Machine Translated by Google

METODE

lintas

Metode Inokulasi Dapat Mempengaruhi Hasil

Eksperimen Mikrobiologis
Kasper Nørskov Kragh, seorang Maria Alhede, a Morten Rybtke, Camilla Stavnsberg, Peter . Jensen, a, b Tim Tolker-Nielsen, a
Marvin Whiteley, c Thomas Bjarnsholta, b

a Universitas Kopenhagen, Departemen Imunologi dan Mikrobiologi, Kopenhagen, Denmark

bRigshospitalet, Departemen Mikrobiologi Klinis, Kopenhagen, Denmark
c Departemen Biosains Molekuler, Pusat Penyakit Menular LaMontagne, Sekolah Kedokteran Dell,
Universitas Texas di Austin, Austin, Texas, AS

ABSTRAK Selama 150 tahun terakhir, bakteri telah diselidiki terutama dalam cairan
budaya batch. Berlawanan dengan kebanyakan harapan, kultur ini bukanlah campuran homogen
bakteri sel tunggal, karena agregat bakteri yang mengambang bebas akhirnya berkembang di
sebagian besar kultur batch cair. Agregat ini memiliki karakteristik yang sama dengan biofilm,
seperti peningkatan toleransi antibiotik. Kami menyelidiki bagaimana agregat berkembang dan
apa yang mempengaruhi perkembangan ini dalam kultur batch cair Pseudomonas aeruginosa.
Kami fokus pada bagaimana metode inokulasi mempengaruhi agregasi dengan menilai frekuensi
dan ukuran gerbang agregat menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal. Beberapa tradisional
metode memulai kultur bakteri semalam, yaitu, inokulasi langsung dari beku
kultur, inokulasi menggunakan sel yang ditumbuhkan agar, atau inokulasi menggunakan sel yang ditumbuhkan dalam cairan

budaya, diselidiki. Kami menemukan hubungan langsung antara metode inokulasi

dan ukuran dan frekuensi agregat biofilm dalam kultur batch cair, dengan inokulasi langsung dari
piring menghasilkan agregat paling banyak dan terbesar. Ini
agregat besar memiliki dampak keseluruhan pada toleransi kultur berikutnya terhadap bramisin,
menunjukkan bahwa metode inokulasi memiliki dampak besar pada antibiotik
toleransi. Kami juga mengamati mekanisme di mana agregat yang terbentuk sebelumnya merekrut
sel-sel tunggal dari kultur sekitarnya dalam "efek bola salju," membangun agregat
biomassa dalam kultur. Rekrutmen ini ditemukan sangat bergantung pada exopolysaccha ride Psl.
Selain itu, kami menemukan bahwa Escherichia coli dan Staphylococcus aureus menghasilkan
agregat dalam kultur batch cair. Hasil kami menekankan pentingnya inokulasi
konsistensi di seluruh eksperimen dan pengembangan agregat dampak substansial di
kultur batch cair mungkin memiliki hasil percobaan mikrobiologi.

PENTING Kultur cair murni sangat penting untuk bidang mikrobiologi

riset. Kultur ini biasanya dianggap sebagai campuran homogen dari bakteri sel tunggal; penelitian
ini menunjukkan bahwa ini tidak selalu benar. Bakteri dapat berkumpul dalam kultur cair ini. Agregasi Diterima 13 Oktober 2017 Diterima 9
Desember 2017
dapat diinduksi dengan metode
Naskah yang diterima diposting online 21
dipilih untuk inokulasi. Kehadiran agregat dapat secara signifikan mengubah hasil eksperimen Desember 2017
dengan mengubah fenotipe kultur. Studi ini menemukan Kutipan Kragh KN, Alhede M, Rybtke M,
mekanisme dimana agregat yang telah dibentuk sebelumnya dapat merekrut single . di sekitarnya Stavnsberg C, Jensen PØ, Tolker-Nielsen T,
Whiteley M, Bjarnsholt T. 2018. Inokulasi
sel dalam bentuk efek bola salju, menciptakan agregat yang lebih banyak dan lebih besar dalam
metode dapat mempengaruhi hasil dari
kultur. Setelah terbentuk, agregat ini sulit dihilangkan. Agregat dalam kultur cair mungkin merupakan percobaan mikrobiologi. Lingkungan Appl
tantangan besar yang tak terlihat bagi ahli mikrobiologi. Mikrobiol 84:e02264-17. https://doi.org/10
.1128 / AEM.02264-17.

Editor Shuang-Jiang Liu, Akademi Tiongkok

Agregasi KATA KUNCI , Pseudomonas aeruginosa, biofilm ilmu pengetahuan

Hak Cipta © 2018 American Society for

Mikrobiologi. Seluruh hak cipta.
zaman Robert Koch dan Walter Hesse, budidaya dalam kultur cair murni
Alamat korespondensi kepada Thomas Bjarnsholt,
Sejak
telah menjadi andalan untuk studi bakteri (1). Saat bekerja dengan bakteri tbjarnsholt@sund.ku.dk.
kultur batch cair, sering diasumsikan bahwa kultur terdiri dari

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan aem.asm.org 1
Machine Translated by Google

Kragh dkk. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

populasi homogen sel bakteri tunggal. Asumsi ini didasarkan pada fakta bahwa kultur cair
umumnya dianggap dimulai dari klon sel bakteri tunggal (1–3). Dengan teknik tradisional
menggoreskan stok beku atau kultur cair ke media padat, peneliti dapat memilih koloni yang
berasal dari, secara teori, bakteri tunggal dari genotipe atau morfologi tertentu dan untuk
memeriksa kultur untuk kontaminasi (3, 4). Selanjutnya, koloni dapat dipilih dan digunakan
untuk menginokulasi kultur cair untuk mempelajari bakteri dalam keadaan mengambang bebas
(planktonik) (1, 4, 5).

Sebagian besar mahasiswa biologi sarjana telah diajarkan pola pertumbuhan kultur batch
cair bakteri yang dijelaskan oleh fase pertumbuhan yang berbeda (6-9). Ketika sel diinokulasi
ke dalam media kultur segar, mereka awalnya memasuki fase lag. Selama fase lag, sel
menyesuaikan diri dengan media segar dengan mensintesis protein yang mempersiapkan sel
untuk pertumbuhan (9-14). Fase ini panjangnya bervariasi, tergantung pada keadaan
pertumbuhan sel yang diinokulasi, dan seluruh populasi kultur terdiri dari inokulum.
Ketika sel-sel telah menyesuaikan diri dengan lingkungan baru, mereka mulai bertambah
jumlahnya melalui pertumbuhan eksponensial (14-16). Selama fase eksponensial ini,
pertumbuhan yang cepat menghasilkan penurunan yang cepat dalam proporsi populasi yang diinokulasi awal.
Mengikuti pertumbuhan eksponensial, laju pertumbuhan menurun dan akhirnya populasi
memasuki fase stasioner. Pada fase stasioner, sel tidak membelah atau membelah pada
kecepatan yang sama saat mereka mati, sehingga mempertahankan jumlah populasi yang
stabil (17). Pada akhirnya, populasi memasuki “fase kematian” di mana jumlah populasi
berkurang (18). Asumsi dasar pertumbuhan bakteri batch adalah bahwa penurunan proporsi
populasi yang diinokulasi menghilangkan semua residu keadaan fenotipik dari inokulum awal.

Baru-baru ini, telah ada peningkatan fokus pada penyelidikan derajat homo gen dari kultur
batch cair. Schleheck dan rekan menunjukkan bagaimana agregat nonattached dari patogen
oportunistik Pseudomonas aeruginosa terbentuk secara spontan dalam kultur batch cair (19).
Setelah 6 jam pertumbuhan, 90% dari biomassa kultur terdiri dari bakteri agregat dalam bola
dengan diameter 5 sampai 600 m.
Dengan ekspresi berlebih dari eksopolisakarida Psl, P. aeruginosa menunjukkan peningkatan
agregasi dalam kultur cair (20). Untuk P. aeruginosa, studi ini memiliki signifikansi klinis karena
agregat biofilm nonattached diusulkan untuk memainkan peran sentral dalam sejarah kehidupan
bakteri, baik di lingkungan dan selama infeksi (21-25).
Agregat yang tidak terikat menyajikan karakteristik fenotipik yang sama dengan biofilm yang
menempel pada permukaan, termasuk peningkatan toleransi dan ketahanan antibiotik terhadap
respon imun, dibandingkan dengan sel tunggal (25). Dengan demikian, frekuensi agregat yang
tidak terikat dalam kultur laboratorium cair memiliki efek yang signifikan tidak hanya pada
fenotipe tingkat populasi seperti toleransi antibiotik tetapi juga pada reproduktifitas eksperimen
di dalam dan di antara laboratorium (25-27).
Kemampuan untuk melakukan eksperimen mikrobiologi in vitro secara konsisten selalu
menjadi aspek mendasar dari penelitian mikrobiologi. Di antara banyak manfaat lainnya,
asumsi bahwa kultur batch cairan bakteri relatif homogen telah mendorong penggunaan
mikroba sebagai sistem eksperimental di banyak bidang ilmiah lainnya, termasuk fisika, teknik,
dan evolusi. Namun, perbedaan dalam praktik di antara laboratorium sering kali dapat
menyebabkan hasil yang berbeda berdasarkan protokol yang sama. Kami telah menyelidiki
bagaimana metode yang digunakan untuk menginokulasi kultur batch mempengaruhi
pengembangan agregat biofilm yang tidak terikat dan selanjutnya hasil eksperimen muncul.
Kami menemukan bahwa agregat biomassa dari kultur cair P. aeruginosa bergantung pada
metode inokulasi, dengan inokulasi langsung menggunakan koloni yang ditumbuhkan agar
mengarah ke tingkat biomassa agregat tertinggi. Tingkat agregasi memiliki efek diwariskan
yang mendalam pada fenotipe populasi bakteri berikutnya, termasuk toleransi antibiotik. Data
yang disajikan di sini menekankan pentingnya konsistensi dalam alur kerja eksperimental untuk
mengontrol efek agregat tidak terikat yang tidak diinginkan dalam eksperimen. Variasi dalam
metode inokulasi, disengaja atau tidak, mungkin memiliki efek hilir yang mempengaruhi
kesimpulan eksperimen.

