BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Desain penelitian

Penelitian yang dilakukan ini merupakan suatu penelitian
eksperimental murni yang menggunakan metode rancangan acak terkontrol
dengan menggunakan pola post test only with control group-design.
Rancangan acak terkontrol dengan pola post test only with control group-
design adalah desain yang paling sederhana dari desain eksperimental (true
experimental design), karena sampel benar- benar dipilih secara random dan
diberi perlakuan serta ada kelompok pengontrolnya.(33)

4.2 Lokasi dan waktu penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Desember 2018 selama 15 hari
dengan masa adaptasi 7 hari sebelum perlakuan. Perawatan dan perlakukan
sampel bertempat di laboratorium Animal vet. Pembuatan preparat histologi
dilakukan di bagian Ilmu Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia. Pengamatan dan penilaian histopatologi dilakukan oleh dokter
spesialis Patologi Anatomi FK Universitas Trisakti.

4.3 Populasi dan sampel penelitian

4.3.1 Populasi penelitian
Populasi penelitian ini adalah tikus putih (Rattus novergicus) jantan
galur Sprague Dawley umur 2- 3 bulan.
4.3.2 Sampel peneilitian
Sampel penelitian adalah tikus putih (Rattus novergicus) jantan galur
Sprague Dawley umur 2-3 bulan yang diperoleh dari laboratorium penelitian
Animal vet dengan berat badan rata- rata antara 100- 150 gram. Pemilihan
sampel penelitian dilakukan secara acak dengan menggunakan teknik simple
random sampling. Selama penelitian, selain perlakuan utama, semua tikus
tetap diberi pakan tinggi protein sebanyak 20 gram per hari serta minum air ad
libitum.

21

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 4.4 Besar sampel
Menurut Notoadmodjo untuk penelitian eksperimental dengan rancangan
acak lengkap, acak kelompok atau faktorial, secara sederhana dapat digunakan
rumus Federer, yaitu (t-1) (r-1) > 15 dengan t adalah jumlah kelompok percobaan
dan r merupakan jumlah sampel tiap kelompok. (36) Penelitian ini akan
menggunakan lima kelompok perlakuan sehingga perhitungan sampel menjadi :
(t-1) (r-1) ≥ 15
(4-1) (r-1) ≥ 15
3 (r-1) ≥ 15
3r-3 ≥ 15
3r ≥ 18
r≥ 18/3
r≥ 6

Untuk mengantisipasi hilangnya unit eksperimen maka dilakukan koreksi dengan

menggunakan rumus :
N = n/(1-f)
Keterangan :
N = besar sampel koreksi
n = besar sampel awal = 6
f = perkiraan proporsi drop out sebesar 30%

sehingga,
N = n/(1-f)
N = 6/ (1-30%)
N = 6/ (1-0,3)
N = 6/0,7
N = 8,5  dibulatkan menjadi 9
Jadi diperoleh besar sampel yang akan digunakan pada kelompok perlakuan K(+),
P1 dan P2 sebanyak 9 ekor tikus putih. Sedangkan pada kelompok K(-) jumlah

22

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 tikus putih yang digunakan adalah jumlah standar, yaitu sebanyak 6 ekor tikus
putih. Jumlah total tikus yang digunakan pada penelitian ini sebanyak 33 ekor.

