatasan bekerja di bawah fasilitas
1.7 75 100
BSL-3, tidak memungkinkan perubahan kondisi kultur atau
> 1.7 40.9 100
prosedur ekstraksi protein. Di sisi lain, bahkan jika metode
ekstraksi mungkin bukan yang paling memadai untuk hasil
menganggap skor ini sangat konservatif untuk jamur,23,29– terbaik, itu memungkinkan pembunuhan jamur secara
33 membuktikan peningkatan sensitivitas ketika menyeluruh yang penting untuk menjamin keselamatan pekerja.
menurunkan skor "spesies aman", sedangkan akurasi Basis data referensi baru tidak dapat melakukan
teknik selalu dipertahankan. Berdasarkan studi ini, analisis diskriminasi yang tepat antara tiga varietas jamur: hanya
sensitivitas dan spesifisitas dilakukan dengan menguji 28 dari 44 isolat (63,6%) yang termasuk dalam panel
skor cutoff yang berbeda (Tabel2). Saat menurun spesifisitas yang cocok dengan varietas yang benar. Ini
Valero dkk. 313
fakta dapat dijelaskan oleh hubungan filogenetik yang tion perpustakaan spektrum referensi MALDI-ToF MS
kompleks di antara ketiga varietas, seperti yang dijelaskan diperlukan.
sebelumnya oleh penulis lain34,35 yang menyatakan bahwa
klasifikasi tradisional dalam tiga varietas tidak ada artinya.
Selain itu, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, metode Materi tambahan
ekstraksi standar yang digunakan tidak optimal untuk jenis
Data tambahan tersedia di MMYKOL on line.
jamur ini dan dapat mempengaruhi daya diskriminasi teknik.
Dalam pengaturan klinis, identifikasi varietas tidak relevan
karena pengobatan akan tetap sama.
ucapan terima kasih
Spektrum dari tahap ragi dan miselium jamur dimasukkan
Kami dengan hormat berterima kasih kepada Frank Hodgkins atas pembacaan dan penyuntingan
dalam database dengan tujuan untuk mengidentifikasi kedua
naskahnya dengan cermat.
fase dengan benar. Dalam percobaan awal, kami menemukan Pekerjaan ini didukung oleh proyek penelitian PI11/00412 dan
spesifisitas yang sangat baik dengan melakukan validasi dalam 3. Kauffman CA, Histoplasmosis. Obat Dada Clin. 2009;30: 217–225, V.
4. Al-Ani FK. Limfangitis epizootik pada kuda: tinjauan literatur.Rev Sci Tech.
kondisi yang paling mirip dengan pengaturan klinis nyata (uji
1999;18: 691–699.
buta, pengujian hanya dua duplikat, menggunakan instruksi 5. Buitrago MJ, Cuenca-Estrella M. [Epidemiologi saat ini dan diagnosis
pabrik untuk prosedur ekstraksi, dll.). Tujuan ini dan kapasitas laboratorium mikosis endemik di Spanyol]. Enferm Infecc Microbiol Clin.
2012;30: 407–413.
metode ini untuk mengantisipasiH. capsulatum identifikasi dari
6. Gugnani HC. Histoplasmosis Di Afrika: Sebuah Tinjauan. Indian J Chest Dis
kultur berbeda dengan metode klasik, menyoroti potensi Allied Sci. 2000;42: 271–277.
teknologi MALDI-ToF untuk meningkatkan diagnosis 7. Huber F, Nacher M, Aznar C dkk. terkait AIDSHistoplasma capsulatumvar.
capsulatum infeksi: 25 tahun pengalaman Guyana Prancis. AIDS. 2008;
histoplasmosis dan organisme BSL-3 lainnya.
22: 1047–1053.
