Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Mikologi Medis, 2018, 56, 307–314

doi: 10.1093/mmy/myx047
Tanggal Publikasi Akses Awal: 28 Juli 2017
Artikel asli

Artikel asli

Waktu desorpsi/ionisasi laser berbantuan matriks

dari basis data referensi spektrometri massa
penerbangan untuk identifikasi Histoplasma

Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021

capsulatum
Clara Valero1, Marı́a J. Buitrago1,*, Sara Gago1, Inmaculada
Quiles-Melero2 dan Julio Garca-Rodrı́guez2
1Servicio de Micologı́a, Centro Nacional de Microbiologı́a, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid,
Spanyol dan 2Servicio de Microbiologı́a y Parasitologı́a, Rumah Sakit Universitario La Paz, Madrid, Spanyol

*Kepada siapa korespondensi harus ditujukan. Dr Marı́a José Buitrago. Servicio de Micologı́a. Centro Nacional de
Microbiologı́a. Instituto de Salud Carlos III. Carretera Majadahonda-Pozuelo Km2. 28220 (Madrid), Spanyol.
Telp: +34-91-8223425; Faks: +34-91-5097919; Surel:buitrago@isciii.es

Diterima 7 Oktober 2016; Revisi 2 Desember 2016; Diterima 31 Mei 2017; Keputusan Redaksi 23 Januari 2017

Abstrak
Isolasi jamur patogen Histoplasma capsulatum dari kultur bersama dengan visualisasi ragi
intraseluler khas dalam jaringan adalah metode standar emas untuk diagnosis
histoplasmosis. Namun, budaya memakan waktu, memerlukan penahanan level 3 dan
personel yang berpengalaman, dan biasanya memerlukan tes konfirmasi tambahan. Matrix-
Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-ToF MS) telah
ditetapkan sebagai alat yang cocok untuk identifikasi mikroba di beberapa laboratorium
klinis. Sebuah database referensi telah dibangun untuk mengidentifikasiH. capsulatum oleh
MALDI-ToF MS dengan menggunakan enam H. capsulatum strain yang sebelumnya
diidentifikasi dengan metode molekuler. Untuk validasi, 63 galur jamur milik Koleksi Pusat
Mikrobiologi Nasional Spanyol diuji terhadap database referensi baru yang dikombinasikan
dengan database komersial dan internal lainnya. Dalam uji buta, semua
H. capsulatum regangan (n = 30) diidentifikasi dengan benar oleh database dan 86,6% memiliki
skor di atas 1,7. Mempertimbangkan kedua fase jamur untuk galur yang sama, hasil yang paling
dapat diandalkan diperoleh dengan fase miselium, dengan hanya 13,3% isolat yang memiliki skor
di bawah 1,7. Basis data baru mampu mengidentifikasi kedua fase morfologi jamur. Teknologi
MALDI-ToF menghasilkan identifikasi yang cepat dan sederhana dariH. capsulatum bentuk ragi
dan kultur miselium awal. Ini memungkinkan untuk mengurangi waktu respons dan mengurangi
risiko manipulasi jamur.
Kata kunci: Spektrometri massa MALDI-ToF, Histoplasma capsulatum, identifikasi jamur, database referensi,
mikosis endemik.