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 2

Machine Translated by Google

Inokulasi Mempengaruhi Agregasi dalam Kultur Cair Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 1 Gambar skema dari empat cara menginokulasi kultur batch cair. Metode 1, stok beku ke piring,
koloni dipetik dan ditambahkan ke LB untuk kultur semalam dalam tabung reaksi, dan kemudian diinokulasi
untuk percobaan; metode 2, stok beku ke piring dan kemudian inokulasi langsung koloni; metode 3, stok
beku ke LB untuk kultur semalam dalam tabung reaksi dan kemudian diinokulasi; metode 4, inokulasi
langsung dari stok beku.

HASIL
Pertumbuhan dan agregasi dalam kultur yang diinokulasi dengan berbagai
metode. Untuk menguji dampak metode inokulasi pada pertumbuhan agregat dan
kelimpahan dalam kultur cair, empat metode inokulasi yang berbeda dievaluasi setelah 4
dan 18 jam pertumbuhan, diinokulasi ulang, dan kemudian dievaluasi lagi setelah 4 dan 18
jam tambahan (Gbr. 1). Kultur yang diinokulasi dengan kaldu lisogen (LB) kultur semalam
dari satu koloni (metode 1) atau langsung dari satu koloni dari piring (metode 2) atau dari
kultur semalam LB dimulai dari stok beku (metode 3) tumbuh dengan pertumbuhan yang
menunjukkan
sebanding(P kinetika
meningkat0,49).
faseKultur
lag, dibandingkan
yang diinokulasi
dengan
langsung
kulturdari
lain,stok
selama
beku7(metode
jam pertama
4)
(P 0,003) (lihat Gambar.
S2 dalam materi pelengkap). Setelah 24 jam pertumbuhan, keempat kultur telah mencapai
kepadatan sel yang sama (P 0,75).
Agregasi dievaluasi dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) setelah 4 dan
18 jam dalam kultur generasi pertama (didefinisikan sebagai kultur yang awalnya diinokulasi
dengan berbagai metode) (Gbr. 2). Secara signifikan lebih banyak biomassa teragregasi
diamati setelah 4 jam dalam kultur yang diinokulasi dari satu koloni dari piring (metode 2),
dibandingkan dengan kultur dari satu koloni yang tumbuh di LB semalaman sebelum
inokulasi (metode 1) (P 0,02) dan kultur yang diinokulasi dari stok beku ditanam di LB
semalaman sebelum inokulasi (metodestok 3) (Pbeku
0,04). Kulturbervariasi
sangat yang diinokulasi langsung dari
dalam kelimpahan
agregasi tetapi ditunjukkan secara signifikan

Gambar 2 Gambar representatif dari kultur cair P. aeruginosa generasi pertama setelah pertumbuhan 18 jam ketika diinokulasi dengan
empat metode uji. (A) Metode 1. (B) Metode 2. (C) Metode 3. (D) Metode 4. Kumpulan gambar 3D Easy z-stack ditampilkan. Pembesaran, 630.

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 3

Machine Translated by Google

Kragh dkk. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 3 Fraksi total biomassa P. aeruginosa dalam agregat untuk kultur yang diinokulasi dengan empat metode berbeda. (A) Agregasi
dalam kultur setelah 4 jam dalam kultur generasi pertama. (B) Agregasi dalam budaya setelah 18 jam dalam budaya generasi pertama. (C) Agregasi dalam
kultur setelah 4 jam dalam kultur generasi kedua. (D) Agregasi dalam kultur setelah 18 jam dalam kultur generasi kedua. Agregat adalah
didefinisikan sebagai kluster sel dengan biomassa yang mengandung volume minimal 250 m3. Biomassa dinormalisasi ke nilai OD600 dari
budaya. Batang mewakili sarana dengan kesalahan standar sarana (SEM). AKTIF, semalaman.

lebih banyak agregasi daripada yang ditemukan untuk metode 1 dan 3 (P 0,02, 0,001 dan P

masing-masing) (Gbr. 3A). Setelah 18 jam pertumbuhan, kultur diinokulasi dari piring (metode
2) menunjukkan lebih banyak agregat daripada semua metode lain yang diuji (Gbr. 3B).
Kultur generasi pertama diencerkan hingga kepadatan optik pada 600 nm (OD600) dari
0,005 dalam media segar dan ditanam selama 4 jam tambahan untuk membuat generasi kedua
budaya. Setelah 4 jam, kultur generasi kedua awalnya diinokulasi dari piring
(metode 2) mengandung biomassa agregat yang secara signifikan lebih banyak daripada kultur yang
diinokulasi dengan metode 1 (P 0,02) tetapi tidak lebih signifikan daripada kultur yang diinokulasi dengan
metode 3 atau 4 (P 0,14 dan P 0,59, masing-masing) (Gbr. 3C). Setelah 18 jam pertumbuhan generasi
kedua, kultur yang diinokulasi dengan metode 2 memiliki biomassa agregat yang jauh lebih banyak daripada
kultur yang diinokulasi dengan metode 1 dan 3 (P 0,002 dan P 0,002, masing-masing). Kultur yang diinokulasi
dengan metode 4 menunjukkan kecenderungan yang sama untuk
agregat lebih banyak daripada yang diinokulasi dengan metode 1 dan 3 (P 0,02 dan P 0,02,
masing-masing) (Gbr. 3D). Dengan demikian, inokulasi langsung dari piring agar menghasilkan lebih banyak
agregasi dalam kultur cair daripada inokulasi dari kultur semalam LB cair.
Toleransi terhadap tobramycin. Untuk menguji apakah metode inokulasi diubah
toleransi antibiotik, kultur terkena tobramycin selama 24 jam pada konsentrasi

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 4

Machine Translated by Google

Inokulasi Mempengaruhi Agregasi dalam Kultur Cair Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 4 Kelangsungan hidup biakan P. aeruginosa diobati dengan 10 g ml 1 tobramycin selama 24 jam. (A) Kelangsungan hidup dalam sampel yang diambil setelah 4 jam dalam
kultur generasi pertama. (B) Kelangsungan hidup dalam sampel yang diambil setelah 18 jam dalam kultur generasi pertama. (C) Kelangsungan hidup dalam sampel yang diambil
setelah 4 jam dalam kultur generasi kedua. (D) Kelangsungan hidup dalam sampel yang diambil setelah 18 jam dalam kultur generasi kedua. Persentase kelangsungan hidup
didasarkan pada CFU dalam kultur yang diobati versus yang tidak diobati. Bar mewakili sarana dengan SEM. AKTIF, semalaman.

