Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

www.nature.com/scientificreports

MEMBUKA
Pengeditan genom efisien yang
dimediasi CRISPR/Cas9 melalui
transformasi berbasis blastospora di
jamur entomopatogen
rditerima: 25 Oktober 2016

SEBUAHditerima: 02 Maret 2017

Beauveria bassiana
Pditerbitkan: 03 April 2017

Jingjing Chen1,2,Yiling Lai1, Lilik Wang1,2, SuzhenZhai1, Jenderal Zou3, Zhihua Zhou3, Chunlai Cui1,2
& SibaoWang1

Beauveria bassianaadalah alternatif ramah lingkungan untuk insektisida kimia terhadap berbagai hama serangga
pertanian dan vektor penyakit manusia. Namun, penerapannya terbatas karena lambat membunuh dan kepekaan
terhadap cekaman abiotik. Pemahaman tentang patogenesis molekuler dan karakteristik fisiologis akan memfasilitasi
peningkatan kinerja jamur. Mutagenesis hilangnya fungsi adalah alat yang paling ampuh untuk mengkarakterisasi fungsi
gen, tetapi terhambat oleh rendahnya tingkat rekombinasi homolog dan terbatasnya ketersediaan penanda yang dapat
dipilih. Di sini, dengan menggabungkan penggunaan auksotrofi uridin sebagai DNA penerima dan donor yang menyimpan
gen pelengkap auksotrofikura5sebagai penanda yang dapat dipilih dengan sistem transformasi berbasis blastospora,
kami membangun latar belakang positif palsu yang sangat efisien, rendah, dan sistem pengeditan gen yang dimediasi
CRISPR / Cas9 yang hemat biaya diB. bassiana. Sistem ini telah didemonstrasikan sebagai alat yang sederhana dan kuat
untuk knock-out dan/atau knock-in gen yang ditargetkanB. bassianadalam gangguan gen tunggal. Kami selanjutnya
menunjukkan bahwa sistem kami memungkinkan gangguan simultan dari banyak gen melalui perbaikan yang diarahkan
oleh homologi dalam satu transformasi. Teknologi ini akan memungkinkan kita untuk mempelajari gen yang redundan
secara fungsional dan memiliki potensi signifikan untuk mempercepat studi genomik fungsionalB. bassiana.

Jamur patogen serangga adalah pengatur alami yang penting dari populasi serangga hama. Khususnya, yang termasuk dalam
genusBeauveriadanMetarhiziumtelah menunjukkan harapan besar sebagai agen kontrol biologis hama serangga1–3.
B. bassianatelah diproduksi secara massal secara komersial dan memberikan banyak keuntungan sebagai alternatif ramah
lingkungan dari insektisida kimia. Jamur ini juga merupakan saprofit fakultatif dan dapat tumbuh sebagai endofit tanaman yang
memberikan perlindungan terhadap serangga dan penyakit perampok.4. Ini telah banyak digunakan untuk mengendalikan
berbagai hama serangga pertanian dan vektor penyakit manusia, termasuk nyamuk, lalat, dan kutu5–7. Lebih-lebih lagi,B. bassiana
telah digunakan sebagai sistem model untuk mempelajari perkembangan jamur dan interaksi inang-patogen8. Namun, aplikasi
lapangannya terbatas karena lambat membunuh dan kepekaan terhadap cekaman abiotik seperti radiasi UV, suhu tinggi,
kekeringan, yang menyebabkan hasil aplikasi lapangan tidak konsisten.9. Tetapi rekayasa genetika telah terbukti menjadi strategi
yang menjanjikan untuk meningkatkan virulensi jamur secara signifikan, meningkatkan toleransi stres, dan mengurangi penularan
penyakit yang ditularkan oleh nyamuk.10–12. Ini menyoroti kebutuhan untuk pemahaman yang lebih baik tentang penentu virulensi
dan karakteristik fisiologis diB. bassiana. Dalam hal ini, genetika terbalik, yang melibatkan penghancuran gen kandidat yang
ditargetkan, tetap menjadi alat paling ampuh untuk mempelajari fungsi gen dan dasar molekuler patogenesis jamur.

Keterbatasan utama gangguan gen padaB. bassiana, dan memang sebagian besar jamur berfilamen, memiliki tingkat
rekombinasi homolog yang relatif rendah (lebih rendah dari 5%), terutama karena adanya ujung nonhomolog.

1Laboratorium Kunci CAS Biologi Perkembangan dan Evolusi Serangga, Institut Fisiologi dan Ekologi Tumbuhan, Institut

Ilmu Biologi Shanghai, Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok, Shanghai 200032, Tiongkok.2Universitas Akademi Ilmu
Pengetahuan Tiongkok, Beijing 100049, Tiongkok.3Laboratorium Kunci CAS untuk Biologi Sintetik, Institut Fisiologi dan
Ekologi Tumbuhan, Institut Ilmu Biologi Shanghai, Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok, Shanghai 200032, Cina.
Korespondensi dan permintaan materi harus ditujukan ke SW (email: sbwang@sibs.ac.cn )

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 1

www.nature.com/scientificreports/

bergabung (NHEJ) jalur perbaikan DNA yang sering menghasilkan penyisipan ektopik dari DNA penargetan13. Saat ini,
metode yang paling luas untuk menghasilkan mutan diB. bassianaberdasarkan padaAgrobacterium-transformasi yang
dimediasi14–17. Namun,Agrobacterium-metode penargetan gen yang dimediasi secara teknis rumit, melelahkan, bersama
dengan tingkat rekombinasi homolog yang rendah dan kami biasanya perlu menyaring ratusan hingga ribuan
transforman di berbagai upaya transformasi untuk mendapatkan mutan yang diinginkan18.
Keterbatasan lain untuk mutagenesis diB. bassianaadalah kurangnya penanda yang dapat dipilih dominan yang memadai. Paling
B. bassianastrain tampaknya menunjukkan resistensi intrinsik terhadap penanda selektif antibiotik yang paling umum
digunakan. Saat ini, hanya dua penanda resistensi obat yang dominan, gen fosfinotrisin asetil transferase (batang) untuk
resistensi herbisida phosphinothricin (bialaphos), dan gen acetolactate synthase (sur) dariMagnaporthe oryzaeuntuk
seleksi sulfonylurea (chorimuron ethyl), dapat digunakan untuk gangguan gen dan komplemen genetik diB. bassiana19–21
. Oleh karena itu, hanya dua gen yang dapat terganggu secara bersamaan pada tipe liar
B. bassiana, yang dilakukan dalam transformasi berturut-turut. Auksotrof yang membutuhkan uridin yang kekurangan
orotidin-5′-monofosfat pirofosforilase (OMPase) (URA5) atau orotidin-5′-monophosphate decarboxylase (URA3) telah
banyak digunakan untuk berbagai penyaringan genetik dan sistem transformasi diSaccharomyces cerevisiaedan banyak
jamur berserabut, termasukAspergillusspp.,Trichodermaspp. danCryptococcus neoformans22–24. Baru-baru ini, auksotrof
uridin dihasilkan dari gangguanura3gen diperoleh diB. bassiana. Mutan membutuhkan uridin eksogen untuk
pertumbuhan dan dipilih secara positif dalam media yang mengandung asam 5-fluoroorotik (5-FOA)25, menunjukkan
bahwa auksotrofi uridin dapat digunakan sebagai penanda yang dapat dipilih untuk transformasiB. bassiana.