©
C Penulis 2017. Diterbitkan oleh Oxford University Press atas nama Masyarakat Internasional untuk Mikologi Manusia dan Hewan. 307
Seluruh hak cipta. Untuk izin, silakan email:journals.permissions@oup.com
308
pengantar
Histoplasmosis adalah mikosis endemik yang disebabkan oleh jamur
dimorfik Histoplasma capsulatum.1 Tiga varietas jamur dikenali, dua di
antaranya bersifat patogen bagi manusia: Histoplasma capsulatum var.
capsulatum, yang menyebabkan histoplasmosis klasik atau Amerika
dan tersebar luas tetapi endemik di lembah-lembah sungai besar
Amerika, dan Histoplasma capsulatum var. duboisii, yang merupakan
agen penyebab histoplasmosis Afrika dan endemik di Afrika
khatulistiwa.2,3 Ketiga, Histoplasma capsulatumvar. farciminosum,
didistribusikan di negara-negara yang berbatasan dengan Laut
Mediterania dan menyebabkan limfangitis epizootik pada kuda.4
Meskipun tidak ada kasus asli, insiden penyakit ini telah meningkat
dalam beberapa tahun terakhir di Spanyol karena migrasi dari daerah
endemik dan transit pelancong yang melanjutkan dari daerah tersebut.
5 Gambaran klinis penyakit jamur ini pada manusia bervariasi
tergantung pada varietas jamur yang terlibat dalam infeksi.
Histoplasma capsulatum var. capsulatumterutama menyebabkan
infeksi paru sementara H. capsulatum var. duboisii mempengaruhi
terutama kulit dan jaringan subkutan.6 Pada kedua kasus tersebut,
infeksi dapat menyebar pada populasi dengan gangguan sistem imun,
terutama pada pasien yang positif human immunodeficiency virus
(HIV).7
Diagnosis mikrobiologi klasik didasarkan pada isolasi
organisme dalam kultur, pemeriksaan mikroskopis cairan dan
jaringan, dan teknik serologis. Mengisolasi jamur dari kultur
adalah teknik yang memakan waktu yang membutuhkan 3-4
minggu karena pertumbuhan jamur yang lambat.8 Setelah
jamur tumbuh dengan baik, konidia tuberkulosis yang khas
harus diamati untuk melakukan diagnosis dugaan.9
Namun, tes pasti harus dilakukan dengan menggunakan
teknik lain seperti identifikasi molekuler.10,11 Selain itu,
penahanan biosafety level 3 (BSL-3) diperlukan untuk
manipulasi bentuk miselium.
Dalam dekade terakhir, teknologi Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-
ToF MS) telah merevolusi bidang identifikasi mikroba dalam
praktik klinis. Ini telah diterapkan di banyak laboratorium
diagnostik mikrobiologi rutin dan beberapa protokol telah
dikembangkan untuk identifikasi mikroorganisme patogen,
terutama untuk bakteri dan ragi.12 Banyak upaya telah dilakukan
untuk mengadaptasi protokol ini untuk identifikasi jamur
berfilamen. Penulis yang berbeda telah difokuskan pada
standarisasi prosedur ekstraksi,13 meningkatkan diskriminasi di
antara kompleks spesies,14,15 meningkatkan database komersial,16
,17 dan mengembangkan database in-house baru untuk mencapai
identifikasi yang akurat dari cetakan yang relevan secara klinis.18–
21 Namun, beberapa penelitian telah dilakukan dengan patogen
jamur BSL-3. Sepengetahuan kami, tidak ada entri dariH.
capsulatum spektrum di database komersial yang paling banyak
digunakan dan
Mikologi Medis, 2018, Jil. 56, No.3
dimasukkannya dalam database in-house telah dilaporkan baru-baru
ini oleh Lau et al.18 dalam jumlah strain yang berkurang, hanya pada
tahap miselium jamur. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
membuat perpustakaan MS referensi untuk identifikasi galur yang
akuratHistoplasma capsulatum oleh teknologi MALDI-ToF dan
memvalidasinya dengan 63 galur yang sebelumnya diidentifikasi
dengan metode molekuler.
Metode
Strain jamur
Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021
Enam H. capsulatum strain milik Koleksi Jamur dari Pusat
Nasional Mikrobiologi Spanyol digunakan untuk
membangun basis data spektrum massa referensi. Seperti
yang ditunjukkan pada Tabel1, strain milik tiga varietas
jamur dan strain jenis dimasukkan. Bentuk miselium
diwakili untuk semua strain dan fase ragi dimasukkan
untuk tiga dari mereka. Untuk menilai spesifisitas dan
untuk menguji keakuratan database referensi spektrum
MS, satu set buta 63 strain klinis dari Koleksi Jamur yang
disebutkan di atas diuji. Panel ini termasuk 33 strain jamur
milik spesies jamur yang berbeda dan total 30 strainH.
capsulatum. Semua strain yang termasuk dalam penelitian
ini sebelumnya telah diidentifikasi dengan mengurutkan
wilayah ITS.22
Protokol ekstraksi protein dari miselia dan ragi
Ekstraksi protein dari semua jamur BSL-3 dilakukan di bawah
fasilitas BSL-3 sesuai dengan hukum Spanyol (Real Decreto
664/1997). Bentuk miselium disubkultur pada tabung Sabouraud
dextrose agar (SBDA) dan ditumbuhkan pada suhu 30◦C selama
2-3 minggu. Untuk konversi fase ragi, kultur miselium disubkultur
pada media brain heart infusion agar (BHIA) yang mengandung
glutamin (200 nmol/ml) dan ditambah dengan 10% darah domba
selama 2-3 minggu lagi pada suhu 37◦C. Kemudian, bentuk ragi
dipertahankan pada media BHIA yang mengandung glutamin (200
nmol/ml).
Persiapan sampel untuk ekstraksi protein dilakukan
mengikuti instruksi pabrik (Bruker Daltonics, Bremen, Jerman).
Secara singkat, bahan jamur (sepotong miselium berdiameter
5 mm atau satu hingga dua koloni ragi) dikumpulkan dengan
hati-hati dari permukaan kultur dengan loop inokulasi steril
dan ditempatkan di 300μl air steril. Kemudian, 900μl etanol
absolut ditambahkan. Setelah sentrifugasi pada 13.000 rpm
