Sistem imun adaptif mikroba CRISPR memediasi pertahanan melawan elemen genetik asing melalui

dua kelas efektor nuklease yang dipandu RNA. Kami menunjukkan bahwa Cpf1 memediasi
interferensi DNA yang kuat dengan fitur yang berbeda dari Cas9. Dari 16 protein keluarga Cpf1, kami
mengidentifikasi dua kandidat enzim dari Acidaminococcus dan Lachnospiraceae, dengan aktivitas
pengeditan genom yang efisien dalam sel manusia. Mengidentifikasi mekanisme interferensi ini
memperluas pemahaman kita tentang sistem CRISPR-Cas dan memajukan aplikasi pengeditan
genomnya.

PENGANTAR

Tahap adaptasi dimediasi oleh kompleks protein Cas1 dan Cas2, yang dimiliki bersama oleh semua
sistem CRISPR-Cas yang dikenal, dan terkadang melibatkan protein Cas tambahan. Keragaman
diamati pada tingkat pemrosesan pra-crRNA menjadi panduan crRNA matang, dilanjutkan melalui
ribonuklease terkait Cas6 atau RNaseIII rumah tangga yang secara khusus memotong hibrid RNA
untai ganda dari precrRNA dan tracrRNA. Selain itu, modul efektor berbeda secara substansial di
antara sistem CRISPR-Cas . Beberapa sistem CRISPR-Cas kelas 1, yang mencakup sistem tipe I dan
tipe III, telah diidentifikasi dan dicirikan secara fungsional secara rinci, mengungkapkan arsitektur
kompleks dan dinamika kompleks efektor .

Beberapa sistem CRISPR-Cas kelas 2 juga telah diidentifikasi dan dikarakterisasi secara
eksperimental, tetapi semuanya adalah tipe II dan menggunakan endonuklease yang dipandu RNA
homolog dari keluarga Cas9 sebagai efektor .

Di sini, kami menunjukkan bahwa lokus CRISPR-Cas

Francisella novicida U112 yang mengandung Cpf1 mengkodekan sistem pertahanan fungsional yang
mampu memediasi interferensi plasmid dalam sel bakteri yang dipandu oleh spacer CRISPR. Tidak
seperti sistem Cas9, sistem CRISPR yang mengandung Cpf1 memiliki tiga fitur. Pertama, array
CRISPR terkait Cpf1 diproses menjadi crRNA matang tanpa persyaratan crRNA trans-aktivasi
tambahan. Kedua, kompleks Cpf1-crRNA secara efisien membelah DNA target yang dilanjutkan
dengan motif pendek yang berdekatan dengan protospacer kaya-T , berbeda dengan PAM kaya-G
yang mengikuti DNA target untuk sistem Cas9.

Ketiga, Cpf1 memperkenalkan pemutusan untai ganda DNA terhuyung-huyung dengan overhang 4
atau 5-nt 50. Organisasi dua lokus CRISPR ditemukan di Francisella novicida U112 . Arsitektur
domain FnCas9 dan FnCpf1 dibandingkan. Skema yang menggambarkan uji penipisan plasmid untuk
menemukan posisi dan identitas PAM.

Bakteri Lachnospiraceae ND2006 yang mampu memediasi pengeditan genom yang kuat dalam sel
manusia. Secara kolektif, hasil ini menetapkan Cpf1 sebagai sistem CRISPR-Cas kelas 2 yang
mencakup endonuklease dipandu RNA tunggal yang efektif dengan sifat berbeda yang memiliki
potensi untuk secara substansial memajukan kemampuan kita untuk memanipulasi genom eukariotik.

Mengingat fungsionalitas yang sama sekali tidak dicirikan dari lokus CRISPR FnCpf1, kami
mengadaptasi uji penipisan plasmid yang dijelaskan sebelumnya untuk memastikan aktivitas Cpf1 dan
mengidentifikasi persyaratan untuk urutan PAM dan lokasi masing-masing relatif terhadap
protospacer. Kami membangun dua perpustakaan plasmid yang membawa protospacer yang cocok
dengan spacer pertama dalam array FnCpf1 CRISPR dengan urutan 50 atau 30 7 bp yang
diacak. Lokasi 50 PAM juga diamati pada sistem CRISPR tipe I, tetapi tidak pada sistem tipe II, di
mana Cas9 menggunakan urutan PAM yang terletak di ujung 30 protospacer . PAM, hasil uji deplesi
dengan jelas menunjukkan bahwa lokus Cpf1 yang diekspresikan secara heterolog mampu melakukan
interferensi yang efisien dengan DNA plasmid.