Baru-baru ini, sistem CRISPR (pengulangan palindromik pendek yang diselingi secara teratur) -Cas9, sebagai sistem
pertahanan adaptif bakteri dan archaeal terhadap virus dan DNA yang menyerang26, telah berhasil dikembangkan
sebagai alat pengeditan genom yang efisien baik pada prokariota maupun eukariota27–29. Sistem ini terdiri dari
endonuklease Cas9 multidomain dan chimeric singleguide RNA (sgRNA) yang berisi urutan panduan 20-nt yang cocok
dengan wilayah DNA target diikuti oleh Protospacer Adjacent Motif (PAM) pendek dan urutan perancah chimeric hilir
(perancah gRNA)30,31. SgRNA dapat merekrut Cas9 untuk membuat DNA double strand break (DSB) spesifik di wilayah
target, yang mengarah ke penghapusan, penyisipan, dan penggantian melalui NHEJ yang rawan kesalahan tanpa adanya
urutan homolog atau penggantian spesifik gen melalui perbaikan diarahkan rekombinasi homolog (HDR) dengan adanya
templat perbaikan DNA homolog (DNA donor)27,32. Sistem CRISPR/Cas9 telah disesuaikan dengan beberapa jamur, seperti
ragiSchizosaccharomyces pombe33,S.cerevisiae34, jamur ascomycete berserabutTrichoderma reesei35,Neurospora crasa36,
M. oryzae37danAspergillus fumigatus38–40. Namun, sistem CRISPR/Cas9 atau pendekatan pengeditan genom lainnya
belum dilaporkan pada jamur entomopatogen.

Sistem CRISPR/Cas9 pada jamur berfilamen terutama didasarkan pada teknik transformasi hasil rendah (misalnya,
transformasi kimia protoplas). Transformasi berbasis protoplas secara teknis rumit dan memakan waktu20,41. Selain itu,
protoplas terlalu rapuh untuk diawetkan untuk penggunaan selanjutnya. Banyak jamur berserabut sepertiB. bassiana42,43,
M. anisopliae44,Paecilomyces farinosus45,P. fiimosoroseus46,Hirsutella thompsonii47danVerticillium lecanii48dapat
menghasilkan blastospora melalui tunas seperti ragi dalam kultur cair tertentu. Sistem transformasi berbasis blastospora
yang efisien telah dikembangkan untuk pengenalan gen asing ke dalam blastospora yang kompeten43. Yang penting,
blastospora mudah diproduksi dan dapat disimpan dalam jangka panjang pada suhu -80 °C dalam keadaan siap pakai.

Dalam penelitian ini, gen kecilura5(699 bp ORF) dikembangkan sebagai penanda auxotrophic uridin untukB. bassiana.
Menggabungkan penggunaan transformasi yang dimediasi blastospora dan auksotrofi uridin/ura5pelengkap, kami telah
membangun sistem pengeditan gen yang dimediasi CRISPR / Cas9 yang sangat efisien diB. bassiana. Penggunaan transformasi
berbasis blastospora menghindari persiapan protoplas yang melelahkan untuk setiap transformasi, dan komplemen auksotrofi
uridin menghilangkan kebutuhan untuk menggunakan antibiotik/herbisida. Melalui sistem ini, kami telah secara efisien mencapai
mutasi spesifik lokasi atau memperkenalkan DNA eksogen ke situs target melalui rekombinasi homolog. Kami juga
mendemonstrasikan bahwa CRISPR/Cas9 dapat digunakan untuk gangguan simultan beberapa gen dalam satu transformasi
dengan melakukan transformasi bersama beberapa gRNA dan DNA donor yang relevan.

Hasil
Ekspresi kodon yang dioptimalkancas9diB. bassiana.Keberhasilan penerapan sistem CRISPR/Cas9
tem dalam spesies baru membutuhkan ekspresi heterologcas9gen dariStreptococcus pyogenesmenyatu dengan sinyal
lokalisasi nuklir. Pengkodean urutan DNA untukcas9gen pertama kali disintesis denganB. bassianapenggunaan kodon
yang disukai dan dikloning dalam bingkai dengan tag Myc terminal-C (EQKLISEEDL) dan sinyal lokalisasi nuklir (PKKKRKV)
(File Tambahan S1). Dioptimalkan kodoncas9gen (BBCas9) kemudian ditempatkan di bawah kendali promotor konstitutif
PgpdAdan terminator TtrpCdariAspergillus nidulans(Gambar 1A). Konstruk yang menampung PgpdA-BBCas9-TtrpCkaset,
gen resistensi phosphinothricinbatangdan kode gen penanda untuk peningkatan protein fluoresen hijau (eGFP)
diperkenalkan ke dalamB. bassianamelaluiAgrobacterium-dimediasi transformasi jamur14. Ekspresi dariBBCas9dalam
transforman pengekspresian eGFP pertama kali dikonfirmasi oleh RT-PCR semi-kuantitatif (Gbr. 1B). Ekspresi protein
Bbcas9 selanjutnya diverifikasi dengan analisis Western blot menggunakan antibodi anti-Myc. Seperti yang diharapkan,
protein Myc-fusion terdeteksi pada ukuran yang diprediksi, dengan pita spesifik sekitar 170 kDa pada transforman
daripada pada strain tipe liar (Gbr. 1C), menunjukkan bahwa Cas9 berhasil diekspresikan dalamB. bassiana.

Ekspresi nuclease Cas9 itu sendiri tanpa dampak buruk padaB. bassianapertumbuhan atau virulensi sangat penting
untuk penggunaan sistem CRISPR dalam studi patogenesis. Kami pertama kali menguji tingkat pertumbuhan dengan
melihat konidia dari transforman pengekspres Cas9 dan regangan WT ke pelat SDAY dan menginkubasinya pada suhu 25
° C. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S1A, morfologi koloni dan diameter koloni dari transforman
identik dengan kontrol tipe liar, menunjukkan bahwaB. bassianapertumbuhan tidak terpengaruh oleh ekspresi Cas9.
Jumlah konidia yang dihasilkan oleh transforman pengekspres Cas9 juga tidak dapat dibedakan dari tipe liar,

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 2

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 1. Ekspresi daricas9gen diB. bassianaregangan Bb252.(SEBUAH) Konstruksi ekspresi vektor cas9di
bawah kendali dariAspergillus nidulanspromotor konstitutif PgpdAdan terminator TtrpC. (B) Konfirmasi analisis
RT-PCRcas9ekspresi dalam transforman Bbcas9-1 dan Bbcas9-2. WT: strain tipe liar Bb252. (C) Deteksi ekspresi
cas9-Myc dalam transforman Bbcas9-1 dan Bbcas9-2 oleh western blots.

menunjukkan bahwa perkembangan aseksual juga tidak terpengaruh (Gambar Tambahan. S1B). Kami selanjutnya menguji
virulensi strain terhadap nyamuk inang. Tidak ada perbedaan signifikan dalam tingkat kelangsungan hidup serangga yang
terdeteksi antara transforman yang mengekspresikan Cas9 dan strain tipe liar (Gambar Tambahan. S1C). Singkatnya, ekspresi
konstitutif dari endonuklease Cas9 tidak mempengaruhi pertumbuhan jamur, produksi konidia, dan virulensi di bawah kondisi
yang diuji. Oleh karena itu, regangan pengekspres Cas9 dapat digunakan sebagai penerima untuk transformasi sgRNA hilir dan
berfungsi sebagai regangan universal untuk mutagenesis yang dimediasi CRISPR.