selama 3 menit, supernatan dibuang, dan pelet kering
disuspensikan kembali dalam 10-20 menit.μl asam format 70%
ditambah asetonitril 100% dengan volume yang sama. Setelah
sentrifugasi singkat, 1μl dari supernatan digunakan untuk
melakukan pengukuran spektrum massa.
Valero dkk.
Tabel 1. H. capsulatum strain yang digunakan untuk membangun database referensi untuk identifikasi MALDI-ToF.
Tekanan IndoA FaseB Contoh Asal
CM-2721 Hcc KU Adenopati serviks
CM-4626 Hcd M kaki manusia
CM-5731 Hcc KU DASAR
CM-5788 Hcd KU Biopsi
CM-7435 Hcc M Tanah
CM-7436 Hcf M Kuda
AIdentifikasi berdasarkan analisis molekuler dan sekuensing DNA diberikan. Hcc, Histoplasma capsulatum var. capsulatum; Hcd, Histoplasma capsulatum var.
duboisii; Hcf, Histoplasma capsulatum var. farciminosum. [Nomor aksesi GenBank: KR674032, KR674033, KR674034, KR674035, KR674036, KR674037]
BKedua fase morfologi, M (miselium) dan Y (ragi), diwakili dalam database untuk tiga galur.
BAS, sekret bronkoalveolar; ATCC, Koleksi Budaya Tipe Amerika (Manassas, VA, USA); CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrech, Belanda).
Saat bekerja dengan jamur BSL-3, studi tentang inaktivasi lengkap
dalam satu set galur yang tidak termasuk dalam database
maupun di panel validasi dilakukan di bawah fasilitas BSL-3
setelah ekstraksi protein. Secara singkat, ekstrak protein yang
diperoleh seperti dijelaskan di atas dikultur dalam tabung SBDA
pada suhu 30◦C selama 2 bulan untuk memverifikasi pembunuhan
jamur yang lengkap. Setelah memverifikasi inaktivasi, semua
ekstrak protein dimanipulasi di laboratorium BSL-2 setelah
ekstraksi protein yang selalu dilakukan di bawah fasilitas BSL-3.
Akuisisi spektrum massa dan H. capsulatum
pembuatan database referensi
Singkatnya, 1 μl ekstrak protein terlihat pada pelat target
logam dan dibiarkan kering. Kemudian, 1μaku dari α
-cyano-4- larutan matriks asam hidroksi-sinamat
diendapkan ke tempat kering yang mengarah ke
kristalisasi bersama. Setiap sampel terlihat delapan kali,
dan 1μl standar uji bakteri (Bruker Daltonics, Billerica, MA,
USA) dimasukkan untuk mengkalibrasi setiap percobaan.
Pengukuran MS dilakukan dalam rangkap tiga
menggunakan Microflex LT Mass Spectrometer (Bruker
Daltonics). Sistem diatur dalam kondisi standar: mode
positif linier pada frekuensi laser 20 Hz dalam rentang
massa dari 2.000 hingga 20.000 Da. Pengaturan
parameter instrumen adalah: sumber ion 1 pada 20 kV,
sumber ion 2 pada 18,5 kV, lensa pada 8,5 kV, ekstraksi ion
berdenyut 250 ns, dan tanpa gating. Akuisisi spektrum
dilakukan secara otomatis menggunakan perangkat lunak
FlexControl (Bruker Daltonics). Semua spektrum yang
dikumpulkan dari 240 tembakan laser dari berbagai posisi
titik target dianalisis dengan paket perangkat lunak
FlexAnalysis versi 3.3 (Bruker Daltonics). Setelah
melakukan analisis kualitas,
309
Asal Geografis Asal
Amerika Selatan Asal klinis
Perbatasan Guinea-Liberia ATCC 24295
Guatemala Asal klinis
Afrika Asal klinis
Arkansas (AS) CBS 136,72 (Tipe Regangan)
Mesir CBS 536,84 (Tipe Regangan)
Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021
Referensi validasi basis data MS
Ekstraksi protein dari H. capsulatum galur yang termasuk dalam
uji validasi dilakukan pada hari yang berbeda dari pertumbuhan
kultur untuk menetapkan waktu optimal minimum untuk
menghasilkan spektrum yang sesuai (data tidak ditampilkan). Dari
miselia, ekstrak protein diperoleh dari kultur umur 7 hari,
sedangkan kultur pertumbuhan 5 hari digunakan untuk isolat
khamir.
Enam puluh tiga strain klinis dimasukkan dalam pengujian:
33 strain jamur milik spesies jamur yang berbeda dan 30
strain H. capsulatum termasuk kedua varietas patogen
manusia (24 H. capsulatum var. capsulatumdan enam H.
capsulatum var. duboisii strain). Enam strain milik spesies
jamur yang menyebabkan mikosis endemik (Blastomyces
dermatitidis, Coccidioides immitis, C. posadasii, dan
Paracoccidioides brasiliensis) dimasukkan untuk
memverifikasi kekhususan database baru.
Akuisisi spektrum dilakukan dalam rangkap dua dalam uji
buta dan dianalisis terhadap database referensi MS yang
dikombinasikan dengan database komersial dan internal
lainnya: Database MALDI Biotyper (v. 4.0.0.1, entri database
5627, Bruker Daltonics), Database MALDI untuk Aspergillus
Bagian fumigati (I. Quiles, N. Seara, T. Peláez, J. Mingorance,
dan J. Garcı́a-Rodrı́guez, dipresentasikan pada Kongres
Mikologi Nasional XII, Bilbao, SP, 18 hingga 20 Juni 2014) dan
Perluasan Basis Data MALDI untuk Identifikasi Ragi.23
Hanya identifikasi dengan dua atau lebih kecocokan
dengan strain yang termasuk dalam database referensi yang
dianggap sebagai identifikasi yang benar, jika tidak, prosedur
ekstraksi protein diulang 2-3 kali.
Hasil
Konstruksi dari H. capsulatum database
referensi
Analisis MALDI-ToF dari enam strain (sembilan entri total) yang digunakan sebagai
referensi untuk membangun database memberikan spektrum dengan
310
kualitas yang cukup untuk menghasilkan spektrum utama (MSP) dan
membangun database referensi MS. Sebagai catatan, spektrum yang
diperoleh untuk semua isolat yang termasuk dalam database referensi
menunjukkan keragaman yang besar (Gbr. S1). Untuk analisis,
database referensi baru ini digabungkan dengan beberapa database
yang mencakup sejumlah besar spesies jamur (lihat validasi database