Kesimpulannya, database MS referensi kami kuat dan 8. Gandum LJ, Kauffman CA. Histoplasmosis.Menginfeksi Dis Clin North Am.
cocok untuk H. capsulatum identifikasi di kedua fase 2003;17: 1–19, Vii.
morfologi jamur dan memungkinkan kemajuan dalam 9. Kauffman CA. Histoplasmosis: pembaruan klinis dan laboratorium.Clin
Microbiol Rev. 2007;20: 115-132.
diagnosis histoplasmosis. Selanjutnya, penanganan minimalH.
10. Buitrago MJ, Berenguer J, Mellado E dkk. Deteksi histoplasmosis impor dalam
capsulatum budaya diperlukan untuk melakukan ekstraksi serum pasien terinfeksi HIV menggunakan uji berbasis PCR waktu nyata.
protein, mengurangi risiko biosafety. Teknik ini dapat Mikrobiol Eur J Clin Menginfeksi Dis. 2006;25: 665–668.
11. Buitrago MJ, Gomez-Lopez A, Monzon A dkk. [Penilaian metode PCR
dilakukan di laboratorium diagnostik klinis dan mikrobiologis
kuantitatif untuk diagnosis klinis histoplasmosis impor].Enferm Infect
rumah sakit dan lembaga penelitian lainnya dengan Microbiol Clin. 2007;25: 16–22.
penyimpanan biosafety yang tepat. Namun, penelitian lebih 12. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A dkk. Waktu ionisasi desorpsi laser yang
dibantu matriks dari spektrometri massa penerbangan: perubahan
lanjut tentang taksonomi jamur dan penyempurnaan
mendasar dalam praktik rutin mikrobiologi klinis.Clin Microbiol Rev.
beberapa parameter untuk meningkatkan konstruksi 2013;26: 547–603.
314 Mikologi Medis, 2018, Jil. 56, No.3
13. Cassagne C, Ranque S, Normand AC dkk. Identifikasi rutin cetakan di spektrometri massa penerbangan menggunakan panel uji ragi. J Clin Mikrobiol. 2014;
laboratorium klinis dengan bantuan matriks laser desorpsi ionisasi waktu 52: 3023–3029.
penerbangan spektrometri massa.Plos Satu. 2011;6: E28425. 24. Guimaraes A, Nosanchuk J, Zancope-Oliveira R. Diagnosis histoplasmosis.
14. Coulibaly O, Marinach-Patrice C, Cassagne C et al. Pseudallescheria/ Braz J Microbiol. 2006;37: 1–13.
Scedosporium identifikasi spesies kompleks dengan spektrometri massa 25. Gandum L. Perbaikan dalam diagnosis histoplasmosis. Opini Ahli Biol
desorpsi laser berbantuan matriks. Med Mycol. 2011;49: 621–626. Ada. 2006;6: 1207–1221.
26. Buitrago M, Canteros C, Frias De L dkk. Perbandingan protokol PCR untuk
15. Quiles-Melero I, Garcia-Rodriguez J, Gomez-Lopez A dkk. Evaluasi mendeteksiHistoplasma capsulatum DNA melalui studi multicenter.Pendeta
spektrometri massa desorpsi/ionisasi laser berbantuan matriks (MALDI- Iberoam Micol. 2013;30: 256–260.
Tof) untuk identifikasiKandida parapsilosis, C. ortopsilosis, dan C. 27. Alanio A, Beretti JL, Dauphin B dkk. Matriks-dibantu laser desorpsi ionisasi
metasilosis. Mikrobiol Eur J Clin Menginfeksi Dis. 2012;31: 67–71. spektrometri massa waktu penerbangan untuk identifikasi cepat dan akurat
yang relevan secara klinisAspergillus jenis. Infeksi Mikrobiol Klin. 2011;17:
16. De Carolis E, Posteraro B, Lass-Florl C dkk. Identifikasi spesiesAspergillus, 750–755.
Fusarium dan Mucorales dengan analisis permukaan langsung dengan 28. Bader O, Weig M, Taverne-Ghadwal L dkk. Peningkatan identifikasi
matriks berbantuan laser desorpsi ionisasi waktu penerbangan spektrometri laboratorium klinis dari ragi patogen manusia dengan bantuan matriks laser