Ituura5gen sebagai penanda yang dapat dipilih diB. bassiana.Auksotrof yang membutuhkan uridin yang kurang baik
URA5 atau URA3 telah banyak digunakan untuk berbagai penyaringan genetik dan sistem transformasi pada banyak jamur.
B. bassianamemiliki satu salinan dariura5gen berdasarkan urutan genom49, dan open reading frame (ORF) dari ura5
panjangnya hanya 699 bp, lebih kecil dariura3gen (ORF, 1.089 bp), yang akan memfasilitasi konstruksi DNA donor yang
mengandung anura5kaset pelengkap. URA5 dapat mengonversi 5′-asam fluoroorotik (5-FOA) menjadi senyawa beracun
5-fluorourasil (5-FU) dalam bentuk asam 5-fluorouridilat (5-FUMP). 5-FU adalah analog pirimidin yang dapat salah
dimasukkan ke dalam RNA dan DNA sebagai pengganti urasil atau timin, menyebabkan kematian sel.ura5 mutan
membutuhkan uridin eksogen untuk pertumbuhan dan dapat dipilih secara positif dalam media yang mengandung 5-
FOA. Pelengkap auxotrophy uridin dengan pengenalanura5gen dapat dipilih dalam media tanpa uridin eksogen50. Itu
ura5mutan nol dihasilkan oleh penggantian homolog viaA. tumefacienstransformasi termediasi diisolasi menggunakan
seleksi positif dalam media M-100 yang dilengkapi dengan uridin 20 mM dan 0,8 mg/ml 5-FOA. Seperti yang diharapkan,Δ
Bbura5mutan gagal tumbuh tanpa adanya uridin, tetapi pertumbuhan vegetatif dan konidiasi penuhΔBbura5mutan
dapat dipulihkan dengan menambahkan uridin ke media SDAY, tidak menunjukkan perbedaan yang jelas dibandingkan
dengan tipe liar (Gambar Tambahan S2A, B). MutanΔBbura5 gagal membunuh serangga karena integumen serangga
tidak memiliki uridin yang cukup untuk memungkinkan pertumbuhan mutan ura5. Pelengkap melalui pengenalanBbura5
gen tidak hanya melengkapi auxotrophy uridin dariΔBbura5sensitivitas 5-FOA mutan dan pulih, tetapi virulensi jamur
juga pulih sepenuhnya terhadap nyamuk inang (Gambar Tambahan. S2C). Data ini menunjukkan bahwa penggunaan gen
penanda auxotrophic ini berulang kaliura5adalah alat genetik yang berguna untuk generasi knockout multi-gen dan/atau
komplemen genetik di
B. bassiana.

CRISPR/Cas9 memperkenalkan arahan secara efisienURA5mutagenesis diB. bassianamelalui non-homol-

perbaikan sambungan akhir yang mencolok.Sistem CRISPR yang efisien mengandung enzim Cas9 untuk
membelah DNA dan sgRNA untuk gen penargetan. SgRNA yang sesuai ditranskripsiin vitromenggunakan MEGAscript T7
Kit (Ambion). Untuk menguji kinerja sistem Cas9-sgRNA diB. bassiana, kami memilihura5sebagai target pertama

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 3

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 2.ura5gen sangat terganggu secara efisien dalam pengekspresan Cas9B. bassianaoleh sistem CRISPR/
Cas9 melalui transformasi berbasis blastospora.(SEBUAH) Blastospora dan konidia dariB. bassiana. Batang = 10μm. (B
) Pertumbuhan ekspresi Cas9B. bassianadan satu perwakilanura5mutan yang terganggu pada pelat M-100 yang
mengandung 0,8 mg/ml 5-FOA dan 20mM Uridine. (C) Urutan keselarasan dariura5lokus ekspresi Cas9-B. bassianadan
12 transforman (Seq1–Seq12). Urutan PAM disorot dengan warna hijau, sedangkan urutan pemandu sgRNA disorot
dengan warna merah. Penghapusan dan substitusi nukleotida digambarkan dengan warna biru.

gen karenaura5strain yang kekurangan memiliki fenotip yang mudah dibedakan dibandingkan dengan WT, menjadi
auksotrofik untuk urasil atau uridin, dan tahan terhadap analog 5-FOA urasil beracun24,25,35. Selanjutnya, sgRNA berisi
urutan 20 bp yang menargetkanura5gen di depan situs PAM (disebut sebagaiBbura5-sgRNA1) dirancang. Blastospor
yang kompeten dari pengekspres Cas9B. bassianadisiapkan sebagai sel penerima sgRNA eksogen (Gbr. 2A), dan disimpan
pada suhu −80 ° C untuk transformasi selanjutnya. ItuBbura5-sgRNA1 diperkenalkan ke strain penerima melalui
transformasi berbasis blastospora43. Lusinan koloni ditampilkan pada pelat M-100 yang mengandung 0,8 mg/ml 5-FOA
dan uridin 20mM. Tidak ada koloni jamur yang diamati pada pelat transformasi kontrol, di mana sgRNA tidak digunakan
dalam transformasi. Kami secara acak memilih 12 transforman dan dipindahkan ke pelat M-100 baru yang mengandung
0,8 mg/ml 5-FOA dan uridin 20 mM, dan menemukan bahwa semua transforman diduga dapat bertahan (Gbr. 2B). Untuk
memvalidasi lebih lanjut bahwa mutasi disebabkan oleh aktivitas pembelahan Cas9 yang dipandu gRNA di lokus endogen
target, produk PCR dariBbura5gen dari 12 transforman diurutkan. Semua transforman tahan 5-FOA yang dipilih
menampilkan penghapusan atau penyisipan di lokasi target yang diharapkan, terletak secara proksimal 3 bp di hulu
urutan PAM (Gbr. 2C). Hal ini konsisten dengan fakta bahwa DSB yang dipandu CRISPR/Cas9 dapat diperbaiki melalui
mekanisme NHEJ, yang menghasilkan penyisipan dan penghapusan di sekitar lokasi pembelahan.

Penggantian gen yang dimediasi CRISPR/Cas9 padaB. bassianamelalui rekombinasi-diarahkan homolog

memperbaiki.Karena torehan yang dihasilkan oleh kompleks Cas9-gRNA dapat disegel oleh mekanisme perbaikan endogen
NHEJ atau HDR, kami selanjutnya mencoba menguji efisiensi HDR dengan sistem CRISPR/Cas9 diB. bassiana. Untuk menggunakan
endogenura5gen sebagai penanda yang dapat dipilih, kami menggunakan strain pengekspres Cas9 yang bergantung pada uridin
(dinamai sebagai Bbcas9∆ura5regangan) yang dihasilkan olehAgrobacterium-dimediasi transformasi sebagai strain penerima baru.
BBCas9∆ura5strain juga mengekspresikan penanda fluoresen eGFP, gangguan yang berhasilegfpdapat dibedakan secara sederhana
dengan mikroskop fluoresen. Kami dengan demikian memilihegfpgen sebagai target untuk menguji efisiensi penggunaan sistem
CRISPR / Cas9 untuk penggantian gen yang ditargetkan melalui HDR yang dimediasi DNA donor homolog. Untuk membangun
DNA donor rekombinasi homolog (dDNA) yang mengandungura5kaset pelengkap, lengan homologi relatif 250 bp dariBbegfpgen
dekat situs PAM ditambahkan ke kedua sisi kaset penanda seleksi (Pgpd-Bbura5-TtrpCkaset) (Gbr. 3A). Setelah ko-transformasi dari
Bbegfp-dDNA dan disintesis Bbegfp-sgRNA1 (5′-GGCATCGACTTCAAGGAGGAcgg-3′)ke BBCas9∆ura5penerima, kami memperoleh
banyak transforman pada pelat skrining M-100 tanpa uridin. Selanjutnya kami secara acak memilih 16 transforman dan
menemukan bahwa semua transforman kehilangan fluoresensi (Gbr. 3B). Analisis PCR diagnostik lebih lanjut menegaskan bahwa
Pgpd-Bbura5-TtrpCkaset penanda seleksi telah terintegrasi di situs pembelahan Cas9 yang diharapkan diegfplokus di semua
transforman yang diuji (Gbr. 3C). Hasil ini menunjukkan bahwa sepasang lengan homologi 250 bp di kedua sisi

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 4

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 3. KO gen yang dimediasi CRISPR/Cas9 melalui perbaikan terarah-rekombinasi homolog (HDR) diB.
bassianaBB252.(SEBUAH) Skema menunjukkan penggantian homolog dariegfpoleh HDR yang dimediasi DNA donor
homolog melalui sistem CRISPR / Cas9. (B) Gambar medan terang dan berpendar dari galur penerima yang
mengekspresikan eGFP Bbcas9∆ura5dan 16 dipilih secara acakegfp-transforman yang terganggu melalui sistem
pengeditan gen CRISPR/Cas9. Semua transforman tidak berpendar, menunjukkanegfpberhasil diganggu di semua
transforman (efisiensi 100%). Konidia jamur diinokulasi pada pelat SDAY dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 25 °C. (
C) Analisis PCR spesifik penggantian. Konfirmasi penggantian gen yang diprediksi dilakukan dengan sepasang primer
yang terletak di kedua sisi lengan homolog. Pita 274 bp dan 2,5 kb mewakili tipe liar danegfpgenotipe gangguan,
masing-masing. M: penanda molekuler DNA; 1–12: dua belas transforman yang dipilih secara acak; RCPT: strain
penerima BBCas9∆ura5.

gen target cukup untuk mencapai integrasi homolog yang efisien yang distimulasi oleh sistem CRISPR/Cas9 diB. bassiana,
dibandingkan dengan protokol integrasi homolog standar dengan lengan homologi yang lebih panjang dari 1.000 bp.