Referensi MS di bagian Metode).
Validasi dari H. capsulatum database referensi
Hasil identifikasi MALDI-ToF untuk 63 galur yang termasuk dalam
uji validasi dirangkum dalam Tabel 2. Pertama, strain spesies
jamur yang menyebabkan mikosis endemik (B. dermatitis, C.
immitis, C. posadasii, dan P. brasiliensis) tidak diidentifikasi oleh
database baru yang diperluas karena tidak disertakan dalam
database komersial maupun internal, yang menunjukkan
kekhususan database baru ini. Dengan pengecualian galur ini,
persentase keseluruhan dari identifikasi yang benar adalah 91,2%
(52/57). Secara singkat, semua strain milik "non-H. capsulatum”
spesies diidentifikasi dengan benar kecuali untuk kesalahan pada
tingkat spesies untuk genus Sporidiobulus, Sporothrix, mucoR,
Fusarium, dan Trichophyton. Skor dalam semua kasus berada di
atas 1,7, yang dianggap oleh produsen sebagai skor batas untuk
identifikasi genus yang memadai. TentangH. capsulatum strain,
semua diidentifikasi dengan benar dan 86,6% (26/30) memiliki
skor di atas 1,7. Ketika menganalisis hasil untuk bentuk miselium
dan ragi dari galur yang sama, identifikasi yang paling dapat
diandalkan diamati untuk bentuk miselium. Skor di bawah 1,7
diamati pada 50% isolat ragi (14/7), sedangkan hanya 13,3% yang
diamati dalam bentuk miselium (4/30).
Mempertimbangkan semua isolat dari H. capsulatum termasuk
dalam uji validasi (bentuk ragi dan miselium), skor identifikasi
yang diperoleh untuk 44 isolat yang diuji didistribusikan di sekitar
rata-rata 1,78 dengan standar deviasi 0,15 (Gbr. S2). Tergantung
pada cutoff yang dipilih, nilai sensitivitas bervariasi dari 75% (cut-
off 1,7) hingga 100% (cutoff 1,4); namun, spesifisitas adalah 100%
dalam semua kasus (Tabel3). Sebagai catatan, kami tidak dapat
mencapai konversi fase ragi selama 16H. capsulatum ketegangan.
Diskusi
Diagnosis klasik histoplasmosis didasarkan pada kultur dan
analisis histopatologi dari biopsi jaringan. Budaya memakan
waktu dan perlu dikonfirmasi dengan metode lain. Analisis
histopatologi juga dapat menyebabkan kesalahan identifikasi
dengan mikroorganisme lain seperti:leishmania sp.24 Selain
itu, kedua metode memerlukan personel yang terampil untuk
identifikasi struktur jamur yang benar. Tes serologis secara
definitif tidak informatif karena
Mikologi Medis, 2018, Jil. 56, No.3
pasien imunosupresi menunjukkan jumlah negatif palsu yang
tinggi dan orang-orang yang berasal dari daerah endemik dapat
memberikan hasil positif palsu. Deteksi antigen adalah metode
yang berguna dalam infeksi diseminata tetapi tidak tersedia di
banyak laboratorium klinis.25 Beberapa metode molekuler juga
telah dikembangkan baru-baru ini, tetapi tidak ada konsensus di
antara laboratorium dan tidak ada metode komersial terkini yang
tersedia.26 Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi MALDI-ToF
telah terbukti menjadi alat yang andal dan memadai untuk
mengidentifikasi mikroorganisme patogen. Selain itu, teknik ini
tidak memerlukan teknisi berpengalaman dan mengurangi biaya
serta waktu respons. Banyak kelompok penelitian telah
Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021
memfokuskan pekerjaan mereka pada standarisasi identifikasi
spesies jamur dengan teknologi MALDI-ToF, terutama untuk
spesies dari genusKandidat dan Aspergillus,27,28 namun ada
beberapa daerah yang belum tereksplorasi. Sejumlah besar
spesies jamur patogen tidak terwakili dalam database MS yang
paling umum digunakan dan diskriminasi di antara beberapa
spesies tidak cukup didefinisikan.
Mengenai patogen jamur BSL-3, studi tentang aplikasi
MALDI-ToF jarang, mungkin karena kesulitan bekerja di
bawah fasilitas BSL-3 dengan jamur ini, yang juga tumbuh
lambat. Dalam karya ini, semua ekstrak protein dariH.
capsulatum kultur diperoleh di fasilitas BSL-3 dan uji inaktivasi
dilakukan sebelum menanganinya di fasilitas BSL-2. Sejauh
pengetahuan kami, kami telah mengembangkan database MS
referensi pertama untuk mengidentifikasi:H. capsulatum
menggunakan teknologi MALDI-ToF yang mencakup kedua
tahap morfologi jamur. Strain yang digunakan untuk
konstruksi basis data referensi telah diidentifikasi sebelumnya
dengan mengurutkan wilayah ITS. Beberapa dari strain ini
diperoleh dari koleksi referensi internasional kultur mikroba.
Basis data ini telah terbukti spesifik dan andal untuk
mengidentifikasiH. capsulatumoleh MALDI-ToF. Semua jenisH.
capsulatum diidentifikasi dengan benar, dan 86% mencapai
skor keandalan untuk identifikasi genus yang ditunjukkan
oleh pabrikan. Spesies jamur yang terkait erat dan dimorfik,
sepertiB. dermatitis, P. brasiliensis, dan C.imitis, tidak
menghasilkan hasil apa pun karena tidak terwakili dalam
database baru yang diperluas. Fakta ini mendukung
spesifisitas tinggi yang dicapai untukH. capsulatum
identifikasi spesies. Mengenai bentuk miselium dan ragi dari
galur yang sama, hasil yang paling dapat diandalkan
diperoleh untuk bentuk miselium, karena 86,6% isolat
memiliki skor di atas 1,7. Lima puluh persen ragi memberikan
skor rendah antara 1,4 dan 1,7.
Skor identifikasi diperoleh untuk 44 isolat dari
H. capsulatum didistribusikan di sekitar rata-rata 1,78
dengan standar deviasi 0,15 (Gbr. S2). Skor antara 1,7 dan
2,0 dianggap sebagai identifikasi hanya-genus yang andal
oleh pabrikan. Namun, beberapa penulis telah
Valero dkk. 311