4.5 Pemilihan sampel

Penelitian ini menggunakan tikus putih (Rattus novergicus) jantan galur
Sprague Dawley. Pemilihan tikus putih galur tersebut karena memiliki sifat yang
lebih tenang. Selain itu tikus adalah hewan yang sering digunakan dalam
penelitian eksperimental karena memiliki kemiripan dengan manusia dalam hal
struktur anatomi. Pemilihan sampel dilakukan sesuai kriteria inklusi dan ekslusi
yang telah ditetapkan sebagai berikut :
1. Kriteria Inklusi :
a) Tikus jenis Rattus novergicus galur Sprague dawley
b) Jenis kelamin jantan
c) Umur 2-3 bulan
d) Berat 100-150 gram
e) Tikus belum pernah digunakan dalam penelitian sebelumnya
2. Kriteria Ekslusi :
a) Tikus tidak sehat atau sakit (penampakan rambut kusam, rontok atau botak
dan aktivitas kurang atau tidak aktif, keluarnya eksudat yang tidak normal
dari mata, mulut, anus, atau genital)
Tikus yang digunakan berusia 2- 3 bulan dengan berat 100-150 gram, karena pada
usia tersebut pertumbuhan tikus dalam tahap optimal, yaitu dengan kemampuan
metabolisme dan fungsi organ masih normal sehingga diharapkan memiliki daya
tahan yang cukup selama penelitian. Tikus yang dipilih adalah tikus jantan karena
secara biologis lebih menguntungkan dan tikus jantan tidak terkait faktor
hormonal sehingga tidak mengalami daur estrogen, periode kehamilan, dan
menyusui yang dapat mengganggu aktivitas penelitian.

23

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 4.6 Bahan dan instrumen penelitian
4.6.1 Alat pemeliharaan hewan coba
1) kandang dari kotak plastik
2) kandang dari anyaman kawat
3) rak tempat menaruh kandang
4) botol air
5) tempat pakan

4.6.2 Alat perlakuan

1) Gelas ukur OneMed®
2) Gelas beker OneMed®
3) Timbangan analitik Kern®
4) Spuit 1ml OneMed®
5) Sonde
6) Minor set Renz®
7) Tabung reaksi dengan penutup ulir Iwaki®
8) Pipet ukur Pyrex®
9) Mikroskop cahaya Olympus®

4.6.3 Bahan penelitian

1) Deksametason
Deksametason yang digunakan dalam penelitian ini adalah sediaan
injeksi 5mg/ml produksi Indofarma®. Deksametason diinjeksikan secara
subkutan menggunakan alat suntik 1 ml dan jarum ukuran 27G (0,4
mm).
2) Ekstrak kulit bawang merah
Ektrak kulit bawang merah diperoleh dari Fakultas Farmasi
Universitas Mulawarman Samarinda. Ekstrak berupa serbuk kemudian
dibuat sediaan suspensi dengan menambahkan NaCMC 1%. Larutan
ekstrak kemudian diberikan secara oral dengan dosis 200mg/kgBB/hari
pada tikus di kelompok P1 dan 400mg/kgBB/hari pada tikus di

24

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 kelompok P2. Ekstrak kulit bawang merah diberikan menggunakan
sonde lambung.

3) Preparat histologi pankreas

Preparat histopatologi pankreas dibuat di bagian Patologi Anatomi
FK UI dengan mengirimkan pankreas tikus dalam larutan formalin yang
diambil setelah dilakukan terminasi. Sediaan diwarnai dengan
pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) yang kemudian diamati dan dinilai
menggunakan mikroskop cahaya.

4.7 Prosedur Penelitian

Tikus Sprague Dawley jantan berjumlah 33 ekor diaklimatisasi selama 7
hari. Selama aklimatisasi, tikus diberi makan tinggi protein sebanyak 20
g/ekor/hari dan diberi minum ad libitum. Tujuan aklimatisasi ini adalah untuk
menyeragamkan cara hidup dan makanan hewan coba. Setelah aklimatisasi, tikus
kemudian dilakukan randomisasi dan dibagi kedalam 4 kelompok perlakuan.
Jumlah sampel pada kelompok K+, P1 & P2 adalah 9 ekor, sedangkan pada
kelompok K- adalah 6 ekor. Keempat kelompok tersebut dibagi menjadi sebagai
berikut:
1. Kelompok P1, kelompok yang mendapat pakan tinggi protein 20g/hari dan
air minum ad libitum dengan diberi deksametason 0,13 mg/KgBB/ekor/ hari
secara subkutan dan diberi ekstrak kulit bawang merah 200 mg/Kg dalam
naCMC 1% secara oral satu kali sehari selama 14 hari.
2. Kelompok P2, kelompok yang mendapat pakan tinggi protein 20g/hari dan
air minum ad libitum dengan diberi deksametason 0,13mg/KgBB/ekor/hari
secara subkutan dan diberi ekstrak kulit bawang merah 400 mg/Kg dalam
naCMC 1% secara oral satu kali sehari selama 14 hari.
3. Kelompok kontrol positif (K+) adalah kelompok yang mendapat pakan
tinggi protein 20 g/ekor/hari dan air minum ad libitum serta diberi
deksametason 0,13 mg/KgBB/ekor/hari dan suspensI naCMC 1% selama 14
hari.