10 kali lebih tinggi dari MIC standar yang ditentukan oleh Etest untuk P. aeruginosa (25, 28).
Setelah 4 dan 18 jam pertumbuhan pada kultur generasi pertama dan kedua, sampel ditantang
dengan 10 g ml 1 tobramycin selama 24 jam. Kultur yang dirawat setelah 4 jam pertumbuhan dalam
kultur generasi pertama, yang diinokulasi dari pelat (metode 2), memiliki tingkat kelangsungan hidup
yang lebih tinggi secara signifikan daripada kultur yang diinokulasi dari kultur semalam LB (metode 1 atau 3)
(P 0,048 dan P 0,03, masing-masing). Tidak ada peningkatan kelangsungan hidup dalam kultur yang
dimulai dari stok beku (metode 4), dibandingkan dengan yang diinisiasi dari kultur semalam LB
(metode 1 atau 3), yang diamati (Gbr. 4A). Setelah 18 jam, hubungan yang sama ada; Kultur yang
diinokulasi piring (metode 2) memiliki tingkat kelangsungan hidup yang jauh lebih tinggi daripada
kultur yang diinokulasi LB-semalam (metode 1 dan 3) (P 0,014 dan P 0,029, masing-masing). Kultur
yang diinokulasi dari kultur beku yang diinokulasi (metode 4) memiliki kelangsungan hidup yang sama
seperti yang terlihat pada kultur yang diinokulasi dari LB (metode 1 dan 3) (Gbr. 4B).
Pada kultur generasi kedua, hasil yang sama diamati setelah 4 jam pertumbuhan.
Kultur dari piring (metode 2) memiliki peningkatan kelangsungan hidup dibandingkan dengan kultur
dari LB semalam (metode 1 dan 3) (P 0,041 dan P 0,042, masing-masing). Namun, kultur stok beku
yang diinokulasi (metode 4) tidak menunjukkan peningkatan kelangsungan hidup dibandingkan
dengan LB yang diinokulasi semalaman (metode 1 dan 3) (Gbr. 4C). Setelah 18 jam pertumbuhan
dalam kultur generasi kedua, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kelangsungan hidup untuk
setiap metode inokulasi (Gbr. 4D).
Pemecahan agregat dengan sonikasi. Untuk menguji apakah gangguan pada agregat yang
telah terbentuk sebelum inokulasi dapat menghilangkan perbedaan dalam agregasi

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 5

Machine Translated by Google

Kragh dkk. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 5 Presentasi CLSM dari agregat P. aeruginosa dalam kultur generasi kedua setelah 4 jam pertumbuhan.
Kultur generasi pertama diinokulasi hanya dengan P. aeruginosa yang mengekspresikan GFP menurut metode
2. Pada reinokulasi ke dalam kultur generasi kedua, kultur generasi pertama diencerkan dan dicampur 1:1
dengan kultur sel tunggal P. .aeruginosa mengekspresikan mCherry. Panah pirus menandai inti pusat sel yang
mengekspresikan GFP. Inti ini dikelilingi oleh campuran sel yang mengekspresikan GFP dan mCherry. (A)
Tampak atas dan samping. (B) Gambar 3D Easy yang dikompilasi dari semua slide dalam z-stack. Pembesaran,
630.

terlihat dalam kultur, inokulum disonikasi sesaat sebelum inokulasi, menurut garis panduan
European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) untuk diagnostik
biofilm (29). Sonikasi tidak memecah agregat yang terbentuk sebelumnya yang ditemukan di
inokulum dari koloni yang ditumbuhkan agar (metode 2) sampai tingkat yang signifikan (P
0,54) (Gbr. S3). Kultur yang diinokulasi tumbuh selama 18 jam dan dievaluasi kembali. Setelah
18 jam, kultur yang diinokulasi dari piring (metode 2) memiliki agregat besar yang terlihat yang
diamati dengan CLSM, seperti yang terlihat pada kultur yang diinokulasi dengan inokula
nonsonik. Kultur yang diinokulasi dari stok beku (metode 4) memiliki beberapa derajat agregasi
juga. Tidak ada agregat yang terbentuk sebelumnya dapat ditemukan dalam inokula dari kultur
semalam LB (metode 1 dan 3) (Gbr. S4). Data ini menunjukkan bahwa sonikasi tampaknya
tidak dapat mengganggu agregat yang terbentuk sebelumnya.
Agregat kultur campuran. Untuk menjelaskan mekanisme pembentukan agregat dalam
kultur generasi kedua, kultur generasi pertama yang mengekspresikan PAO1 green fluorescent
protein (GFP) yang mengandung agregat diencerkan dan dicampur 1:1 dengan kultur yang
mengekspresikan PAO1 mCherry dari sel tunggal planktonik. . Dengan CLSM, kami dapat
mengamati agregat yang terbentuk dalam kultur generasi kedua setelah 4 jam pertumbuhan.
Dalam beberapa agregat, terlihat inti bening yang terdiri dari sel bertanda GFP yang dikelilingi
oleh lapisan campuran sel bertanda GFP dan mCherry; tidak ada inti yang terdiri dari sel
bertanda mCherry yang diamati (Gbr. 5). Temuan ini menunjukkan bahwa agregat terbentuk
baik selama proses inokulasi atau dalam kultur generasi pertama dan bahwa, ketika
dipindahkan ke kultur generasi kedua, agregat merekrut kembali sel-sel planktonik dari kultur
sekitarnya.
Keterlibatan komponen matriks biofilm dalam pembentukan agregat. Untuk
menyelidiki mekanisme yang mendasari perekrutan sel tunggal yang diamati di sekitar agregat,
kami menguji kemampuan beberapa galur P. aeruginosa dengan defisiensi yang berbeda
dalam produksi matriks ekstraseluler untuk beragregasi dalam kultur cair. Strain PAO1 yang
kekurangan dalam produksi eksopolisakarida Psl menunjukkan penurunan agregasi yang
signifikan, dibandingkan dengan PAO1 tipe liar dan strain PAO1 yang kekurangan dalam
produksi Pel eksopolisakarida (P 0,0105 dan P 0,0049, masing-masing). Penghapusan CdrA
adhesin permukaan, yang telah terbukti berhubungan dengan perjalanan Psl exopolysaccha
(30), tidak mempengaruhi kemampuan untuk beragregasi, dibandingkan dengan strain tipe
liar. Penurunan agregasi mirip dengan mutan PAO1 psl juga diamati untuk P. aeruginosa galur
PA14, galur yang tidak mampu menghasilkan Psl (31), menunjukkan bahwa fenotipe tidak
spesifik untuk galur PAO1 (P 0,0094) (Gbr. 6) .
Untuk menyelidiki lebih lanjut keterlibatan eksopolisakarida Psl dalam perekrutan agregat
sel tunggal dalam kultur cair, strain dengan produksi Psl yang dapat diinduksi dan defisiensi
Pel (ÿpel PBAD -psl) telah dibuat. Agregasi psl-diinduksi atau tidak diinduksi

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 6

Machine Translated by Google

Inokulasi Mempengaruhi Agregasi dalam Kultur Cair Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 6 Fraksi biomassa P. aeruginosa hadir sebagai agregat untuk galur dengan berbagai kekurangan
dalam produksi matriks ekstraseluler. Kultur diinokulasi menurut metode 2 dan diperiksa setelah 18 jam
pertumbuhan dalam kultur generasi pertama. Strain yang diuji adalah PAO1 wild type (WT), PAO1 pel,
PAO1 psl, PAO1 cdrA, PAO1 psl cdrA, dan PA14 wild type. Bar mewakili sarana dengan SEM.

kultur serupa setelah 4 jam pertumbuhan; setelah 18 jam pertumbuhan, bagaimanapun, ada lebih banyak
biomassa teragregasi secara signifikan dalam kultur di mana produksi Psl diinduksi, dibandingkan dengan
kultur yang tidak diinduksi (P 0,037). Menggunakan kultur yang diinduksi dan tidak diinduksi ini sebagai
inokula menunjukkan bahwa fenotipe agregat dilestarikan dalam kultur generasi kedua (P 0,0039),
menunjukkan bahwa fenotipe agregat dapat diwariskan setidaknya selama beberapa generasi (Gbr. 7).

Untuk menguji keterlibatan DNA ekstraseluler (eDNA) dalam perekrutan sel tunggal dan dalam
integritas struktural agregat, kultur yang diinokulasi langsung dari piring diperlakukan dengan DNase.
Setelah 4 jam pengobatan, tidak ada perbedaan dalam tingkat agregasi antara kultur yang diobati dengan
DNase dan tidak dapat diamati (P 0,38). Setelah 18 jam, kultur yang diberi perlakuan dengan DNase
memiliki biomassa yang teragregasi secara signifikan (P 0,0019), dibandingkan dengan kultur
diberi
yang tidak
perlakuan (Gbr. S5).
Stabilitas populasi agregat dalam budaya berkelanjutan. Berapa lama fenotipe agregat dapat
bertahan? Untuk menjawab pertanyaan ini, percobaan chemostat jangka panjang dilakukan dengan
campuran 1:1 sel bertanda GFP dan mCherry dan laju pengenceran 0,2 per jam (waktu penggandaan
bakteri selama 5 jam). Baik populasi bertanda GFP dan mCherry diinokulasi menggunakan koloni yang
ditumbuhkan agar (metode 2), dalam upaya untuk menginduksi agregasi awal yang maksimal. Untuk
seluruh durasi percobaan (13 hari), agregat hadir ke tingkat yang sebanding dengan budaya batch 18-
jam. Namun, jumlah populasi agregat menurun menjelang akhir 13 hari. Ini mungkin akibat dari pertukaran
konstan medium, dengan pengenceran lambat dari populasi agregat karena pembentukan agregat tidak
mampu mengikuti pengenceran (Gbr. 8A). Dengan pemeriksaan visual dari agregat yang diproduksi dalam
budaya, pola yang jelas muncul. Sebagian besar agregat memiliki zona bening dari bakteri satu warna
dalam 2 hingga 3 hari pertama (Gbr. 8B) tetapi, seiring dengan berjalannya percobaan, agregat mulai
tampak lebih homogen dan bercampur antara galur yang diberi tag GFP dan mCherry (Gbr. 8C). Dengan
demikian, agregat tetap menjadi bagian yang stabil dari populasi setidaknya selama 7 sampai 9 hari
setelah inokulasi.