Mutagenesis bertarget simultan dari banyak gen diB. bassianamenggunakan CRISPR/Cas9

sistem.Mutagenesis simultan dari banyak gen sangat penting untuk mempelajari gen dan keluarga gen yang redundan
secara fungsional. Jadi kami selanjutnya menilai apakah sistem CRISPR/Cas9 dapat memfasilitasi mutagenesis multi-lokus
secara simultanB. bassiana. Kami pertama kali mencoba memperkenalkan dua penargetan suntingan secara bersamaan
egfpdan gen yang dipilih secara acakBbmp1(XM 008600853), pengkodean untuk MAP kinase diduga, dengan satu
penanda pilihanura5. UntukBbegfpmutagenesis, kami menggunakan hal yang samaBbegfp-sgRNA1 danBbegfp-dDNA.
Untuk mutagenesis dariBbmp1, kami merancang aBbmp1-sgRNA1 (5′-GGAACTTCATCTGCTGGAAGcgg-3′)dan relatifBbmp1
-dDNA (mengandung Pgpd-Bbura5-TtrpCkaset dan 5′dan 3′mengapit daerahmp1) (Gbr. 4A). Kemudian kami mengubah
kedua sgRNA dan dDNA terkait menjadi Bbcas9∆ura5regangan penerima. Satu transformasi menghasilkan lusinan
transforman pada pelat transformasi bebas uridin. Analisis PCR diagnostik mengkonfirmasi bahwa 7 dari 18 (efisiensi
39%)) transforman yang dipilih secara acak adalah pengganggu gen ganda, 9 dari 18 (50%) adalahegfppengganggu gen
tunggal, dan 2 dari 18 (11%) adalahmp1pengganggu gen tunggal (Tabel 1 dan Gambar. 4B).

Selanjutnya, kami menguji efisiensi penggantian gen rangkap tiga secara homolog. Gen pengatur konidiasi
Bbrgs1(EF116883), yang mengkode gen pensinyalan protein G, digunakan sebagai target ketiga. Mutasi diBbrgs1
dapat dengan mudah disaring secara fenotip untuk hasil konidial yang berkurang. Demikian pula,Bbrgs1-sgRNA1
(5′-GGCATTCAACAGAAACAGGTcgg-3′)dan relatifBbrgs1-dDNA (mengandung Pgpd-Bbura5-TtrpCkaset dan 5′dan 3
′mengapit daerahrgs1) dihasilkan (Gbr. 4A). Setelah ko-transformasi dari ketiga set gRNA dan dDNA ini, 20
tranforman dipilih dan kemudian diperiksa dengan PCR diagnostik. Hasilnya dirangkum dalam Tabel 2 dan
Gambar. 4C. Ada satu∆egfp/∆mp1/∆rgs1pengganggu tiga gen (5%), empat ∆egfp/∆mp1pengganggu gen ganda
(20%), satu∆mp1/∆rgs1pengganggu gen ganda (5%), satu∆egfp/∆rgs1 pengganggu gen ganda (5%), sepuluh∆
egfppengganggu gen tunggal (50%) dan tiga∆mp1pengganggu gen tunggal (15%). SemuaBbrgs1mutan
menunjukkan produksi konidial yang berkurang secara signifikan pada pelat SDAY. Bersama-sama, hasil ini
menunjukkan bahwa sistem CRISPR/Cas9 adalah pendekatan yang andal dan kuat untuk mengganggu banyak
gen secara bersamaanB. bassiana.

Diskusi
Pendekatan manipulasi genetik yang efisien akan sangat mempercepat kemajuan di masa depan dalam
interogasi sistematis fungsi gen diB. bassianadan rekayasa gen untuk perbaikan mycoinsecticide. Gangguan gen
terutama dicapai melaluiAgrobacterium-transformasi termediasi diB. bassiana, tetapi tingkat homolog

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 5

www.nature.com/scientificreports/

Gambar 4. Mutagenesis bertarget simultan dari banyak gen diB. bassianamenggunakan sistem CRISPR/
Cas9.(SEBUAH) Skema menunjukkan penggantian homolog dariegfp,mp1danrgs1oleh DNA donor homolog
yang dimediasi HDR melalui sistem CRISPR/Cas9. (B) Skrining PCR dariegfpdanmp1pengganggu gen ganda. Pita
274 bp dan 2,5 kb mewakili produk PCR dari RCPT danegfpmengganggu, masing-masing. Pita 701 bp dan 2,9 kb
mewakili produk PCR dari RCPT danmp1mengganggu, masing-masing. (C) Skrining PCR dariegfp,mp1danrgs1
pengganggu tiga gen. Pita 274 bp dan 2,5 kb mewakili produk PCR dari RCPT danegfpmengganggu, masing-
masing. Pita 701 bp dan 2,9 kb mewakili produk PCR dari RCPT danmp1mengganggu, masing-masing. Pita 638
bp dan 2,8 kb mewakili produk PCR dari RCPT danrgs1mengganggu, masing-masing. RCPT: strain penerima
BBCas9∆ura5; P: plasmid sebagai kontrol positif; NT: tidak ada kontrol templat; M: penanda molekuler DNA.

Mutan Jumlah transforman frekuensi SDM

∆egfp/∆mp1 7 39%
∆egfp 9 50%
∆mp1 2 11%

Tabel 1. Transforman dari gangguan gen gandaegfpdanmp1diB. bassiana.

Mutan Jumlah transforman frekuensi SDM

∆egfp/∆mp1/∆rgs1 1 5%
∆egfp/∆mp1 4 20%
∆mp1/∆rgs1 1 5%
∆egfp/∆rgs1 1 5%
∆egfp 10 50%
∆mp1 3 15%

Tabel 2. Transforman dari gangguan tiga genegfp,mp1danrgs1diB. bassiana.

rekombinasi relatif rendah karena pekerjaan utama jalur perbaikan NHEJ, yang membuat genetika terbalik
menjadi menantang. Meskipun tingkat rekombinasi homolog mungkin dapat ditingkatkan dengan urutan
mengapit yang lebih besar, efisiensi kloning menjadi faktor pembatas. Oleh karena itu, protokol penghapusan /
gangguan gen standar dengan integrasi homolog biasanya menggunakan daerah mengapit lebih dari 1 kb di
kedua sisi gen target.
Studi kami menunjukkan bahwa sistem CRISPR / Cas9 menunjukkan frekuensi rekombinasi homolog yang
sangat tinggi ketika sepasang lengan homologi mengapit 250 bp digunakan. Pengenalan DNA asing ke dalam
B. bassianabiasanya bergantung pada protoplas jamur melalui transformasi DNA yang dimediasi PEG, elektroporasi20dan pengeboman
senjata gen41atau konidia melaluiAgrobacterium-transformasi yang dimediasi14,21. Tiga pendekatan pertama biasanya mengalami efisiensi
transformasi yang rendah dan persiapan protoplas yang melelahkan, yang terlalu rapuh untuk diawetkan di laboratorium untuk penggunaan
di masa mendatang.20,41. ItuAgrobacterium-Transformasi yang dimediasi memakan waktu

