NAMA : MARIA GUILANI JELANU

NIM : 1904060186

DOSEN PA : DR.IR.I.G.B.ADWITA ARSA.M.P

UAS : BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

AMPLIFIKASI DNA MENGGUNAKAN PCR

A. Pengertian PCR (Polymerase Chain Reaction)

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in
vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali
dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi
akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali
banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana
cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan
non-target. Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan
perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik,
infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic,
legal and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of
genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

 Manfaat dari amplifikasi DNA dalam menggunakan PCR yaitu:

 Penyusun peta genetik
 Analisisi struktur genetik populasi
 Sidik jari individu
 Penanda khas pada bagiam genom
 Dan pemetaan sifat-sifat
 4 komponen utama amplifikasi DNA
 ensim DNA polimerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas
polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini
mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95ºC. Biasanya untuk setiap
100μl volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5 unit.
 Nucleotides (dNTPs)
Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM.
Pada konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada
titik estimasi Km untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0.
Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim
polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan
spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP
dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.
 Primers

Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini
harus mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar
amplifikasi sepasang primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar
20 basa panjangnya pada tiap primernya. Kandungan GC harus antara 45-
60%. Annealing temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar
antara 1°C. Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari
susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG,
GGC, GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer,
penting diperhatikan urutan primer tidak saling komplementer sehingga
membentuk dimer-primers, berikatan satu sama lain, atau
membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA
repetitif.
  Template DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau
1KB, Hasil amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun
kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien,
karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi
kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini 
dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.
 Tahap Proses PCR

Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA
cetakan, (2) oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang
terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan
untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. PCR melibatkan banyak siklus
yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan
(denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada
DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang
dikatalisis oleh DNA polimerase.

 Denaturasi

Ini adalah proses PCR yang melakukan pemisahan (denaturasi) rantai DNA
templat. Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi
dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi
menyebabkan putusnya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang komplemen.
Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi
polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan
antara suhu 90 ˚C – 95 ˚C.
  Penempelan primer

Proses selanjutnya adalah penempelan primer. Pada tahap penempelan primer

(annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen
dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan
terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini
biasanya dilakukan pada suhu 50 ˚C – 60 ˚C. Selanjutnya, DNA polymerase
akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat
dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi
selanjutnya, misalnya pada 72 ˚C.
 Reaksi polimerisasi (extension)

Pada tahap PCR bernama extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA dari
sampel, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA
target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses
pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang
urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan
diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurang dari 500bp hanya 30 detik
dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari
1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya.  Adapun temperatur ekstensi
berkisar antara 70-72°C.
Salah satu jenis metode PCR adalah Real-time PCR.
 Prinsip Kerja Real-Time PCR
Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh
molekul reporter yang meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal
ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul
reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada double-
stranded DNA  atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific
probes.
Instrumen Real-Time PCR bekerja berdasarkan prinsip PCR. Namun berbeda
dengan instrument yang konvensional, dengan RT-PCR, kita dapat mengamati
tahap penggandaan DNA target secara real-time dari satu PCR ke siklus
selanjutnya tanpa perlu melakukan elektroforesis (agarose) untuk melihat
hasilnya. RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) adalah teknik yang
digunakan untuk mengendalikan DNA target dari suatu organisme yang bertujuan
untuk mengetahui kualitas DNA target. RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative
PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit,
dapat dihitung secara kuantitatif. Selain itu, instrumen ini juga dapat melihat
kualitas DNA secara relative, ekspresi gen (kuantifikasi mRNA), deteksi
keberadaan DNA target, menentukan jenis SNP (Single Nucleotide
Polymorphism), Menentukan kurva Tm (Melting Curve), dan melakukan
screening High Resolution Melting (HRM). Analisis menggunakan Real time
PCR memiliki sensitivitas tinggi dan lebih spesifik untuk produk PCR tertentu.
Real Time PCR juga meliputi Real Time-RT PCR dimana PCR dilakukan secara
Real Time menggunakan enzim Reverse Transcriptase secara langsung pada
waktu bersamaan. Komponen utama Real Time PCR adalah thermal cycler
(mesin PCR),  optical modul (pendeteksi fluoresensi selama reaksi) dan komputer
(membaca dan memindahkan data fluoresensi ke layar monitor, serta dapat
disimpan dalam berkas).