Agregasi spesies bakteri patogen umum lainnya dalam kultur cair.

Untuk menguji apakah hubungan yang diamati antara metode inokulasi dan
derajat agregasi adalah fenomena umum, Escherichia coli dan Staphylococ cus aureus diuji dalam uji
agregasi. Inokulasi dari koloni agar-tumbuh dan kultur semalam LB (metode 2 dan 3, masing-masing)
digunakan

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 7

Machine Translated by Google

Kragh dkk. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 7 Fraksi biomassa agregat dari strain PAO1 pel PBAD -psl dalam kultur yang diinokulasi menurut
metode 2, ke dalam LB dengan atau tanpa arabinosa 2% (untuk menginduksi psl). Setelah 24 jam pertumbuhan,
kultur diinokulasi ulang ke media LB segar dengan atau tanpa arabinosa 2%, menciptakan empat kultur
generasi kedua. (Atas) Kultur generasi pertama diambil sampelnya setelah 4 dan 18 jam. (Kiri bawah) Kultur
yang diinokulasi ulang dari kultur asli yang tidak diinduksi (tanpa arabinosa). (Kanan bawah) Kultur yang
diinokulasi ulang dari kultur asli yang diinduksi (2% arabinosa). Bar mewakili sarana dengan SEM.

sebagai dua ekstrim induksi agregat, menurut hasil dari percobaan P. aeruginosa. E. coli
menunjukkan peningkatan agregasi, dibandingkan dengan PAO1, dengan rata-rata fraksi
populasi agregat sekitar 0,7 setelah 4 jam pada kultur generasi pertama dan sekitar 0,2 pada
kultur generasi pertama berusia 18 jam. Tidak ada korelasi yang signifikan antara metode
inokulasi dan tingkat agregasi yang diamati untuk E. coli. S. aureus menunjukkan hubungan
yang sama antara inokulasi langsung dari piring dan peningkatan agregasi selama pertumbuhan
awal (4 jam) seperti yang terlihat untuk kultur P. aeruginosa (P 0,0001) (Gbr. 9). Dengan
demikian, agregasi dalam kultur cair tidak terbatas pada P. aeruginosa.

Untuk menilai apakah perekrutan sel tunggal ke agregat dapat terjadi antara spesies yang
berbeda, P. aeruginosa dan E. coli yang ditandai dicampur seperti dijelaskan di atas. Sel-sel
E. coli yang telah digabungkan sebelumnya dicampur dengan sebagian besar sel tunggal P.
aeruginosa. Setelah 18 jam pertumbuhan gabungan, beberapa agregat dengan pusat E. coli
berwarna tunggal dapat ditemukan dengan campuran P. aeruginosa dan E. coli yang
mengelilingi pusat (Gbr. 10).

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 8

Machine Translated by Google

Inokulasi Mempengaruhi Agregasi dalam Kultur Cair Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 8 Temuan dari biakan kemostat yang ditumbuhkan selama 13 hari. (A) Fraksi agregat biomassa pada sampel yang diambil pada hari ke 0, 1, 2, 5, 7, 9, dan 13 pascainokulasi.
Bar mewakili sarana dengan SEM. (B) Proyeksi tiga dimensi agregat dalam kultur chemostat setelah 2 hari pertumbuhan. Panah merah dan hijau menunjukkan bagian agregat berwarna tunggal. (C) Proyeksi tiga
dimensi agregat dalam kultur chemostat setelah 9 hari pertumbuhan. Agregat terdiri dari populasi campuran sel darah merah dan hijau yang keduanya awalnya diinokulasi langsung dari piring, dalam upaya untuk
membedakan antara agregat asli (monocolor) dan agregat yang dihasilkan dalam kultur chemostat (warna campuran). Pembesaran, 630.

DISKUSI
Mikrobiologi telah melihat kebangkitan sebagai ahli biologi evolusioner, fisikawan, dan
insinyur telah mengadopsi sistem model mikroba untuk menguji teori dan memproduksi
dan menguji produk. Sudut pandang mikrobiologi tradisional adalah bahwa populasi yang
tumbuh di tabung reaksi relatif homogen dan berbeda dari bakteri yang tumbuh di biofilm.
Hasilnya adalah bahwa perbedaan fenotipik, termasuk peningkatan toleransi terhadap
antibiotik dan pertahanan inang, sering diasumsikan untuk membedakan sel planktonik
tabung-tumbuh dari biofilm (32-34). Di sini kami menunjukkan bahwa metode inokulasi
kultur planktonik memiliki efek mendalam pada fenotipe yang diamati, termasuk toleransi
antibiotik.
Toleransi antibiotik kultur planktonik tergantung pada agregasi bakteri, yang bervariasi
berdasarkan metode inokulasi. Memang, tingkat kelangsungan hidup meningkat terlihat
untuk kultur P. aeruginosa diinokulasi langsung dari koloni di piring sesuai dengan temuan
bahwa kultur ini memiliki biomassa lebih agregat dan

Gambar 9 Fraksi biomassa agregat untuk kultur E. coli dan S. aureus yang diinokulasi menggunakan metode 2 atau metode 3. Kultur dievaluasi untuk agregasi
setelah 4 dan 18 jam pertumbuhan. (Kiri) E.coli. (Kanan) S.aureus. Bar mewakili sarana dengan SEM.
AKTIF, semalaman.

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 9

Machine Translated by Google

Kragh dkk. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Gambar 10 Dua contoh proyeksi tiga dimensi dari kumpulan multispesies. Sel E. coli bertanda GFP
dari kultur kaya agregat dicampur dengan kultur P. aeruginosa sel tunggal yang didominasi. Setelah
18 jam pertumbuhan, kultur campuran mengandung sebagian besar agregat dengan inti pusat E. coli
hijau bertanda GFP (ditandai dengan panah biru) dikelilingi oleh campuran sel E. coli hijau dan P.
aeruginosa bertanda mCherry merah sel.

bahwa tobramycin, antibiotik yang dikenal untuk membunuh sel-sel yang tumbuh aktif (35), gagal
membunuh bagian dari agregat yang tidak terikat (25). Oleh karena itu, kemungkinan peningkatan
toleransi tobra mycin dari kultur yang diinokulasi menggunakan metode 2 adalah hasil dari sel yang
dilindungi baik karena penurunan aktivitas metabolisme di bagian populasi agregat yang lebih besar
atau sebagai akibat dari Psl yang memberikan efek pelindung terhadap tobramycin ( 36, 37).
Perbedaan tersembunyi dalam toleransi antibiotik di antara kultur yang identik secara makroskopis
ini dapat memiliki efek besar pada hasil berbagai penelitian; misalnya, ini bisa menjadi kasus dalam
pengujian kerentanan agen antimikroba, di mana agregasi dalam kultur dapat menginduksi berbagai
fraksi sel toleran.
Menariknya, prevalensi yang lebih besar dari biomassa agregat dalam kultur generasi kedua
yang awalnya diinokulasi dari koloni atau langsung dari stok beku dipertahankan bahkan setelah
pengenceran 1.000 kali lipat dalam media segar. Ini menunjukkan bahwa budaya yang pertama kali
diunggulkan dengan agregat mewarisi frekuensi agregasi budaya induk dan mempertahankannya
selama beberapa generasi. Kami mengusulkan bahwa pemeliharaan frekuensi agregat dalam kultur
generasi kedua dimediasi oleh perekrutan sel-sel planktonik ke gerbang agregat yang telah dibentuk
sebelumnya, yang menghasilkan agregat yang lebih besar yang pada akhirnya menyemai agregat
yang lebih kecil yang sekali lagi merekrut sel-sel planktonik, menghasilkan efek bola salju dari
pembentukan agregat. Usulan kami didukung oleh fakta bahwa kami dapat menemukan inti dari
agregat leluhur dalam agregat yang diproduksi dalam kultur generasi kedua, yang menunjukkan
bahwa bagian inti ini diwarisi dari kultur generasi pertama dan sel yang direkrut. Fakta bahwa kultur
chemostat kami mempertahankan frekuensi agregat tinggi selama 7 hari (33 generasi) menunjukkan
bahwa kegagalan untuk memperhatikan kemungkinan pengenalan agregat yang dibentuk sebelumnya
mungkin memiliki dampak penting baik untuk eksperimen jangka pendek maupun jangka panjang.
Psl telah terbukti berulang kali penting untuk pembentukan biofilm P. aeruginosa yang menempel
di permukaan (30, 38, 39). Hasil kami menunjukkan ketergantungan yang sama dalam pembentukan
agregat nonattached dalam fase cair. CdrA adhesin terkait Psl tidak diperlukan untuk agregasi,
menunjukkan bahwa Psl tidak memerlukan adhesin ini untuk agregasi. Berbeda dengan Psl, Pel
eksopolisakarida, yang telah menjadi fokus perhatian besar karena keterlibatannya dalam biofilm P.
aeruginosa (40, 41), tidak terlibat dalam pembentukan agregat dalam sistem kami. Dengan demikian,
eksopolisakarida Psl tampaknya menjadi mediator sentral untuk perekrutan sel tunggal di sekitar
agregat yang dibentuk sebelumnya yang dimasukkan ke dalam kultur cair. eDNA dilaporkan
sebelumnya penting untuk integritas agregat biofilm (25). Dengan penghilangan eDNA dari kultur
dengan suplementasi DNase, kami tidak melihat adanya perubahan agregasi pada jam-jam awal
pertumbuhan (4 jam), dibandingkan dengan kultur yang tidak diberi perlakuan. Berbeda dengan ini,
semua agregat dikeluarkan dari kultur pada tahap akhir pertumbuhan (18 jam). Temuan ini
menunjukkan bahwa eDNA terlibat sebagai perekat yang mempertahankan kekompakan struktur
agregat, serta Psl, tetapi mungkin tidak begitu penting untuk perekrutan sel tunggal dalam kultur
muda.