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 6

www.nature.com/scientificreports/

dan kurang bermanfaat untuk penggantian gen melalui perbaikan yang diarahkan oleh homologi18. Kami telah
mengembangkan sistem CRISPR/Cas9 diB. bassianaberdasarkan transformasi blastospora bukan transformasi protoplas.
Blastospora yang kompeten mudah disiapkan dan dapat dibekukan untuk penyimpanan jangka panjang43, yang akan
berlaku untuk jamur penghasil blastospora lainnya. Selama ini, disrupsi atau penggantian gen mengandalkan
penggunaan penanda resistensi antibiotik atau herbisida. Dalam penelitian ini, kami mengembangkan sistem
transformasi tanpa penanda untukB. bassianadengan mengeksploitasi auksotrofi uridin, yang dihasilkan dari gangguan
ura5gen. Ukuran dariura5gen (699 bp) lebih kecil dariura3gen (1.098 bp), yang memfasilitasi konstruksi DNA donor untuk
melengkapi auksotrofi uridin. Akibatnya, gen target digantikan olehura5memulihkan kemampuan transforman untuk
tumbuh tanpa adanya uridin eksogen dan kepekaan terhadap 5-FOA. Sejakura5mutan tidak dapat tumbuh tanpa uridin,
sistem pengeditan gen kami berdasarkan auksotrofi uridin/ura5komplemen memiliki latar belakang positif palsu yang
rendah. Selain itu, kurangnya kebutuhan untuk menggunakan antibiotik/herbisida juga hemat biaya. Lebih penting lagi,
sistem kami memungkinkan pengeditan simultan beberapa gen yang tidak terkait dalam satu transformasi. Meskipun
frekuensi untuk mutan pengganti ganda adalah 32% dan untuk mutan pengganti rangkap tiga hanya 5% pada gen yang
diuji, kami memiliki alasan untuk percaya bahwa frekuensi yang lebih tinggi dari penargetan beberapa gen secara
simultan dapat dicapai dengan mengoptimalkan proporsi yang berbeda. gRNA dan dDNA dari banyak gen35atau bahkan
menggunakan donor berbeda yang mengandung berbagai penanda seleksi. Kami mencatat bahwa memperkenalkan
ura5kaset menjadi beberapa lokus gen target menyebabkan over-ekspresiura5pada strain mutan. Meskipun kami tidak
mengamati perubahan nyata dalam pertumbuhan vegetatif dan produksi konidia di antara keduanya∆egfp/∆mp1 mutan
ganda dan WT, efek dariura5ekspresi berlebih pada virulensiB. bassianaharus diuji dalam studi masa depan. Selain itu,
promotor yang dapat diinduksi atau berbagai gen penanda yang dapat dipilih juga akan diuji.
Studi ini menunjukkan pengeditan yang tepat dariB. bassianagenom melalui perbaikan DSB yang diinduksi Cas9 dalam
perbaikan DNA rawan kesalahan yang dimediasi NHEJ dan penggantian DNA bebas kesalahan yang dimediasi HDR. Meskipun
beberapa penelitian pada sel mamalia dan sistem lain telah melaporkan bahwa kompleks Cas9/gRNA memiliki kemampuan untuk
mengikat dan memotong urutan DNA dengan homologi yang tidak sempurna, sehingga menimbulkan mutasi yang tidak tepat
sasaran.51, beberapa ketidakcocokan yang tersebar di daerah pengikatan, terutama urutan yang paling dekat dengan PAM (juga
disebut 'urutan benih'), tampaknya menghilangkan mutagenesis52,53. Oleh karena itu, efek di luar target mungkin bermasalah
pada organisme genom besar. Memang, sejauh ini mutasi CRISPR/Cas9 yang tidak sesuai target belum terdeteksiDrosophila54,55.
Pengurutan seluruh genom dariS.cerevisiaegalur yang dimutasi melalui sistem CRISPR/Cas9 juga menunjukkan bahwa efek di luar
target tidak signifikan pada jamur56,57. Untuk meminimalkan efek Cas9 di luar target dalam penelitian ini, kami mencoba
menghindari pemilihan situs target, terutama 12 nukleotida proksimal protospacer, yang memiliki urutan homolog yang erat di
tempat lain diB. bassianagenom.
Singkatnya, dengan menggabungkan penggunaan transformasi yang dimediasi blastospora dan auksotrofi uridin /ura5
pelengkap, kami telah menunjukkan bahwa CRISPR / Cas9 dapat menjadi alat yang ampuh untuk knock-out dan / atau knock-in
gen target efisiensi tinggiB. bassiana, dan memiliki potensi signifikan untuk memajukan pemahaman tentang patogenesisnya.
Lebih penting lagi, sistem kami akan memungkinkan kami untuk mengatasi masalah redundansi fungsional di mana gangguan
pembangkitan tiga gen dibatasi oleh ketersediaan hanya dua penanda resistensi. Pengembangan dan keberhasilan penerapan
sistem CRISPR/Cas9 untuk penyuntingan genom diB. bassianamungkin memiliki aplikasi luas untuk jamur entomopatogen lainnya.

Bahan dan metode

Strain dan plasmid.E.coliDH5α digunakan sebagai inang untuk kloning dan pemeliharaan plasmid. ItuB. bassianastrain
252 (Bb252) digunakan sebagai inang untuk ekspresi Cas9.A. tumefaciensAGL-1 digunakan untuk mengubah cas9gen ke
Bb252. Strain jamur dipertahankan pada Sabouraud Dextrose Agar plus ekstrak Ragi (SDAY, BD Difco) pada suhu 25 °C.
vektor pMD-18T (Takara, Dalian, China) digunakan untuk memelihara template gRNA dan vektor PUC19 (Takara, Dalian,
China) digunakan untuk memelihara dDNA dalam DH5a. pBarGPE dan pBarGFP digunakan untuk membangun vektor
transformasi.

Ekspresi cas9 diB. bassiana.Primer yang digunakan untuk konstruksi plasmid dan sintesis templat tercantum dalam
Tabel Tambahan S1. Primer yang digunakan untuk PCR diagnostik dan analisis sekuensing tercantum dalam Tabel
Tambahan S2. Untuk menghasilkan pBarGFPcas9 plasmid yang mengekspresikan Cas9, di mana Cas9-Myc-NLS
ditempatkan di bawah kendali promotor konstitutif PgpdA, kami mensintesis aB. bassianadioptimalkan dengan kodon
cas9gen dariStreptococcus pyogenes. Gen yang disintesis dirancang dalam bingkai dengan tag Myc terminal-C
(EQKLISEEDL) dan peptida sinyal lokalisasi nuklir (PKKKRKV). Fragmen DNA 4.209 bp yang mengandung Cas9-Myc-NLS
dikloning ke dalamBamHI danRamah lingkungansitus RI dari pBarGPE1 plasmid58, yang berisi agpdA promotor (PgpdA)
dantrpCterminasi (TtrpC) mengapitBamHI danRamah lingkungansitus RI. PgpdA-BBCas9-TtrpC kaset dikeluarkan dari
pBarGPEcas9 sebagai 6.423 bpSpeSAYA/NdeFragmen tumpul-I dan diikat ke dalam yang sesuaiSpeSAYA/Ramah
lingkunganSitus RV pBarGFP59untuk menghasilkan pBarGFPcas9. pBarGFPcas9 diubah menjadi wild type Bb252
menggunakanAgrobacterium-dimediasi transformasi jamur. Transforman dipilih pada pelat M-10060
mengandung glufosinate-ammonium (200μg/ml) dan cefotaxime (400μg/ml).
Untuk persiapan RNA, spora jamur dikultur pada selofan dalam media SDAY selama 3 hari. Kemudian sampel
dikumpulkan dan dihomogenkan dalam nitrogen cair, dan RNA total dariB. bassianadiekstraksi menggunakan RNAiso
Plus (Takara). cDNA dari setiap sampel dihasilkan menggunakan PrimeScriptTMKit reagen RT dengan Penghapus gDNA
(Takara). Sampel DNA komplementer digunakan sebagai template untuk RT-PCR untuk memverifikasiBBCas9ekspresi
gen. Primer tercantum dalam Tabel Tambahan S2.
Untuk persiapan protein jamur, strain transforman dan tipe liar ditumbuhkan pada hari SDAY selama satu minggu dan
kemudian konidia dikulturkan dalam Sabouraud dextrose broth (SDB) (106konidia/ml) selama 36 jam pada suhu 25 °C. Miselium
yang dikumpulkan dengan filtrasi ditumbuk dalam nitrogen cair dan disuspensikan dalam buffer RIPA (Beyotime, P0013B).
Kemudian protein diperiksa dengan SDS-PAGE dan western blot menggunakan antibodi anti-Myc (abmart, M20002).