Meja 2. Rincian 63 galur jamur yang termasuk dalam panel spesifisitas dan identifikasinya oleh MALDI-ToF MS ketika dianalisis terhadap
database referensi MS untuk H. capsulatum dikombinasikan dengan database MS komersial dan internal lainnya.

Tekanan IndoA FaseB CATATAN Analisis MALDI-ToFC

Indo Skor log

CL-52 Candida albicans ATCC 64551 Candida albicans 2.23

CL-182 Sporidiobulus salmonicolor Sporobolomyces salmonicolor 1.939
CL-199 candida kefyr candida kefyr 2.154
CL-212 Cryptococcus gattii Cryptococcus gattii 2.101
CL-1258 Candida krusei ATCC 6258 Candida krusei 2.364
CL-1787 candida glabrata ATCC 90030 candida glabrata 2.389
CL-1789 Kandida parapsilosis ATCC 22019 Kandida parapsilosis 2.383
CL-1791 Cryptococcus neoformans ATCC 90112 Cryptococcus neoformans 1,897

Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021

CL-1844 candida lusitanie candida lusitanie 2.258
CL-2671 Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae 1,864
CL-3736 Trichosporon dermatitis Trichosporon mucoides 2.296
CL-6328 Kandida ortopsilosis ATCC 96139 Kandida ortopsilosis 2.234
CL-7127 Candida guilliermondii Candida guilliermondii 2.279
CL-8796 Candida tropicalis Candida tropicalis 2.209
CM-10 Trichophyton rubrum Trichophyton rubrum 1.98
CM-2580 Aspergillus fumigatus ATCC 204305 Aspergillus fumigatus 2.089
CM-2908 Paracoccidioides brasiliensis M Tidak ada DB

kamu Tidak ada DB

CM-2911 Coccidioides posadasii M Tidak ada DB

CM-3112 Mucor circinelloides Mucor ramosissimus 1.934

CM-3113 Blastomyces dermatitidis kamu Tidak ada DB

CM-3114 Blastomyces dermatitidis M Tidak ada DB

CM-3115 Blastomyces dermatitidis M Tidak ada DB

kamu Tidak ada DB

CM-3197 Fusarium oxysporum Fusarium proliferasi 1,865

CM-3508 Aspergillus terreus Aspergillus terreus 2.095
CM-3509 Aspergillus flavus Aspergillus flavus 1.711
CM-3578 Microsporum canis Microsporum canis 2.041
CM-4244 Rhizopus microsporus Rhizopus microsporus 2.273
CM-7111 Sporothrix schenckii M Sporothrix schenckii 1.423
CM-7229 Sporothrix globosa M Sporothrix schenckii 1.42
CM-7274 Scedosporium apiospermum Scedosporium apiospermum 2.039
CM-7095 Scedosporium aurantiacum Scedosporium aurantiacum 1,829
CM-7325 Coccidioides immitis M Tidak ada DB

CM-7576 Trichophyton mentagrophytes Trichophyton interdigitale 1.92

CM-2854 Hcc M Hcc (Y) 1.714
CM-2906 Hcc M Hcf (M) 1.734
CM-2907 Hcc M Hcc (M) 2.011
CM-3036 Hcc M Hcf (M) 2.09
CM-3153 Hcc M Hcc (M) 1.786
kamu Hcc (Y) 1.768
CM-3221 Hcc M Hcc (M) 1.919
CM-3576 Hcc M Hcf (M) 1.717
CM-4892 Hcc M Hcc (M) 1.706
kamu Hcc (Y) 1.46
CM-4921 Hcc M Hcc (M) 1,896
kamu Hcc (Y) 1.66
CM-5659 Hcc M Hcc (M) 1.815
kamu Hcf (M) 1.684
CM-5678 Hcc M Hcc (M) 1.784
kamu Hcf (M) 1.51
CM-5692 Hcc M Hcc (M) 1.684
CM-5787 Hcc M Hcd (M) 1.722
312 Mikologi Medis, 2018, Jil. 56, No.3

Meja 2. (Lanjutan).

Tekanan IndoA FaseB CATATAN Analisis MALDI-ToFC

Indo Skor log

kamu Hcf (M) 1.823

CM-6015 Hcc M Hcd (M) 1,821
kamu Hcc (M) 1.548
CM-6066 Hcc M Hcc (Y) 1.744
kamu Hcc (Y) 1.998
CM-6305 Hcc M Hcf (M) 1.75
CM-6306 Hcc M Hcf (M) 1.793
kamu Hcc (Y) 1.654
CM-6307 Hcc M Hcf (M) 1.809

Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021

CM-6409 Hcc M Hcc (M) 1,854
kamu Hcc (Y) 1.611
CM-6556 Hcc M Hcc (M) 1.642
CM-7001 Hcd M Hcf (M) 1.95
kamu Hcc (Y) 1.926
CM-7255 Hcd M CBS 215.53 Hcf (M) 1.592
CM-7256 Hcd M CBS 175.57 Hcc (M) 1,473
CM-7257 Hcd M CBS 114388 Hcd (M) 1.786
CM-7434 Hcc M CBS 287,54 Hcf (M) 1,883
kamu Hcc (Y) 1,865
CM-7441 Hcc M Hcc (M) 1,873
CM-7450 Hcc M Hcc (M) 1.721
kamu Hcc (Y) 2.108
CM-7514 Hcc M Hcc (M) 1.743
kamu Hcc (M) 1.703
CM-7704 Hcd M Hcd (M) 1.995
CM-7767 Hcd M Hcd (M) 1.99