25

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 4. Kelompok kontrol negatif (K-) adalah kelompok yang hanya mendapat
pakan tinggi protein 20g/hari dan air minum ad libitum.

Pemberian deksametason pada penelitian ini dilakukan secara injeksi

melalui subkutan. Cara ini dipilih karena diharapkan distribusi obat dapat lebih
cepat dan merata. Pemberian ekstrak kulit bawang merah dilakukan secara oral
dengan melarutkan ekstrak etanol kulit bawang merah dengan suspensi NaCMC 1
%. Suspensi NaCMC dipilih karena relatif aman dan tidak mempengaruhi
kandungan ekstrak. Tikus pada kelompok K(+) diberi NaCMC sebanyak 0,5
ml/hari untuk menghilangkan efek pelarut sehingga diharapkan tidak
mempengaruhi hasil penelitian. Pemberian perlakuan dilakukan selama 14 hari
karena waktu tersebut termasuk dalam jangka waktu penggunaan deksametason
secara kronik.
Setelah diberi perlakuan selama 14 hari, pada hari ke-15 tikus kemudian
diterminasi dengan metode cervical dislocation. Metode ini dilakukan dengan
cara memberikan anasthesi menggunakan ketamin xylazine lalu tengkorak dan
otak dipisahkan dari sumsum tulang belakang dengan cara memberikan tekanan
ke bagian posterior dasar tulang tengkorak dan sumsum tulang belakang. Bila
sumsum tulang belakang terpisah dari otak, refleks kedip menghilang dengan
segera dan rangsangan rasa sakit menghilang. Sehingga hewan tidak merasakan
rasa sakit.

4.7.1 Penilaian histopatologi pankreas

Preparat histopatologi pankreas yang telah diwarnai dengan pewarnaan HE
kemudian diamati dan dinilai menggunakan mikroskop cahaya dalam 5 lapang
pandang (kanan atas, kiri atas, kanan bawah, kiri bawah, dan tengah pada sediaan)
dengan perbesaran 400x. Penilaian histopatologi pankreas dilakukan oleh Dokter
spesialis Patologi Anatomi FK TRISAKTI. Sistem skoring nekrosis pankreas
adalah sebagai berikut:(4)
Skor 0 : tidak ada nekrosis sel pankreas

26

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 Skor 1 : ¼ total nekrosis pankreas
Skor 2 : ½ total nekrosis pankreas
Skor 3 : ¾ total nekrosis pankreas
Skor 4 : nekrosis seluruh pankreas
Selain pengamatan terhadap derajat nekrosis pankreas, pengamatan juga
dilakukan terhadap derajat insulitis pulau Langerhans. Satu buah pulau
Langerhans terbesar dengan potongan yang paling baik diamati dan dihitung
jumlah sel limfosit yang menginfiltrasi. Jumlah limfosit yang teramati pada
masing- masing kelompok kemudian diolah sebagai data penelitian. (39)

4.8 Analisis Data

Data hasil pengamatan histopatologi dikumpulkan dan dianalisis secara
statistik nonparametrik menggunakan uji Kruskal-Wallis dan dilanjutkan dengan
Mann-Whitney untuk mengetahui perbedaan pengaruh gambaran histopatologi
pankreas tikus putih antar kelompok pada masing-masing dosis yang diberikan.