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 7

www.nature.com/scientificreports/

Gangguan dariura5melaluiA. tumefaciens-rekombinasi homolog termediasi.Untuk dis-

pecahnyaura5, 5′dan 3′mengapit daerahura5ORF diamplifikasi oleh PCR dari DNA genom Bb252, dan kemudian
disubklon keXBAsaya danSpeSaya situs pBarGFP vektor biner. Konstruk gangguan gen (pBarGFPura5) kemudian
diubah menjadiA. tumefaciensAGL-1 untuk gangguan gen yang ditargetkan melalui rekombinasi homolog.Δ
Bbura5mutan dipilih secara positif pada pelat M-100 yang dilengkapi dengan 0,8 mg/ml 5-FOA dan uridin 20 mM.

Bioassay serangga.Bioassay virulensi jamur dilakukan terhadap betina berumur 3-5 hariAnopheles stephensi
nyamuk. Nyamuk dibius dengan karbon dioksida (CO2) dan diinokulasi secara topikal dengan penyemprotan 5×10
7konidia/ml suspensi dengan 1 ml pengabut kaca. Kelebihan cairan pada tubuh nyamuk dihilangkan dengan
meletakkannya di atas tisu kering. Kontrol diperlakukan dengan larutan Triton X-100 0,01% steril. Nyamuk
percobaan dan kontrol ditempatkan dalam cangkir dan dipelihara pada larutan sukrosa 10% pada suhu 27 °C dan
80±5% kelembaban relatif. Setiap perlakuan diulang tiga kali dengan 50 nyamuk betina per ulangan, dan
bioassay diulang tiga kali. Kematian serangga dicatat setiap 12 jam setelah pengobatan.

Desain dan sintesis sgRNA olehin vitrotranskripsi.gRNA dirancang dengan mencari secara manual
ing daerah gen untuk keberadaan Protospacer-Adjacent Motifs (PAMs) dengan urutan NGG, di mana N adalah
nukleotida apapun. Kami menetapkan kondisi di mana urutan gRNA panjangnya 20 bp, tidak termasuk PAM, dan
berisi satu atau dua 5′guanin terminal untuk memfasilitasi transkripsi oleh T7 RNA polimerase. Untuk
meminimalkan potensi mutagenesis di luar target, kami menghindari urutan gRNA dengan situs pengikatan yang
terkait erat untuk mengurangi kemungkinan pemotongan. Kaset gRNA yang berisi urutan promotor T7 17 bp,
urutan gRNA 20 bp, dan perancah gRNA 80 bp telah disintesis. Kaset ini kemudian diikat ke pMD-18T dan
dipertahankan dalam DH5α untuk transkripsi gRNA. Mengikuti pabrikan′s, produk amplifikasi dari pMD-18T yang
dimurnikan dengan Gel Extraction Kit (Omega) ditranskripsi menjadi RNAin vitromenggunakan MEGAscript T7 Kit
(Ambion, Life Technologies). Kemudian, gRNA yang ditranskripsi dimurnikan dengan larutan ekstraksi fenol/
kloroform diikuti dengan pengendapan isopropanol. RNA murni dilarutkan dalam air bebas nuklease.

Konstruksi DNA donor untuk penggantian 'knock-in' gen target.Untuk konstruksi dari
plasmid pUC19-Bbura5-Donor, itugpdpromotor (Pgpd) fragmen dantrpCterminasi (TtrpC) fragmen diamplifikasi
dengan PCRCordyceps militarisDNA genomik dengan pasangan primer Pgpd-F/Pgpd-R dan Ttrpc-F/ Ttrpc-R. Itu
ura5gen diamplifikasi dari DNA genom Bb252 menggunakan primer Bbura5-F dan Bbura5-R. Ketiga fragmen ini
disusun secara berurutan dengan ClonExpressTMKit kloning satu langkah MultiS (Vazyme, C113-01), dan diklon ke
SMASaya situs plasmid pUC19 untuk menghasilkan plasmid pUC19-Bbura5-Penyumbang. Untuk membangun
dDNA dari gen yang berbeda, sekuens mengapit gen target 5ʹ dan 3ʹ diamplifikasi dan dikloning ke dalamSMA
Saya situs dari plasmid pUC19-Bbura5- Vektor donor. Vektor yang dihasilkan disebarkan dalam DH5α dan
dimurnikan menggunakan Plasmid Midi Kit (Omega).

Transformasi jamur berbasis blastospora.Persiapan blastospora dan kompeten

transformasi berbasis blastospora dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya43dengan beberapa modifikasi.
Secara singkat, konidia jamur diinokulasi dalam kaldu SDB dan dikocok dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 25 °C selama 2 hari.
Setiap 5 ml alikuot kultur dipindahkan ke dalam 50 ml media GM (b/v, 4% glukosa, 0,4% NH4TIDAK3, 0,3%KH2PO4, dan 0,3% MgSO4)
dan dikultur selama 24-30 jam. Blastospora yang terbentuk dikumpulkan dengan menyaring melalui kertas lensa empat lapis dan
dipekatkan dengan sentrifugasi 3.000 rpm pada suhu 4 ° C selama 5 menit. Blastospora yang dipanen dicuci dua kali dengan ddH
steril2O dengan sentrifugasi pada 3.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 °C, lalu disuspensikan dalam 0,1M LiAc (1:50). Suspensi
blastospora ini dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml, diendapkan dengan sentrifugasi pada 7.000 rpm selama 5 menit
pada suhu 4 °C, dan kemudian disuspensikan kembali dalam 0,1M LiAc (1:100). Sampel diinkubasi pada suhu 4 °C selama 10 menit,
kemudian ditambahkan gliserol 12% pada konsentrasi akhir 3×108sel/ml dan segera dibekukan (nitrogen cair) dalam alikuot 100μl
dan disimpan pada suhu −80 °C.
Untuk transformasi, semua operasi dilakukan pada suhu 4 °C menggunakan larutan sedingin es. Sel kompeten beku dicairkan
di atas es, dan dipanen dengan sentrifugasi pada 7.000 rpm selama 5 menit. Agen berikut ditambahkan dengan urutan sebagai
berikut: 240 μl 50% PEG 4000, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl DNA sperma salmon genom terdenaturasi 2 g/L, fragmen sgRNA 50μg dan
plasmid yang mengandung DNA donor 20μg, dan 35μl dari 1M dithiothreitol. Kemudian sampel dicampur secara menyeluruh
selama 1 menit setelah penambahan reagen terakhir. Sampel diinkubasi dalam es selama 30 menit, kemudian dilakukan kejutan
panas selama 20 menit pada suhu 42 °C dan segera diinkubasi dalam es selama 5 menit. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi pada
7.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ° C dan disuspensikan kembali dalam 0,2 ml H suling steril.2O pada suhu kamar.
Transforman yang ditargetkan dipilih pada media M-100 tanpa uridin eksogen.