AIdentifikasi berdasarkan analisis molekuler dan sekuensing DNA diberikan. Hcc, Histoplasma capsulatum var. capsulatum; Hcd, Histoplasma capsulatum var.duboisii; Hcf,
Histoplasma capsulatum var. farciminosum.
BKedua fase morfologi, M (miselium) dan Y (ragi), dirinci untuk jamur dimorfik.
CSkor log kecocokan terbaik dan identifikasi yang disediakan oleh sistem untuk analisis MALDI-ToF disertakan untuk setiap galur. Setiap strain diuji dalam rangkap dua dan 2-3
pengulangan pengujian dilakukan. dalam kasusH. capsulatum strain, keadaan morfologi skor log kecocokan terbaik juga ditentukan di antara tanda kurung. Untuk galur yang tidak
terwakili dalam basis data apa pun, baik identifikasi maupun skor log tidak dicantumkan.
ATCC, Koleksi Budaya Tipe Amerika (Manassas, VA, USA); CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrech, Belanda); Tidak ada DB, regangan tidak terwakili dalam
database yang dianalisis.

Tabel 3. Sensitivitas dan spesifisitas sesuai dengan nilai batas cutoff ke 1,6, sensitivitas naik drastis menjadi 93,3% di H.
MALDI-ToF yang berbeda untuk semua H. capsulatum isolat (ragi capsulatum ketegangan.
dan miselia). Skor buruk yang diperoleh dengan beberapa isolat ragi,
bahkan ketika ekstraksi protein berulang, dapat dijelaskan oleh
Nilai potong Sensitivitas (%) Spesifisitas (%)
kesulitan untuk mendapatkan konversi murni dari miselium
1.4 100 100 menjadi ragi. Faktanya, konversi fase ragi dicapai hanya untuk
1.5 95.5 100 hampir 50% dari semuaH. capsulatum strain termasuk dalam
1.6 88.6 100
pekerjaan ini. Selain itu, keterbatasan bekerja di bawah fasilitas
1.7 75 100
BSL-3, tidak memungkinkan perubahan kondisi kultur atau
> 1.7 40.9 100
prosedur ekstraksi protein. Di sisi lain, bahkan jika metode
ekstraksi mungkin bukan yang paling memadai untuk hasil
menganggap skor ini sangat konservatif untuk jamur,23,29– terbaik, itu memungkinkan pembunuhan jamur secara
33 membuktikan peningkatan sensitivitas ketika menyeluruh yang penting untuk menjamin keselamatan pekerja.
menurunkan skor "spesies aman", sedangkan akurasi Basis data referensi baru tidak dapat melakukan
teknik selalu dipertahankan. Berdasarkan studi ini, analisis diskriminasi yang tepat antara tiga varietas jamur: hanya
sensitivitas dan spesifisitas dilakukan dengan menguji 28 dari 44 isolat (63,6%) yang termasuk dalam panel
skor cutoff yang berbeda (Tabel2). Saat menurun spesifisitas yang cocok dengan varietas yang benar. Ini
Valero dkk.
fakta dapat dijelaskan oleh hubungan filogenetik yang
kompleks di antara ketiga varietas, seperti yang dijelaskan
sebelumnya oleh penulis lain34,35 yang menyatakan bahwa
klasifikasi tradisional dalam tiga varietas tidak ada artinya.
Selain itu, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, metode
ekstraksi standar yang digunakan tidak optimal untuk jenis
jamur ini dan dapat mempengaruhi daya diskriminasi teknik.
Dalam pengaturan klinis, identifikasi varietas tidak relevan
karena pengobatan akan tetap sama.
Spektrum dari tahap ragi dan miselium jamur dimasukkan
dalam database dengan tujuan untuk mengidentifikasi kedua
fase dengan benar. Dalam percobaan awal, kami menemukan
bahwa kedua fase dari strain yang sama memberikan
spektrum yang sama sekali berbeda (Gbr. S1). Hal tersebut
mungkin disebabkan oleh perbedaan profil ekspresi gen pada
khamir dan bentuk miselium yang telah dijelaskan oleh
Edwards et al.36 Melihat hasil, ada identifikasi silang parsial
antara kedua fase: tujuh isolat dari 44 (15,9%) dalam fase
morfologi cocok dengan galur pada fase lain yang diwakili
dalam database. Alasan dari pengamatan tersebut mungkin
karena strain ini tidak sepenuhnya dikonversi ke fase yang
tepat.
Dalam karya ini, kultur muda (7 hari pertumbuhan untuk
miselia dan 5 hari untuk ragi) telah digunakan dalam uji validasi
dengan hasil yang sesuai. Ini merupakan penurunan waktu yang
berarti dibandingkan dengan metode identifikasi klasik
berdasarkan pengamatan mikroskopis kultur. Pada 7 hari
pertumbuhan, sebagian besar isolat miselium yang termasuk
dalam pengujian tidak menunjukkan makrokonidia tuberkulosis
yang khas untuk identifikasinya.
Akhirnya, terlepas dari kesulitan bekerja dengan jenis jamur
yang tumbuh lambat ini dalam kondisi BSL-3, kami mencapai
spesifisitas yang sangat baik dengan melakukan validasi dalam
kondisi yang paling mirip dengan pengaturan klinis nyata (uji