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 10

Machine Translated by Google

Inokulasi Mempengaruhi Agregasi dalam Kultur Cair Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

Kemampuan E. coli untuk beragregasi dalam biakan cair sangat mengagumkan tetapi tidak
terpengaruh oleh metode inokulasi. Perlu dicatat bahwa, bahkan dengan metode yang ditemukan
untuk menghasilkan agregasi paling sedikit untuk P. aeruginosa, kultur E. coli masih dapat
mengandung hampir 70% biomassa dalam keadaan teragregasi. Hal ini menimbulkan pertanyaan
kapan, jika pernah, kultur E. coli adalah campuran sel tunggal yang benar-benar homogen.
Salah satu mediator yang mungkin dari kecenderungan tinggi untuk agregat ini adalah curli, yang
telah terbukti memainkan peran utama dalam kemampuan E. coli untuk membentuk agregat dan
untuk melekat pada permukaan (42, 43). Meskipun ekspresi curli di sebagian besar strain E. coli
diakui mencapai maksimum selama pertumbuhan di bawah 30°C, strain K-12 yang digunakan
dalam penelitian ini menghasilkan curli pada 37°C (43). Menariknya, kami menemukan bahwa
agregat E. coli yang terbentuk sebelumnya mampu merekrut campuran sel tunggal E. coli dan P.
aeruginosa, menciptakan agregat multispesies. Temuan ini mengungkapkan area yang sama
sekali baru dari kemungkinan interaksi antara spesies bakteri teragregasi dan mengarah pada
gagasan biofilm teragregasi multi spesies.
Agregasi S. aureus setelah 4 jam pertumbuhan lebih besar ketika kultur diinokulasi dari piring
daripada ketika mereka diinokulasi dari kultur semalam LB, seperti yang ditemukan dengan P.
aeruginosa. Berbeda dengan apa yang diamati dengan P. aeruginosa, bagaimanapun, hampir
tidak ada agregat yang dapat ditemukan pada kultur S. aureus berumur 18 jam. Pembubaran
agregat dalam kultur S. aureus yang lebih tua mungkin dijelaskan oleh kemampuan S. aureus
untuk mensekresi protease pada fase stasioner akhir, yang memungkinkan sel untuk menyebar
dari keadaan agregat ke keadaan sel tunggal. Sekresi protease K, misalnya, diatur oleh sistem
agr quorum-sensing (QS) pada S. aureus (44). Terlepas dari kemungkinan penyebaran fase diam
yang terlambat ini, hasil kami menunjukkan efek dari metode inokulasi pada S. aureus dalam
kultur fase eksponensial awal yang serupa dengan yang terlihat untuk P. aeruginosa.
Menariknya, Haaber et al. dijelaskan sebelumnya bagaimana agregat S. aureus merekrut sel
tunggal dari fase cair sekitarnya selama fase eksponensial dan pertumbuhan fase eksponensial
akhir, dengan cara yang mirip dengan yang kami amati dengan P. aeruginosa (45).
Oleh karena itu, hasil kami dari studi E. coli dan S. aureus menunjukkan bahwa agregasi dalam
kultur cair tidak terbatas pada P. aeruginosa.
Sebagai kesimpulan, kami telah menemukan hubungan antara metode inokulasi kultur cairan
bakteri dan tingkat agregasi dalam kultur tersebut. Variasi dalam agregasi P. aeruginosa dikaitkan
dengan toleransi yang berubah terhadap antibiotik tobramycin. Perbedaan dalam agregasi dan
toleransi tobramycin ini diwarisi oleh budaya generasi berikutnya ketika mereka dimulai dari
pengenceran budaya generasi pertama. Hasil kami menekankan pentingnya konsistensi di
seluruh prosedur eksperimental yang dimulai dengan inokulasi, dan mereka menunjukkan bahwa
perbedaan dalam prosedur inokulasi dapat memiliki konsekuensi fenotipik untuk 30 generasi
pertumbuhan bakteri dan dengan demikian dapat mempengaruhi hasil eksperimen.

BAHAN DAN METODE

Strain bakteri. Strain bakteri dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 1.
Strain P. aeruginosa yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari strain PAO1, dari University of Washington
(Seattle, WA) (46). Strain P. aeruginosa PAO1 pelA PBAD -psl dibuat dari P. aeruginosa PAO1 PBAD -psl (47)
dengan pengenalan vektor pertukaran alel pelA pMPELA (20), pada dasarnya seperti yang dijelaskan dalam
referensi 48. Strain E. coli yang digunakan adalah K-12 MG1655 (ATCC 47076). Strain S. aureus RN4220, yang
secara konstitutif mengekspresikan GFP dari pAH13, digunakan (49). Untuk mengaktifkan visualisasi dengan
CLSM, galur PAO1 tipe liar dibuat untuk mengekspresikan GFP atau mCherry dengan transformasi Tn7 (50).
Strain lain diwarnai menggunakan Syto9 (Molecular Probes, USA).
Kondisi pertumbuhan. Semua percobaan pertumbuhan dilakukan pada suhu 37°C. Eksperimen dilakukan
di LB (BD, USA), dan pelat agar LB (2% [wt/vol]) digunakan untuk kultur rutin. Stok beku (80 °C) terdiri dari 80%
kultur semalam dalam LB dan 20% gliserol (Sigma, USA). Kultur cair dikocok dengan kecepatan 180 rpm.

Eksperimen pertumbuhan dan evaluasi agregat. Labu erlenmeyer diinokulasi dengan empat cara (Gbr.
1), sebagai berikut. Pada metode 1, stok beku digoreskan pada pelat LB dan dibiarkan tumbuh semalaman.
Selanjutnya, satu koloni diinokulasi ke dalam LB, ditumbuhkan semalaman, dan digunakan untuk inokulasi labu
Erlenmeyer. Pada metode 2, stok beku digoreskan pada pelat LB dan dibiarkan tumbuh semalaman. Satu koloni
dipetik, disuspensikan dalam 1 ml LB, dan digunakan untuk inokulasi labu Erlenmeyer. Pada metode 3, LB
diinokulasi langsung dari stok beku, dibiarkan tumbuh semalaman, dan digunakan untuk inokulasi labu
Erlenmeyer. Dalam metode 4, stok beku langsung disuspensikan dalam 1 ml LB sebelum inokulasi labu
Erlenmeyer.