27

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 4.9 Alur kerja penelitian

Tikus Sprague dawley jantan usia

2-3 bulan dengan berat 100-150 g
-7
Aklimatisasi
0
randomisasi K(-) K (+) P1 P2

Pakan tinggi protein 20 g/hari + air minum ad libitum

deksametason deksametason Deksametason

0,13mg/KgBB 0,13mg/Kg 0,13mg/KgBB
dan diberi secara /ekor/hari
suspensi subkutan dan secara
naCMC 1% diberi ekstrak subkutan dan
0,5 ml selama kulit bawang diberi ekstrak
14 hari merah 200 kulit bawang
mg/Kg BB merah 400
tikus secara mg/Kg BB
oral selama 14 tikus secara
hari oral selama 14
hari

14

15 Terminasi, nekropsi dan fiksasi pankreas dalam formalin

10%
16 Pengiriman sampel pankreas ke bagian PA FKUI

28

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 17 Pembuatan preparat histologi pankreas & pewarnaan HE

22 Penilaian preparat histologi pankreas

Analisis data
29
4.10 Etika penelitian Gambar 4.15Alur Kerja Penelitian
Penelitian ini telah diajukan ke Komisi Etik Penelitian Fakultas
Kedokteran Universitas Trisakti, dengan menerapkan prinsip 3R dalam
protokol penelitian, yaitu :
1. Replacement, adalah keperluan memanfaatkan hewan percobaan sudah
diperhitungkan secara seksama, baik dari pengalaman terdahulu maupun
literatur untuk menjawab pertanyaan penelitian dan tidak dapat digantikan
oleh makhluk hidup lain seperti sel atau biakan jaringan.
2. Reduction, adalah pemanfaatan hewan dalam penelitian seminimal
mungkin, tetapi tetap mendapatkan hasil yang optimal. Dalam penelitian ini
sampel dihitung berdasarkan rumus Federer yaitu (r-1)(t-1) ≥ 15, dengan r
adalah jumlah hewan yang diperlukan dan t adalah jumlah kelompok
perlakuan.
3. Refinement, adalah memperlakukan hewan percobaan secara manusiawi,
dengan prinsip dasar membebaskan hewan coba dalam beberapa kondisi,
yaitu:
a. bebas dari rasa lapar dan haus, pada penelitian ini hewan coba diberi
pakan standar dan minum secara ad libitum.
b. bebas dari ketidak-nyamanan, pada penelitian hewan coba ditempatkan
di animal house dengan suhu terjaga 20- 25⁰C. Animal house berada
jauh dari gangguan bising dan aktivitas manusia serta kandang dijaga
kebersihannya sehingga mengurangi stress pada hewan coba.
c. beban dari nyeri dan penyakit dengan menjalankan program kesehatan,
pencegahan, dan pemantauan, serta pengobatan terhadap hewan
percobaan jika diperlukan. Pemberian perlakuan menggunakan sonde

29

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati
 lambung dilakukan dengan mengurangi rasa nyeri seminimal mungkin,
dosis perlakuan diberikan berdasarkan pengalaman terdahulu maupun
literatur yang telah ada.
Prosedur pengambilan sampel pada akhir penelitian telah dijelaskan dengan
mempertimbangkan kenyamanan dan mengurangi rasa sakit pada hewan
dengan memberikan anesthesia serta euthanasia oleh orang yang terlatih untuk
meminimalisasi atau bahkan meniadakan penderitaan hewan coba sesuai
dengan Instutional Care and Use Committee (IACUC). (37)

30

Pengaruh ekstrak kulit bawang merah terhadap perubahan histopatologi pankreas tikus yang diberi deksametason
Fista Widawati