buta, pengujian hanya dua duplikat, menggunakan instruksi
pabrik untuk prosedur ekstraksi, dll.). Tujuan ini dan kapasitas
metode ini untuk mengantisipasiH. capsulatum identifikasi dari
kultur berbeda dengan metode klasik, menyoroti potensi
teknologi MALDI-ToF untuk meningkatkan diagnosis
histoplasmosis dan organisme BSL-3 lainnya.
Kesimpulannya, database MS referensi kami kuat dan
cocok untuk H. capsulatum identifikasi di kedua fase
morfologi jamur dan memungkinkan kemajuan dalam
diagnosis histoplasmosis. Selanjutnya, penanganan minimalH.
capsulatum budaya diperlukan untuk melakukan ekstraksi
protein, mengurangi risiko biosafety. Teknik ini dapat
dilakukan di laboratorium diagnostik klinis dan mikrobiologis
rumah sakit dan lembaga penelitian lainnya dengan
penyimpanan biosafety yang tepat. Namun, penelitian lebih
lanjut tentang taksonomi jamur dan penyempurnaan
beberapa parameter untuk meningkatkan konstruksi
313
tion perpustakaan spektrum referensi MALDI-ToF MS
diperlukan.
Materi tambahan
Data tambahan tersedia di MMYKOL on line.
ucapan terima kasih
Kami dengan hormat berterima kasih kepada Frank Hodgkins atas pembacaan dan penyuntingan
naskahnya dengan cermat.
Pekerjaan ini didukung oleh proyek penelitian PI11/00412 dan
Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021
PI14CIII/00045 dari Spanyol Fondo de Investigaciones Sanitarias
dari Instituto de Salud Carlos III.
CV didukung oleh beasiswa penelitian dari Fondo de
Investigaciones Sanitarias dari Kementerian Ekonomi dan Daya
Saing Spanyol (FI12/00095).
SG didukung oleh persekutuan penelitian dari Fondo de
Investigaciones Biomedicas dari Kementerian Sains dan Inovasi
Spanyol (FI10/00464).
Pernyataan minat
Para penulis melaporkan tidak ada konflik kepentingan. Penulis sendiri
bertanggung jawab atas isi dan penulisan makalah.
Referensi
1. Sayang ST. Morfologi parasit (Histoplasma capsulatum) dan lesi
histoplasmosis, penyakit fatal di Amerika Tropis. J Exp Med. 1909;11:
515–531.
2. Loulergue P, Bastides F, Baudouin V et al. Tinjauan literatur dan sejarah kasus
Histoplasma capsulatum var. Duboisii infeksi pada pasien yang terinfeksi HIV.
Emerg Infect Dis. 2007;13: 1647–1652.
3. Kauffman CA, Histoplasmosis. Obat Dada Clin. 2009;30: 217–225, V.
4. Al-Ani FK. Limfangitis epizootik pada kuda: tinjauan literatur.Rev Sci Tech.
1999;18: 691–699.
5. Buitrago MJ, Cuenca-Estrella M. [Epidemiologi saat ini dan diagnosis
laboratorium mikosis endemik di Spanyol]. Enferm Infecc Microbiol Clin.
2012;30: 407–413.
6. Gugnani HC. Histoplasmosis Di Afrika: Sebuah Tinjauan. Indian J Chest Dis
Allied Sci. 2000;42: 271–277.
7. Huber F, Nacher M, Aznar C dkk. terkait AIDSHistoplasma capsulatumvar.
capsulatum infeksi: 25 tahun pengalaman Guyana Prancis. AIDS. 2008;
22: 1047–1053.
8. Gandum LJ, Kauffman CA. Histoplasmosis.Menginfeksi Dis Clin North Am.
2003;17: 1–19, Vii.
9. Kauffman CA. Histoplasmosis: pembaruan klinis dan laboratorium.Clin
Microbiol Rev. 2007;20: 115-132.
10. Buitrago MJ, Berenguer J, Mellado E dkk. Deteksi histoplasmosis impor dalam
serum pasien terinfeksi HIV menggunakan uji berbasis PCR waktu nyata.
Mikrobiol Eur J Clin Menginfeksi Dis. 2006;25: 665–668.
11. Buitrago MJ, Gomez-Lopez A, Monzon A dkk. [Penilaian metode PCR
kuantitatif untuk diagnosis klinis histoplasmosis impor].Enferm Infect
Microbiol Clin. 2007;25: 16–22.
12. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A dkk. Waktu ionisasi desorpsi laser yang
dibantu matriks dari spektrometri massa penerbangan: perubahan
mendasar dalam praktik rutin mikrobiologi klinis.Clin Microbiol Rev.
2013;26: 547–603.
314
13. Cassagne C, Ranque S, Normand AC dkk. Identifikasi rutin cetakan di
laboratorium klinis dengan bantuan matriks laser desorpsi ionisasi waktu
penerbangan spektrometri massa.Plos Satu. 2011;6: E28425.
14. Coulibaly O, Marinach-Patrice C, Cassagne C et al. Pseudallescheria/
Scedosporium identifikasi spesies kompleks dengan spektrometri massa
desorpsi laser berbantuan matriks. Med Mycol. 2011;49: 621–626.
15. Quiles-Melero I, Garcia-Rodriguez J, Gomez-Lopez A dkk. Evaluasi
spektrometri massa desorpsi/ionisasi laser berbantuan matriks (MALDI-
Tof) untuk identifikasiKandida parapsilosis, C. ortopsilosis, dan C.
metasilosis. Mikrobiol Eur J Clin Menginfeksi Dis. 2012;31: 67–71.
16. De Carolis E, Posteraro B, Lass-Florl C dkk. Identifikasi spesiesAspergillus,