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 11

Machine Translated by Google

Kragh dkk. Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

TABEL 1 Strain dan plasmid yang digunakan dalam penelitian ini

Strain atau plasmid Keterangan Referensi

Pseudomonas aeruginosa
PAO1 Strain tipe liar 53
PAO1 pel Mutan KO yang kekurangan pel 30
PAO1 psl Mutan KO yang kekurangan Psl 54
PAO1 cdrA Mutan KO yang kekurangan CdrA 30
PAO1 psl cdrA Mutan KO yang kekurangan Psl dan CdrA 30
PAO1 pelA PBAD -p Mutan KO yang kekurangan pel dengan ekspresi psl . Pelajaran ini
yang dapat diinduksi arabinosa
PA14 Strain tipe liar

Escherichia coli MG1655 Strain tipe liar yang berasal dari E. coli K-12 Strain 55
Staphylococcus aureus AH13 yang berasal dari S. aureus RN4220, dengan 49
ekspresi konstitutif dari gfp

Plasmid
pMPELA vektor pertukaran alel pelA Plasmid 20
pAH13 untuk ekspresi GFP di S. aureus 49

Keempat jenis inokula P. aeruginosa ditambahkan untuk mendapatkan OD600 akhir 0,005 di Erlenmeyer
labu. Setiap labu Erlenmeyer 250 ml berisi 100 ml media LB. Keempat kultur dipantau oleh
Pengukuran OD600 dengan spektrofotometer UV-1800 (Shimadzu, Jepang) setiap 30 menit selama yang pertama
7 jam pertumbuhan. Pada 4 dan 18 jam, sampel diambil untuk evaluasi mikroskopis. Budaya ini disebut
sebagai budaya generasi pertama. Titik waktu dipilih untuk mewakili kultur fase eksponensial (4 jam) dan
kultur fase diam (18 jam). Untuk evaluasi mikroskopis, 50 l kultur diterapkan pada penghitungan
ruang ( -slide VI Flat; Ibidi, Jerman). Kamar-kamar dipindai dalam tumpukan-z dalam pemindaian ubin (5 kali 5 bidang
dari pandangan; 674,56 m kali 674,56 m kali 40 m) dengan mikroskop Zeiss Imager Z2 dengan LSM 880 CLSM
sistem dan perangkat lunak Zen 2010 versi 6.0 yang menyertainya (Zeiss, Jerman). Analisis gambar Imaris
perangkat lunak (Bitplane, Swiss) digunakan untuk mengukur ukuran dan frekuensi biomassa agregat,
menggunakan paket Pengukuran Pro. Kumpulan sel padat dengan volume minimal 250 m3 adalah
dianggap sebagai agregat. Ambang batas ini dipilih untuk memungkinkan diskriminasi yang cukup dari beberapa
sel-sel tunggal yang terhubung pada permukaan dan agregat struktural tiga dimensi yang padat (lihat Gambar. S1 di
bahan pelengkap). Volume rata-rata bakteri tunggal yang diukur dengan cara ini adalah 4 m3;
oleh karena itu, agregat 250- m3 mengandung 62 sel.
Kultur generasi pertama diinokulasi kembali ke media segar setelah 24 jam pertumbuhan di Erlenmeyer
termos. Kultur berumur 24 jam diencerkan menjadi LB segar hingga OD600 akhir 0,005 (pengenceran 1.000 kali lipat) dan
tumbuh selama 18 jam tambahan, dengan sampel diambil setelah 4 dan 18 jam untuk evaluasi mikroskopis
pembentukan agregat. Budaya ini disebut sebagai budaya generasi kedua.
Agregasi strain yang kekurangan ekspresi Psl, Pel, dan CdrA. Strain PAO1 kekurangan
produksi eksopolisakarida Psl (ÿpsl) dan Pel (ÿpel) dan adhesin permukaan CdrA (ÿcdrA), sebagai
serta Psl-kekurangan P. aeruginosa strain PA14, diuji. Berdasarkan hasil dari percobaan sebelumnya, metode 2 (stok beku
kemudian cawan agar kemudian inokulasi) dipilih untuk inokulasi, untuk mencapai
populasi agregat awal terbesar yang mungkin. Strain ditanam selama 24 jam pada generasi pertama
kultur dan diinokulasi kembali ke dalam media segar dalam kultur generasi kedua sebelum dievaluasi untuk
agregasi setelah 18 jam pertumbuhan.
Strain kekurangan Pel PAO1 dengan produksi Psl yang dapat diinduksi (ÿpel PBAD -psl) juga diuji untuk agregasi. Kultur
yang diinokulasi dari pelat, menurut metode 2, ditanam di LB dengan atau tanpa 2%
arabinosa. Setelah 24 jam, biakan diinokulasi ulang ke dalam LB segar baik dengan atau tanpa arabinosa 2%.
Sampel dievaluasi untuk agregasi pada 4 dan 18 jam pertumbuhan pada generasi pertama dan kedua
budaya.
Untuk menilai keterlibatan eDNA dalam agregasi, DNase (Pulmozyme [dornase alpha]; Genentech, USA)
ditambahkan pada 0 jam setelah inokulasi kultur langsung dari piring, menurut metode 2. DNase adalah
diencerkan hingga konsentrasi akhir 90 U ml 1, yang dilaporkan sebelumnya mengganggu P. aeruginosa
agregat biofilm (25).
Agregasi E. coli dan S. aureus. Untuk evaluasi kemampuan E. coli dan S. aureus untuk beragregasi
dalam kultur batch cair, labu Erlenmeyer diinokulasi menurut metode 2 dan 3, langsung dari
agar piring atau kultur semalam LB. Agregasi dievaluasi dalam sampel yang diambil pada 4 dan 18 jam dari
budaya generasi pertama, seperti yang dijelaskan di atas.
Gangguan agregat dalam inokula oleh ultrasonikasi. Untuk mengganggu agregat yang telah dibentuk sebelumnya
pengenalan ke dalam budaya, inokula diperlakukan dengan sonikasi (USG) segera sebelum
inokulasi. Inokula dibuat berdasarkan empat metode yang dijelaskan sebelumnya dan selanjutnya
dirawat di mandi ultrasonikasi Branson 2510 (Branson, USA) dengan program yang terdiri dari 5 menit
degassing diikuti dengan ultrasonikasi selama 5 menit pada 42 kHz (6%) dan 100 W. Tingkat agregasi
dievaluasi dengan mikroskop di inokulum sebelum dan sesudah perawatan ultrasonikasi, serta di
kultur yang dihasilkan setelah 18 jam pertumbuhan.
Pengobatan antibiotik dari kultur yang diinokulasi. Kultur batch P. aeruginosa cair yang diinokulasi menurut empat
metode yang dijelaskan ditumbuhkan selama 24 jam, dengan pengocokan konstan (generasi pertama

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 12

Machine Translated by Google

Inokulasi Mempengaruhi Agregasi dalam Kultur Cair Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan

budaya). Kultur tersebut kemudian diinokulasi kembali ke dalam kultur generasi kedua dan ditumbuhkan selama 18
jam. Pada 4 dan 18 jam, dua alikuot 15 ml dari kultur (baik kultur generasi pertama dan kedua) dipindahkan ke dua
labu Erlenmeyer baru. Satu labu diperlakukan dengan 10 g ml 1 tobramycin (Sigma), dan satu dibiarkan tidak diobati
sebagai kontrol. Kultur ditumbuhkan selama 24 jam tambahan. Satu mililiter kultur dicuci tiga kali, dihilangkan gasnya
selama 5 menit, dan disonikasi sebelum pengenceran serial dan pelapisan untuk mendapatkan jumlah CFU.
Rekrutmen dan budaya campuran. Kultur galur P. aeruginosa penghasil GFP diinokulasi menurut metode 2 dan
ditumbuhkan selama 24 jam. Secara bersamaan, biakan semalam dari galur bertanda mCherry diinokulasi menurut
metode 3. Kultur semalam yang memproduksi mCherry diencerkan hingga OD600 0,005, ditumbuhkan kembali dalam
LB hingga OD600 0,1, diencerkan, dan ditumbuhkan kembali selama 3 jam dalam keadaan segar. media, untuk
menjaga pembentukan agregat seminimal mungkin. Kultur penghasil GFP generasi pertama dan kultur penghasil
mCherry sel tunggal terutama diencerkan menjadi OD600 0,005 dan dicampur dalam rasio 1:1. Kultur campuran
ditanam selama 4 jam. Sampel kemudian diambil untuk diperiksa dengan CLSM.

Agregasi antarspesies diuji dengan mencampurkan, dalam rasio 1:1, kultur P. aeruginosa bertanda mCherry sel
tunggal dengan kultur E. coli yang ditandai dengan GFP dan diinokulasi menurut metode 2.
Sampel inkubasi selanjutnya diambil untuk pemeriksaan dengan CLSM.
Agregasi dalam sel yang ditumbuhkan kemostat. Sebuah chemostat dibangun berdasarkan desain Whiteley et
al. (51). Sebuah media berdasarkan media minimal logam jejak dengan 10% (vol/vol) buffer fosfat A10 (52) dan 10%
(vol/vol) LB digunakan. Media ini menghasilkan OD450 sebesar 0,5. Chemostat berisi 200 ml kultur, dengan laju alir
40 ml h 1, menghasilkan laju pengenceran 0,2. Kultur diangin-anginkan dengan terus-menerus menggelegak udara
atmosfer melaluinya. Kultur dicampur terus menerus dengan pengaduk magnet yang diatur pada 200 rpm. Chemostat
diinokulasi dengan rasio 1:1 sel bertanda GFP dan mCherry yang diambil langsung dari pelat agar menurut metode 2.
Kultur disesuaikan dengan OD450 awal akhir 0,005. Chemostat dioperasikan selama 13 hari, dengan sampel dievaluasi
untuk agregasi pada hari 0, 1, 2, 5, 7, 9, dan 13.