PCR diagnostik dan analisis sekuensing DNA.Mutan knock-in diduga dihasilkan oleh sistem CRISPR/ Cas9
diverifikasi oleh PCR diagnostik atau analisis pengurutan. DNA genom jamur diekstraksi sesuai dengan protokol
standar (ekstraksi fenol / kloroform dan presipitasi isopropanol). Primer untuk analisis indel dirancang untuk
menutupi bagian hulu dan hilir dari situs pembelahan gRNA yang diharapkan.

Referensi
1. Thomas, MB & Read, AF Dapatkah biopestisida jamur mengendalikan malaria?Nat. Pendeta Mikrobiol.5,377–383 (2007).
2. Wang, C., Fan, M., Li, Z. & Butt, T. Pemantauan molekuler dan evaluasi penerapan jamur patogen serangga Beauveria
bassianadi tenggara Cina.J.Appl. Mikrobiol.96,861–870 (2004).
3. Knols, BG, Bukhari, T. & Farenhorst, M. Jamur entomopatogen sebagai agen pengendali nyamuk malaria generasi selanjutnya.
Mikrobiol Masa Depan.5,339–341 (2010).
4. Parsa, S., Ortiz, V. & Vega, FE Membangun entomopatogen jamur sebagai endofit: menuju kontrol biologis endofit.J.Vis. Exp.,
doi: 10.3791/50360 (2013).

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 8

www.nature.com/scientificreports/

5. de Faria, MR & Wraight, SP Mycoinecticides and mycoacaricides: daftar lengkap dengan cakupan dunia dan klasifikasi
internasional untuk jenis formulasi.Biol. Kontrol43,237–256 (2007).
6. Shah, P. & Pell, J. Jamur entomopatogen sebagai agen pengendali hayati.Aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi.61,413–423 (2003).
7.Blanford,S.et al.Patogen jamur mengurangi potensi penularan malaria.Sains308,1638–1641 (2005).
8. Hajek, A. & St. Leger, RJ Interaksi antara jamur patogen dan inang serangga.Tahun. Pendeta Entomol.39,293–322 (1994).
9. Rangel, DE, Anderson, AJ & Roberts, DW Mengevaluasi stres fisik dan nutrisi selama pertumbuhan miselium sebagai penginduksi toleransi
terhadap panas dan radiasi UV-B padaMetarhizium anisopliaekonidia.Mycol. Res.112,1362–1372 (2008).
10. Zou, G., Ying, SH, Shen, ZC & Feng, MG Mutasi beta-tubulin multi-lokasi terlibat dalam resistensi benzimidazole dan
termotoleransi agen biokontrol jamurBeauveria bassiana.Mengepung. Mikrobiol.8,2096–2105 (2006).
11. Roberts, DW & St. Leger, RJMetarhiziumspp., jamur patogen serangga kosmopolitan: aspek mikologi.Lanjut Aplikasi Mikrobiol.
54,1–70 (2004).
12. Shang, Y., Duan, Z., Huang, W., Gao, Q. & Wang, C. Meningkatkan resistensi UV dan virulensiBeauveria bassianadengan
rekayasa genetika dengan gen tirosinase eksogen.J. Invertebr. Patol.109,105–109 (2012).
13. Krappmann, S., Sasse, C. & Braus, GH Gene menargetkan diAspergillus fumigatusoleh rekombinasi homolog difasilitasi dalam latar belakang genetik
yang tidak bergabung dengan akhir yang tidak homolog.Eukariot. Sel5,212–215, doi: 10.1128/ec.5.1.212-215.2006 (2006).
14. dos Reis, MC, Fungaro, PLTMH, Duarte, RTD, Furlaneto, L. & Furlaneto, MCAgrobacterium tumefaciens-Transformasi genetik
yang dimediasi jamur entomopatogenBeauveria bassiana.J. Mikrobiol. Metode58,197–202, doi:10.1038/sj.cr.7310006 (2004).