Fusarium dan Mucorales dengan analisis permukaan langsung dengan
matriks berbantuan laser desorpsi ionisasi waktu penerbangan spektrometri
massa. Infeksi Mikrobiol Klin. 2012;18:475–484.
17. Becker PT, De Bel A, Martiny D dkk. Identifikasi isolat jamur berfilamen dengan
spektrometri massa MALDI-Tof: evaluasi klinis dari perpustakaan spektrum
referensi yang diperluas.Med Mycol. 2014;52: 826–834.
18. Lau A, Drake S, Calhoun L dkk. Pengembangan basis data klinis yang
komprehensif dan prosedur sederhana untuk identifikasi cetakan dari media
padat dengan waktu ionisasi desorpsi laser berbantuan matriks dari
spektrometri massa penerbangan.J Clin Mikrobiol. 2013;51: 828–834.
19. De Almeida JNJ, Del Negro GM, Grenfell RC dkk. MALDI-Tof spektrometri
massa untuk identifikasi cepat jamur dimorfikParacoccidioides
Brasiliensis dan Paracoccidioides Lutzii. J Clin Mikrobiol. 2015,53: 1383–
1386.
20. Kondori N, Erhard M, Welinder-Olsson C dkk. Analisis jamur hitam
dengan desorpsi/ionisasi laser berbantuan matriks spektrometri massa
waktu terbang (MALDI-Tof MS): identifikasi tingkat spesies dari isolat
klinisExophiala Dermatitidis. Fems Microbiol Lett. 2015; 362: 1–6.
21. Gautier M, Ranque S, Normand A dkk. Matrix-assisted laser desorption
ionization time-of-flight spektrometri massa: merevolusi diagnosis
laboratorium klinis infeksi jamur.Infeksi Mikrobiol Klin. 2014;20: 1366–
1371.
22. Rodriguez-Tudela JL, Cuesta I, Gomez-Lopez A dkk. [Teknik molekuler
dalam mikologi].Enferm Infecc Microbiol Clin. 2008; 26 Pasokan13: 47–
53.
23. Vlek A, Kolecka A, Khayhan K dkk. Perbandingan antar laboratorium metode
preparasi sampel, perluasan basis data, dan nilai batas untuk identifikasi ragi
dengan waktu ionisasi desorpsi laser berbantuan matriks
Mikologi Medis, 2018, Jil. 56, No.3
spektrometri massa penerbangan menggunakan panel uji ragi. J Clin Mikrobiol. 2014;
52: 3023–3029.
24. Guimaraes A, Nosanchuk J, Zancope-Oliveira R. Diagnosis histoplasmosis.
Braz J Microbiol. 2006;37: 1–13.
25. Gandum L. Perbaikan dalam diagnosis histoplasmosis. Opini Ahli Biol
Ada. 2006;6: 1207–1221.
26. Buitrago M, Canteros C, Frias De L dkk. Perbandingan protokol PCR untuk
mendeteksiHistoplasma capsulatum DNA melalui studi multicenter.Pendeta
Iberoam Micol. 2013;30: 256–260.
27. Alanio A, Beretti JL, Dauphin B dkk. Matriks-dibantu laser desorpsi ionisasi
spektrometri massa waktu penerbangan untuk identifikasi cepat dan akurat
yang relevan secara klinisAspergillus jenis. Infeksi Mikrobiol Klin. 2011;17:
750–755.
28. Bader O, Weig M, Taverne-Ghadwal L dkk. Peningkatan identifikasi
laboratorium klinis dari ragi patogen manusia dengan bantuan matriks laser
Diunduh dari https://academic.oup.com/mmy/article/56/3/307/4055889 oleh tamu pada 04 Desember 2021
desorpsi ionisasi waktu-of-flight spektrometri massa.Infeksi Mikrobiol Klin.
2011;17: 1359–1365.
29. Pence M, Mcelvania T, Wallace M dkk. Perbandingan dan optimalisasi dua
platform MALDI-Tof MS untuk identifikasi spesies ragi yang relevan secara
medis.Mikrobiol Eur J Clin Menginfeksi Dis. 2014;33: 1703–1712.
30. Buchan B, Ledeboer N. Kemajuan dalam identifikasi isolat ragi klinis dengan
menggunakan matriks-dibantu laser desorpsi ionisasi-waktu spektrometri
massa penerbangan. J Clin Mikrobiol. 2013;51: 1359–1366.
31. Ghosh AK, Paul S, Sood P dkk. matriks-dibantu laser desorpsi ionisasi
spektrometri massa waktu penerbangan untuk identifikasi cepat ragi yang
menyebabkan infeksi aliran darah.Infeksi Mikrobiol Klin. 2015;21: 372–378.
32. Theel E, Hall L, Mandrekar J dkk. Identifikasi dermatofit menggunakan
matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass
spectrometry.J Clin Mikrobiol. 2011;49: 4067–4071.
33. Pinto A, Halliday C, Zahra M dkk. Waktu ionisasi desorpsi laser yang dibantu
matriks dari identifikasi spektrometri massa penerbangan bergantung pada
spektrum referensi yang kuat.Plos Satu. 2011;6: E25712.
34. Kasuga T, TJ Putih, Koenig G dkk. Filogeografi patogen jamurHistoplasma
capsulatum. Mol Ecol. 2003;12: 3383–3401.
35. Vite-Garin T, Estrada-Barcenas D, Cifuentes J et al. Pentingnya analisis
molekuler untuk memahami keragaman genetikHistoplasma
capsulatum: gambaran. Pendeta Iberoam Micol. 2014;31: 11–15.
36. Edwards J, Chen C, Kemski M dkk. Histoplasma ragi dan transkriptom miselium
mengungkapkan fase patogenik dan profil ekspresi gen spesifik garis
keturunan. Bmc Genomics. 2013;14: 695.