Analisis statistik. Signifikansi statistik dievaluasi dengan analisis varians satu arah (ANOVA) dengan beberapa
perbandingan untuk data parametrik kuantitatif. Kuantifikasi area di bawah kurva digunakan untuk evaluasi pola
pertumbuhan. Nilai P 0,05 dianggap signifikan. Semua pengujian dilakukan di GraphPad Prism 6 (GraphPad Software,
USA). Semua percobaan kuantitatif dilakukan dengan setidaknya rangkap tiga biologis. Pengobatan antibiotik
dievaluasi menggunakan tiga ulangan teknis untuk setiap sampel biologis.

BAHAN TAMBAHAN
Materi tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan di https://doi.org/10.1128/AEM
.02264-17.

FILE TAMBAHAN 1, file PDF, 0,7 MB.

UCAPAN TERIMA KASIH

Pekerjaan ini didanai oleh Program Ilmu Perbatasan Manusia (hibah RGY0081/201 kepada
TB), Yayasan Lundbeck (TB), Dewan Penelitian Independen Denmark (hibah DFF-1323-00177
kepada TT-N.). National Institutes of Health (hibah R01GM116547-01A1 kepada MW), dan
Cystic Fibrosis Foundation (hibah WHITEL16G0 kepada MW).
Kami menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

REFERENSI
1. Koch R. 1881. Metode untuk mempelajari organisme patogen. Sarung tangan
Kantor Kesehatan Kekaisaran 1:1–48.
2. Jeanson S, Floury J, Gagnaire V, Lortal S, Thierry A. 2015. Koloni bakteri dalam
media padat dan makanan: ulasan tentang pertumbuhan dan interaksinya dengan
lingkungan mikro. Mikrobiol Depan 6:1284. https://doi .org/10.3389/
fmicb.2015.01284.
3. Austin B. 2017. Nilai Kultur untuk Mikrobiologi Modern. Antonie Van Leeuwenhoek
110:1247–1256. https://doi.org/10.1007/s10482-017 -0840-8.
4. Chick H. 1905. Keterbatasan biologis dari metode kultur murni. Phytol baru 4:120
–124. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.1905.tb05889.x.
5. Houpikian P, Raoult D. 2002. Teknik tradisional dan molekuler untuk studi penyakit
bakteri yang muncul: perspektif satu laboratorium.
Emerg Infect Dis 8:122-131. https://doi.org/10.3201/eid0802.0110141.
6. Madigan MT, Martinko JM. 2006. Brock biologi mikroorganisme, 11th
ed. Pearson Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ.
7. Willey JM, Sherwood L, Woolverton CJ. 2013. Mikrobiologi Prescott,
edisi ke-9 McGraw-Hill Science Engineering, New York, NY.
8. Tille P. 2015. Mikrobiologi diagnostik Bailey & Scott, edisi ke-13. mosby
Ilmu Kesehatan Elsevier, St. Louis, MO.
9. Holborow EJ. 1965. Prinsip dan bakteriologi Topley & Wilson
kekebalan, edisi ke-5. Imunologi 8:529.
10. Sherman JM, Albus WR. 1924. Fungsi lag dalam kultur bakteri. J Bakteriol 9:303–
305.
11. Chesney AM. 1916. Periode laten dalam pertumbuhan bakteri. J Exp Med 24:387–
418. https://doi.org/10.1084/jem.24.4.387.
12. Müller M. 1895. Tentang pengaruh suhu demam terhadap laju pertumbuhan dan
virulensi basil tifus. Penyakit Menular Z Hyg 20:245-280.
13. Wittmann HG. 1982. Struktur dan evolusi ribosom. Proc R Soc
Lond B Biol Sci 216:117–135. https://doi.org/10.1098/rspb.1982.0065.
14. Kjeldgaard NO, Maaloe O, Schaechter M. 1958. Transisi antara keadaan fisiologis
yang berbeda selama pertumbuhan seimbang Salmonella typhi murium. Mikrobiol
Gen J 19:607–616. https://doi.org/10.1099/00221287-19 -3-607.
15. Sutherland JP, Bayliss AJ, Braxton DS. 1995. Pemodelan prediktif pertumbuhan
Escherichia coli O157:H7: pengaruh suhu, pH dan natrium klorida. Mikrobiol
Pangan Int J 25:29 – 49. https://doi.org/10.1016/ 0168-1605(94)00082-H.
16. Gibson AM, Bratchell N, Roberts TA. 1987. Pengaruh natrium klorida dan suhu
pada laju dan tingkat pertumbuhan Clostridium botulinum tipe A dalam bubur babi
yang dipasteurisasi. J Appl Bacteriol 62:479 – 490. https://doi.org/10.1111/
j.1365-2672.1987.tb02680.x.
17. Fujikawa H, Kai A, Morozumi S. 2003. Model logistik baru untuk bakteri

Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17 aem.asm.org 13

Machine Translated by Google
Kragh dkk.
pertumbuhan Shokuhin Eiseigaku Zasshi 44: 155–160. Https://doi.org/10.3358/
shokueishi.44.155 .
18. Steinhaus EA, Birkeland JM. 1939. Studi tentang kehidupan dan kematian
bakteri. I. Fase penuaan dalam budaya penuaan dan kemungkinan mekanisme
yang terlibat. J Bakteriol 38:249 –261.
19. Schleheck D, Barraud N, Klebensberger J, Webb JS, McDougald D, Rice SA,
Kjelleberg S. 2009. Pseudomonas aeruginosa PAO1 lebih disukai tumbuh
sebagai agregat dalam kultur batch cair dan menyebar saat kelaparan. PLoS
One 4:e5513. https://doi.org/10.1371/journal.pone .0005513.
20. Starkey M, Hickman JH, Ma L, Zhang N, De Long S, Hinz A, Palacios S, Manoil
C, Kirisits MJ, Starner TD, Wozniak DJ, Harwood CS, Parsek MR.
2009. Varian koloni kecil Pseudomonas aeruginosa rugose memiliki adaptasi
yang mungkin mendorong kegigihan di paru-paru cystic fibrosis. J Bakteriol
191:3492–3503. https://doi.org/10.1128/JB.00119-09.
21. Wagner M, Loy A, Nogueira R, Purkhold U, Lee N, Daims H. 2002.
Komposisi dan fungsi komunitas mikroba pada instalasi pengolahan air limbah.
Antonie Van Leeuwenhoek 81:665– 680. https://doi.org/10 .1023/
A:1020586312170.
22. Alldredge AL, Cole JJ, Caron DA. 1986. Produksi bakteri heterotrofik yang
menghuni agregat organik makroskopik (salju laut) dari permukaan air. Limnol
Oceanogr 31:68 –78. https://doi.org/10.4319/lo .1986.31.1.0068.
23. Bjarnsholt T, Alhede M, Alhede M, Eickhardt-Srensen SR, Moser C, Kühl M,
Jensen P, Høiby N. 2013. Biofilm in vivo. Tren Mikrobiol 21: 466 - 474. https://
doi.org/10.1016/j.tim.2013.06.002.
24. Kragh KN, Alhede M, Jensen PØ, Moser C, Scheike T, Jacobsen CS, Seier
Poulsen S, Eickhardt-Sørensen SR, Trøstrup H, Christoffersen L, Hougen HP,
Rickelt LF, Kühl M, Høiby N, Bjarnholt T. 2014. Leukosit polimorfonuklear
membatasi pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa di paru-paru pasien cystic
fibrosis. Infect Imun 82: 4477– 4486. https://doi.org/ 10.1128 / IAI.01969-14.
25. Alhede M, Kragh KN, Qvortrup K, Allesen-Holm M, van Gennip M, Christensen
LD, Jensen PØ, Nielsen AK, Parsek M, Wozniak D, Molin S, Tolker-Nielsen T,
Høiby N, Givskov M, Bjarnsholt T, Hoiby N, Givskov M, Bjarnsholt T. 2011.
Fenotipe agregat Pseudomonas aerrugi nosa yang tidak melekat menyerupai
biofilm yang menempel di permukaan. PLoS One 6: e27943. https://doi.org/
10.1371/journal.pone.0027943.
26. Folsom JP, Richards L, Pitts B, Roe F, Ehrlich GD, Parker A, Mazurie A, Stewart
PS. 2010. Fisiologi Pseudomonas aeruginosa dalam biofilm seperti yang
diungkapkan oleh analisis transkriptom. Mikrobiol BMC 10:294. https://doi.org/
10.1186/1471-2180-10-294 .
27. Stewart PS, Franklin MJ. 2008. Heterogenitas fisiologis dalam biofilm.
Nat Rev Microbiol 6:199 –210. https://doi.org/10.1038/nrmicro1838.
28. Bjarnsholt T, Jensen PØ, Burmølle M, Hentzer M, Haagensen JAJ, Hougen HP,
Calum H, Madsen KG, Moser C, Molin S, Høiby N, Givskov M. 2005.
Toleransi Pseudomonas aeruginosa terhadap tobramycin, hidrogen peroksida
dan leukosit polimorfonuklear bergantung pada quorum-sensing. Mikrobiologi
151:373–383. https://doi.org/10.1099/mic.0.27463-0.
29. Hoiby N, Bjarnsholt T, Moser C, Bassi GL, Coenye T, Donelli G, Hall Stoodley
L, Hola V, Imbert C, Kirketerp-Moller K, Lebeaux D, Oliver A, Ullmann AJ,
Williams C. 2015. ESCMID pedoman untuk diagnosis dan pengobatan infeksi
biofilm 2014. Clin Microbiol Infect 21 (Suppl 1): S1–S25. https://doi.org/10.1016/
j.cmi.2014.10.024.
30. Borlee BR, Goldman AD, Murakami K, Samudrala R, Wozniak DJ, Parsek MR.
2010. Pseudomonas aeruginosa menggunakan ad hesin cyclic-di-GMP-
regulated untuk memperkuat matriks ekstraseluler biofilm. Mikrobiol Mol 75:
827– 842. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2009.06991.x.
31. Friedman L, Kolter R. 2004. Gen yang terlibat dalam pembentukan matriks
dalam biofilm Pseudomonas aeruginosa PA14. Mikrobiol Mol 51:675– 690.
https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2003.03877.x.
32. Costerton JW. 1999. Biofilm bakteri: penyebab umum infeksi persisten. Sains
284:1318 –1322. https://doi.org/10.1126/science.284 .5418.1318.
33. Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, Ladd TI, Nikel JC, Dasgupta M, Marrie
TJ. 1987. Biofilm bakteri di alam dan penyakit. Annu Rev Microbiol 41:435–464.
https://doi.org/10.1146/annurev.mi.41.100187.002251.
34. Donlan RM, Costerton JW. 2002. Biofilm: mekanisme kelangsungan hidup
mikroorganisme yang relevan secara klinis. Clin Microbiol Wahyu 15:167–193.
https://doi.org/10.1128/CMR.15.2.167-193.2002 .
35. Tuomanen E, Durack DT, Tomasz A. 1986. Toleransi antibiotik antara isolat
klinis bakteri. Agen Antimikroba Kemoterapi 30:521–527. https://doi.org/10.1128/
AAC.30.4.521.
Maret 2018 Volume 84 Edisi 5 e02264-17
Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan
36. Billings N, Ramirez Millan M, Caldara M, Rusconi R, Tarasova Y, Stocker R,
Ribbeck K. 2013. Komponen matriks ekstraseluler Psl memberikan pertahanan
antibiotik kerja cepat dalam biofilm Pseudomonas aeruginosa. PLoS Pathog
9:e1003526. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003526.
37. Goltermann L, Tolker-Nielsen T. 2017. Pentingnya matriks naik exopolysaccha
dalam toleransi antimikroba Pseudomonas aeruginosa ag gregates. Agen
Antimikroba Chemother 61:e02696-16. https://doi.org/ 10.1128/AAC.02696-16.
38. Kundukad B, Seviour T, Liang Y, Beras SA, Kjelleberg S, Doyle PS. 2016.
Sifat mekanik lapisan biofilm superfisial menentukan arsitektur biofilm. Materi
Lunak 12:5718 –5726. https://doi.org/10 .1039/C6SM00687F.
39. Wang S, Liu X, Liu H, Zhang L, Guo Y, Yu S, Wozniak DJ, Ma LZ. 2015. Interaksi
eksopolisakarida Psl-eDNA memungkinkan pembentukan kerangka biofilm
pada Pseudomonas aeruginosa. Mikrobiol Lingkungan Rep 7:330 –340. https://
doi.org/10.1111/1758-2229.12252.
40. Cooley BJ, Thatcher TW, Hashmi SM, L'her G, Le HH, Hurwitz DA, Provenzano
D, Touhami A, Gordon VD. 2013. Pel polysac charide ekstraseluler membuat
perlekatan P. aeruginosa ke permukaan simetris dan jarak pendek. Materi
Lunak 9:3871–3876. https://doi.org/10.1039/ c3sm27638d.
41. Jennings LK, Storek KM, Ledvina HE, Coulon C, Marmont LS, Sadovskaya I,
Secor PR, Tseng BS, Scian M, Filloux A, Wozniak DJ, Howell PL, Parsek MR.
2015. Pel adalah eksopolisakarida kationik yang mengikat DNA ekstraseluler
dalam matriks biofilm Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA
112:11353-11358. https://doi.org/10.1073/pnas.1503058112.
42. Barnhart MM, Chapman MR. 2006. Biogenesis dan Fungsi Curli. Annu Rev
Microbiol 60:131–147. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.60.080805 .142106.
43. Kikuchi T, Mizunoe Y, Takade A, Naito S, Yoshida S. 2005. Serat Curli diperlukan
untuk pengembangan arsitektur biofilm di Escherichia coli K-12 dan
meningkatkan kepatuhan bakteri pada sel uroepitel manusia. Mikrobiol Imun
nol 49:875–884. https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.2005.tb03678.x.
44. Boles BR, Horswill AR. 2008. penyebaran biofilm Staphylococcus aureus yang
dimediasi agr. PLoS Pathog 4:e1000052. https://doi.org/10.1371/journal.ppat
.1000052.
45. Haaber J, Cohn MT, Frees D, Andersen TJ, Ingmer H. 2012. Agregat planktonik
Staphylococcus aureus melindungi terhadap antibiotik umum. PLoS One
7:e41075. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041075.
46.Irie Y, Starkey M, Edwards AN, Wozniak DJ, Romeo T, Parsek MR. 2010.
Pseudomonas aeruginosa biofilm matriks polisakarida Psl diatur secara
transkripsi oleh RpoS dan pasca-transkripsi oleh RsmA. Mol Mi crobiol 78:158
-172.
47. Ma L, Jackson KD, Landry RM, Parsek MR, Wozniak DJ. 2006. Analisis varian
psl bersyarat Pseudomonas aeruginosa mengungkapkan peran polisakarida
psl dalam adhesi dan mempertahankan struktur biofilm pasca perlekatan. J
Bakteriol 188:8213– 8221. https://doi.org/10.1128/ JB.01202-06.
48. Rybtke MT, Borlee BR, Murakami K, Irie Y, Hentzer M, Nielsen TE, Givskov M,
Parsek MR, Tolker-Nielsen T. 2012. Reporter berbasis fluoresensi untuk
mengukur tingkat di-GMP siklik di Pseudomonas aeruginosa. Mikrobiol
Lingkungan Aplikasi 78:5060 –5069. https://doi.org/10.1128/AEM.00414-12.
49. Malone CL, Boles BR, Lauderdale KJ, Thoendel M, Kavanaugh JS, Horswill AR.
2009. Wartawan fluoresen untuk Staphylococcus aureus. J Metode Mikrobiol
77:251–260. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2009.02.011.
50. Hutchison JB, Rodesney CA, Kaushik KS, Le HH, Hurwitz DA, Irie Y, Gordon
VD. 2014. Kontrol sel tunggal struktur spasial awal dalam pengembangan
biofilm menggunakan laser trapping. Langmuir 30:4522– 4530. https://doi .org/
10.1021/la500128y.
51. Whiteley M, Brown E, Mclean RJC. 1997. Alat chemostat murah untuk studi
biofilm mikroba. J Metode Mikrobiol 30:125-132. https://doi.org/10.1016/
S0167-7012(97)00054-7.
52. Clark DJ, Maaløe O. 1967. Replikasi DNA dan siklus pembelahan pada
Escherichia coli. J Mol Biol 23:99 -112. https://doi.org/10.1016/S0022
-2836(67)80070-6.
53. Holloway BW. 1995. Rekombinasi genetik pada Pseudomonas aeruginosa.
Mikrobiol Gen J 13:572–581. https://doi.org/10.1099/00221287-13-3-572.
54. Kirisits MJ, Prost L, Starkey M, Parsek MR. 2005. Karakterisasi varian morfologi
koloni yang diisolasi dari biofilm Pseudomonas aeruginosa. Mikrobiol Lingkungan
Aplikasi 23:4809 – 4821. https://doi.org/10.1128/ AEM.71.8.4809-4821.200.
55. Tatum EL, Lederberg J. 1947. Rekombinasi gen dalam bakteri
Escherichia coli. J Bakteri 53:673– 684.
aem.asm.org 14