15. De Groot, MJ, Bundock, P., Hooykaas, PJ & Beijersbergen, AGAgrobacterium tumefaciens-Transformasi yang dimediasi jamur
berserabut.Nat. Bioteknologi.16(1998).
16. Michielse, CB, Hooykaas, PJ, Van Den Hondel, CA & Ram, AFAgrobacterium-transformasi yang dimediasi dari jamur berserabut
Aspergillus awamori.Nat. Protokol.3,1671–1678 (2008).
17. Gouka, RJet al.Transformasi dariAspergillus awamoriolehAgrobacterium tumefaciensrekombinasi homolog yang diperantarai.Nat.
Bioteknologi.17,598–601 (1999).
18. Koukaki, M., Giannoutsou, E., Karagouni, A. & Diallinas, G. Sebuah metode baru yang disempurnakan untukAspergillus nidulanstransformasi.J.
Mikrobiol. Metode55,687–695 (2003).
19. Zhang, S., Fan, Y., Xia, YX & Keyhani, NO Resistensi sulfonilurea sebagai penanda baru yang dapat dipilih untuk jamur entomopatogen
Beauveria bassiana.Aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi.87,1151–1156 (2010).
20. Pfeifer, TA & Khachatourians, GGBeauveria bassianaregenerasi dan transformasi protoplas menggunakan elektroporasi.Aplikasi
Mikrobiol. Bioteknologi.38,376–381 (1992).
21. Fang, W.et al. Agrobacterium tumefaciens-Transformasi yang dimediasi dariBeauveria bassianamenggunakan gen resistensi herbisida
sebagai penanda seleksi.J. Invertebr. Patol.85,18–24, doi: 10.1016/j.jip.2003.12.003 (2004).
22. Gouka, RJ, Hessing, JG, Stam, H., Musters, W. & Ca, VDH Strategi baru untuk isolasi yang ditentukanpirGmutan dan
pengembangan sistem integrasi khusus situs untukAspergillus awamori.Kur. Genet.27,536–540 (1995).
23. Bergès, T. & Barreau, C. Isolasi auksotrof uridin dariTrichoderma reeseidan transformasi yang efisien dengan hasil kloningura3
danura5gen.Kur. Genet.19,359–365 (1991).
24. Edman, JC & Kwon-Chung, K. Isolasi gen URA5 dariCryptococcus neoformansvar.neoformansdan penggunaannya sebagai penanda
selektif untuk transformasi.Mol. Sel. Biol.10,4538–4544 (1990).
25. Ying, SH, Feng, MG & Keyhani, NO Penggunaan auksotrofi uridin (ura3) untuk transformasi tanpa penanda dari mycoinsecticide Beauveria
bassiana.Aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi.97,3017–3025 (2013).
26. Barrangou, R.et al.CRISPR memberikan resistensi yang didapat terhadap virus pada prokariota.Sains315,1709–1712 (2007).
27. Doudna, JA & Charpentier, E. Perbatasan baru rekayasa genom dengan CRISPR-Cas9.Sains346,1258096 (2014).
28. Cong, L.et al.Rekayasa genom multipleks menggunakan sistem CRISPR/Cas.Sains339,819–823 (2013).
29. Sistem Sander, JD & Joung, JK CRISPR-Cas untuk mengedit, mengatur, dan menargetkan genom.Nat. Bioteknologi.32,347–355 (2014).
30. Jinek, M.et al.Endonuklease DNA yang dipandu dual-RNA yang dapat diprogram dalam kekebalan bakteri adaptifSains337,816–821 (2012).
31. Ran, FAet al.Rekayasa genom menggunakan sistem CRISPR-Cas9.Nat. Protokol.8,2281–2308 (2013).
32. Shalem, O., Sanjana, NE & Zhang, F. Genomik fungsional throughput tinggi menggunakan CRISPR-Cas9.Nat. Pendeta Genet.16,299–311
(2015).
33. Jacobs, JZ, Ciccaglione, KM, Tournier, V. & Zaratiegui, M. Penerapan sistem CRISPR-Cas9 dalam ragi fisi.Nat. Komunal.5
(2014).
34. DiCarlo, JEet al.Rekayasa genom diSaccharomyces cerevisiaemenggunakan sistem CRISPR-Cas.Asam Nukleat Res.gkt135 (2013).
35. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z. & Zou, G. Pengeditan genom yang efisien pada jamur berfilamenTrichoderma reeseimenggunakan sistem CRISPR/
Cas9.Penemuan Sel1,15007 (2015).
36. Matsu-ura, T., Baek, M., Kwon, J. & Hong, C. Pengeditan gen yang efisien diNeurospora crasadengan teknologi CRISPR.Biologi Jamur dan
Bioteknologi2,1 (2015).
37. Arazoe, T.et al.Sistem CRISPR/Cas yang dibuat khusus untuk penggantian gen target yang sangat efisien pada jamur rice blast.Bioteknologi. Bioeng.
112,2543–2549 (2015).
38. Fuller, KK, Chen, S., Loros, JJ & Dunlap, JC Pengembangan sistem CRISPR/Cas9 untuk gangguan gen yang ditargetkan padaAspergillus
fumigatus.Eukariot. Sel25,709–712 (2015).
39. Zhang, C., Meng, X., Wei, X. & Lu, L. Mutagenesis CRISPR yang sangat efisien dengan penggabungan akhir yang dimediasi mikrohomologiAspergillus
fumigatus.Gen Jamur. Biol.86,47–57 (2016).
40. Nødvig, CS, Nielsen, JB, Kogle, ME & Mortensen, UH Sistem CRISPR-Cas9 untuk rekayasa genetik jamur berfilamen. PLoS Satu10,
e0133085 (2015).
41. Jamur, PLTMHet al.Transformasi dariAspergillus nidulansoleh pemboman mikroproyektil pada konidia utuh.Mikrobiol FEM.
Lett.125,293–297 (1995).
42. Rombach, MC ProduksiBeauveria bassiana[Deuteromycotina. Hyphomycetes] sympoduloconidia dalam budaya terendam.
Biokontrol34,45–52 (1989).
43. Ying, S.-H. & Feng, M.-G. Sistem transformasi berbasis blastospora baru untuk integrasi resistensi fosfinotrisin dan gen protein fluoresensi
hijau ke dalamBeauveria bassiana.Aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi.72,206–210 (2006).
44. Ypsilos, IK & Magan, N. Karakterisasi kondisi lingkungan budaya yang optimal untuk produksi sejumlah besar Metarhizium
anisopliaeblastospora dengan peningkatan kebugaran ekologis.Ilmu Biokontrol. Technol.15,683–699 (2005).
45. Inch, JMM & Trinci, APJ Pengaruh aktivitas air terhadap pertumbuhan dan sporulasiPaecilomyces farinosusdalam media cair dan padat.
Mikrobiologi133,247–252 (1987).
46. Inch, JMM, Humphreys, AM, Trinci, APJ & Gillespie, AT Pertumbuhan dan pembentukan blastospora olehPaecilomyces
fumosoroseus, patogen wereng coklat (Nilaparvata lugens).Transaksi British Mycological Society87,215–222 (1986).
47. McCoy, CW, Hill, AJ & Kanavel, RF Media cair untuk produksi skala besarHirsutella thompsoniidalam budaya terendam.
J. Invertebr. Patol.19,370–374 (1972).
48. Hall, jamur RAVerticillium lecaniisebagai insektisida mikroba terhadap kutu daun dan sisik (1981).
49. Xiao, G.et al.Perspektif genomik tentang evolusi entomopatogenisitas jamur diBeauveria bassiana.Rep Sains2,483–483 (2012).

50. Hartl, L. & Seiboth, B. Penghapusan gen berurutan diHypocrea jecorinamenggunakan kaset blaster tunggal.Kur. Genet.48,204–211 (2005).

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 9

www.nature.com/scientificreports/

51. Pattanayak, V.et al.Pemrofilan throughput tinggi dari pembelahan DNA di luar target mengungkapkan spesifisitas nuklease Cas9 yang diprogram-RNA.Nat.
Bioteknologi.31,839–843 (2013).
52. Hsu, PDet al.Spesifisitas penargetan DNA dari nuklease Cas9 yang dipandu RNA.Nat. Bioteknologi.31,827–832, doi: 10.1038/nbt.2647
(2013).
53. Penargetan sistem Cradick, TJ, Fine, EJ, Antico, CJ & Bao, G. CRISPR/Cas9β-globindanCCR5gen memiliki aktivitas di luar target yang
substansial.Asam Nukleat Res.41,9584–9592 (2013).
54. Gratz, SJet al.Perbaikan yang diarahkan oleh homologi dengan katalis CRISPR/Cas9 yang sangat spesifik dan efisienDrosophila.Genetika196, 961–971
(2014).
55. Bassett, A., Tibbit, C., Ponting, C. & Liu, JL Mutagenesis bertarget yang sangat efisienDrosophiladengan sistem CRISPR/Cas9.Laporan Sel4,
1178–1179 (2013).
56. Jakočiūnas, T.et al.Rekayasa jalur metabolisme multipleks menggunakan CRISPR/Cas9 diSaccharomyces cerevisiae.Metab. Eng.28, 213–222
(2015).
57. Ryan, AWet al.Pemilihan perpustakaan DNA kromosom menggunakan sistem CRISPR multipleks.Ilmu Elife3,5365–5373 (2014).
58. McCluskey, K. Pusat Stok Genetika Jamur: Dari Jamur ke Molekul.Lanjut Aplikasi Mikrobiol.52,245–262 (2003).
59. Fang, W., Pava-Ripoll, M., Wang, S. & St. Leger, RJ Protein kinase A mengatur produksi penentu virulensi oleh jamur
entomopatogen,Metarhizium anisopliae.Gen Jamur. Biol.46,277–285 (2009).
60. Stevens, Buku Panduan Mikologi RB.ilmu biologi719(1974).

Terima kasih
Pekerjaan ini didukung oleh hibah dari Program Riset Prioritas Strategis Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok
(hibah no. XDB11010500), Program Seratus Bakat Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok, Yayasan Ilmu
Pengetahuan Alam Nasional Tiongkok (hibah no. 31472044) dan Proyek bakat Pujiang Shanghai (hibah no.
14PJ1410200).

Kontribusi Penulis
SW dan JC menyusun dan merancang percobaan. JC dan SZ melakukan percobaan. JC, SZ, YL dan LW
menganalisis data. GZ dan ZZ menyumbangkan reagen/bahan/alat analisis. JC dan SW menulis naskahnya.
Semua penulis meninjau naskah.

informasi tambahan
Informasi tambahanmenyertai makalah ini di http://www.nature.com/srep Minat

Bersaing:Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan keuangan yang bersaing.

Cara mengutip artikel ini:Chen, J.et al.Pengeditan genom efisien yang dimediasi CRISPR / Cas9 melalui transformasi berbasis
blastospora pada jamur entomopatogenBeauveria bassiana.Sains. Reputasi.7, 45763; doi: 10.1038/srep45763 (2017).

Catatan penerbit:Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan
afiliasi kelembagaan.

Karya ini dilisensikan di bawah Creative Commons Attribution 4.0 International License. Gambar atau materi
pihak ketiga lainnya dalam artikel ini termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel tersebut,
kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit; jika materi tersebut tidak termasuk di bawah lisensi Creative Commons,
pengguna harus mendapatkan izin dari pemegang lisensi untuk mereproduksi materi tersebut. Untuk melihat salinan
lisensi ini, kunjungi http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

© Penulis 2017

IlmiahLAPORAN|7:45763 | DOI: 10.1038/srep45763 10