Real Time PCR

Definisi : adalah metode amplifikasi dan kuantifikasi asam nukleat dimana hasil PCR dapat
ditentukan, secara real-time atau langsung, dan tidak membutuhkan manipulasi pasca PCR seperti
elektroforesis maupun densitometri.

Prinsip kerja : didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul yang
meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi
produk PCR pada tiap siklus amplifikasi.

Komponen : DNA cetakan (Template DNA), Primers, Nucleotides/ Nukleotida (dNTPs), DNA
polimerase, PCR buffer dan konsentrasi Mg2+, PCR Thermal Cycler (Mesin PCR),

reverse transcriptase PCR

definisi : merupakan metode yang digunakan untuk mengamplifikasi cDNA dari mRNA atau
Bisa juga langsung dari mikroorganisme yang memiliki materi genetik RNA (seperti virus
(polio,campak, rubella, influenza dll)

Prinsip kerja : mengkonversi mRNA ke bentuk rantai tunggal untuk cetakan cDNA. Primer
Oligodeoksinukleotida di hibridisasikan sehingga cDNA dapat teramplifikasi. Teknik RT-PCR
memerlukan enzim transrriptase balik (reverse transcriptase). Enzim transkriptase balik
adalah enzim DNA polimerase yang menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk
mensintesis molekul DNA (cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA tersebut.

Komponen :

Nested PCR

Definisi : suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan bantuan enzim
DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer PCR untuk mengamplifikasi
fragmen.

Prinsip kerja : menggunakan 2 pasang primer . Fase denaturasi, DNA mengalami denaturasi lalu
memasuki fase penempelan. Fase penempelan, sepasang primer pertama melekat di kedua
utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan
terbentuklah produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut
dijalankan pada proses PCR kedua sehingga pasangan primer kedua (Nested primer) akan
mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan
memulai amplifikasi di antara kedua bagian primer tersebut.

Komponen :

Metoda RAPD

Definisi : merupakan metoda baru untuk mengidentifikasi sejumlah besar polimorfisme DNA
pada genom dengan cepat dan efisien.

Prinsip kerja : mengaplikasikan PCR dengan cara mengamplifikasi urutan nukleotida dengan
menggunakan primer acak. Primer yang digunakan adalah oligonukleotida yang terdiri dari
5–10 nukleotida. Keunggulan dari teknik PCR RAPD adalah hanya dibutuhkan kuantitas
sampel DNA yang sedikit, hemat biaya, mudah dipelajari, dan primer yang mudah
didapatkan. Sedangkan kelemahannya adalah tingkat reproduksibilitasnya rendah, sensitif
terhadap variasi konsentrasi DNA, dan memerlukan optimasi suhu dan primer pada saat
pengujian

Komponen :

Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)

Definisi : teknik dalam biologi molekuler yang digunakan untuk penandaan genetik berbasis hasil

amplifikasi (perbanyakan) PCR terhadap potongan-potongan (fragmen) DNA yang terbentuk
akibat aktivitas enzim restriksi tertentu

Prinsip kerja :

1. Pemotongan (digesti) oleh enzim restriksi dan penempelan (ligasi) adapter

2. Perbanyakan (amplifikasi) selektif atas potongan-potongan DNA
3. Analisis hasil amplifikasi lewat elektroforesis gel

Komponen :

RFLP PCR,

Definisi : metode yg digunakan jika ada area pemotongan enzim restriksi. Pada alel
homozigot/mutan yang memiliki situs pemotongan, maka produk PCR akan dapat dipotong oleh
enzim restriksi tertentu (atau sebaliknya). Untuk alel hetero, maka produk PCR yang diamati adalah
kombinasi antara pita yang terpotong dan yang tidak terpotong

Prinsip kerja : menganalisis kesamaan atau perbedaan DNA dengan menggunakan enzim restriksi
yang memiliki sifat pengenalan spesifik terhadap DNA.

Komponen :

PCR-SSCP

Definisi : metode elektroforesis gel yang dapat mendeteksi mutasi dan polimorfisme tetapi tidak
dapat mengkarakterisasinya.

Prinsip kerja : berdasarkan pada mobilitas elektroforetik molekul dalam matriks gel. PCR-SSCP
sensitif terhadap ukuran, muatan, dan bentuk molekul. Pada kondisi nondenaturasi atau kondisi
natif, struktur lipatan akan muncul dari interaksi intramolekular yang berdasarkan pada deret
nukleotidan DNA untai tunggal. Dalam metode SSCP, target yang diamplifikasi dengan reaksi
berantai polimerase berupa deret DNA.

Komponen :
 Multipleks PCR

Definisi : merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan
amplikon (hasil amplifikasi PCR) dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda.

Prinsip kerja :  mengamplifikasi banyak target fragmen DNA dalam satu kali reaksi PCR.
Kuncinya adalah penggunaan primer dalam jumlah banyak yang telah dioptimasi
berdasarkan suhu terbaik dari masing-masing primer. Metode ini biasanya diaplikasikan
dalam banyak studi genotiping, mutasi, dan analisis polimorfisme, analisis STR (Short
Tandem Repeat) mikrosatelit, deteksi patogen dan GMO.

Komponen :

PCR-ELISA

Definisi : merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang
meniru prinsip dari Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) yang terkait

Prinsip kerja : membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan
dari seperangkat primer yang mengandung variasi sekuen, yaitu sekuen yang bervariasi
antar primer. ELISA PCR ini juga berguna untuk skrining beberapa sampel, terutama
bila jumlah sampel tidak menjamin.

Komponen :

touchdown PCR

definidi : merupakan Sebuah  modifikasi yang  mencegah  amplifikasi  sekuens 

nonspesifik dengan mempermainkan suhu annealing.

Prinsip kerja : mengurangi  latar  belakang  spesifik  secara  bertahap  menurunkan 

suhu  annnealing selama proses berlangsung. Suhu anil pada awal siklus biasanya
beberapa derajat (3-5 ° C)  di  atas Tm  primer  yang  digunakan,  sedangkan  pada 
siklus  kemudian dilanjutkan dengan beberapa derajat (3-5°C) di bawah Tm primer.
Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu
yang lebih rendah memungkinkan amplifikasi lebih efisien dari produk tertentu yang
terbentuk selama siklus awal.

Komponen :

Allele-specific PCR
Definisi : merupakan suatu metode pengembangan reaksi berantai polimerase dengan sifat
yang cepat dalam analisis mutasi DNA genomik yang telah diketahui

Prinsip kerja : mendeteksi suatu salinan tunggal dari alel mutan dalam 40 salinan normalnya.
Teknik ini hanya membutuhkan alel dengan ujung nukleotida 3’ dari primer PCR spesifik . Allele-
specific PCR melakukan sintesi dalam dua bentuk primer. Bentuk pertama berupa refraktori
terhadap PCR dari cetakan DNA mutan. Bentuk ini dianggap sebagai bentuk normal. Kedua,
bentuk mutan refraktori terhadap PCR DNA normal. Allele-specific PCR secara umum digunakan
pada penyakit turunan apa saja, karena memiliki kemampuan analisis secara langsung
dari lokus mana saja yang diinginkan. 

Komponen :

Assembly PCR

Definisi : sintesis buatan dari sekuens DNA panjang dengan melakukan PCR pada kumpulan
oligonukleotida panjang dengan segmen tumpang tindih pendek.

Prinsip kerja : Oligonukleotida bergantian antara arah indera dan antisense, dan segmen yang
tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR, sehingga secara selektif menghasilkan produk
DNA panjang akhir.

Komponen :

Asymmetric PCR

Definisi : merupakan suatu metode untuk mengamplifikasi satu untai DNA dalam templat DNA
untai ganda

Prinsip kerja : sequencing dan hibridisasi probing amplifikasi hanya satu dari dua untai
komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti biasa, tetapi dengan kelebihan besar
primer untuk untai yang ditargetkan untuk amplifikasi. Karena (lambat aritmatika
amplifikasi) kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah digunakan siklus
PCR tambahan yang diperlukan.

Komponen :

Dial-out PCR

Definisi : metode yang sangat paralel untuk mengambil molekul DNA yang akurat untuk
sintesis gen.

Prinsip kerja ; Pustaka molekul DNA yang kompleks dimodifikasi dengan tag pengapit
unik sebelum pengurutan paralel secara besar-besaran. Primer yang diarahkan pada
tag kemudian memungkinkan pengambilan molekul dengan urutan yang diinginkan oleh
PCR.
Komponen :

Hot-start PCR

Definisi ; teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama proses set up awal
tahapan PCR.

Prinsip kerja ; dilakukan secara manual dengan memanaskan komponen reaksi terhadap
temperatur leleh (misalnya, 95°C) sebelum menambahkan polimerase. Khusus sistem
enzim telah dikembangkan yang menghambat polimerase, aktivitas pada suhu sekitar, baik
oleh mengikat dari antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang
terdisosiasi hanya setelah suhu aktivasi langkah-tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai
dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu kamar dan akan segera
diaktifkan pada suhu perpanjangan.

Komponen :