Nama : Dewi Gita Cahyani

Nim : 2111050153

Kelas : TLM 4B

Ringkasan Jurnal 1

1. Informasi Jurnal

Judul Jurnal : Kultur Virus dan Imunofluoresensi Untuk Deteksi SARS-CoV-2 Infektivitas Pada Sampel
Pernapasan Positif RT-PCR

Volume : Jurnal Virologi Klinis 152Tahun : 2022

Penulis : Carla Berengua, Marina Lopez , Montserrat Esteban, Pilar Marín, Paula Ramos, Margarita del
Cuerpo, Ignasi Gich, Ferran Navarro, Elisenda Miro, Núria Rabella

Penerbit : Institut Penelitian Biomedis Sant Pau (IIB Sant Pau), Barcelona. Spanyol

2. Latar belakang

Penelitian yang dituliskan pada jurnal ini berawal dari sindrom pernafasan akut parah
coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Sindrom pernafasan akut parah coronavirus 2 (SARS-CoV-2) adalah a virus
RNA yang diselimuti zoonosis, yang bertanggung jawab atas infeksi coronavirus disease 2019 (COVID-
19), yang muncul di Wuhan, Tiongkok, pada akhir 2019.

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) dalam sampel pernapasan adalah
yang paling sensitif dan paling sering digunakan metode untuk diagnosis COVID-19 dan tindakan
pencegahan pengendalian infeksi.

Nilai cycle threshold (Ct) yang didapatkan pada RT-PCR berbanding terbalik terkait dengan viral
load dan telah digunakan sebagai semi-kuantitatif penanda infektivitas dan untuk pengambilan
keputusan klinis. Namun, penggunaan nilai Ct untuk menyimpulkan penularan SARS-CoV-2 memiliki
banyak keterbatasan, karena mereka dapat dipengaruhi oleh banyak faktor, termasuk jenis sampel,
kecukupan pengambilan sampel, transportasi dan penyimpanan, atau berbagai platform untuk
ekstraksi dan amplifikasi RNA.

Kultur virus adalah standar emas untuk deteksi virus replikasi aktif dan penilaian potensi
menularnya. Karena teknik ini membutuhkan fasilitas biosafety level 3 laboratorium (BSL3), staf
berpengalaman dan waktu penyelesaian lebih lama dari RT-PCR.

3. Metode

Pengumpulan 100 sampel pernapasan yang berturut-turut positif SARS CoV-2, dikumpulkan
menggunakan platform kkomersia yang berbeda. Kemudian sampel disimpan pada suhu 4 ◦C sampai

Inokulasi. Sebelum inokulasi, setiap sampel diberi perlakuan awal dengan 10% campuran antibiotik
(vankomisin-gentamisin) dan amfoterisin B selama 30 menit. 300μL sampel pra-perawatan diinokulasi
dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama hingga 10 hari. Monolayer sel diperiksa setiap hari dengan
mikroskop perbesaran (x40). Kultur positif dicurigai bila sitopatik terbentuk CPE. Setiap CPE (jelas atau
diragukan) telah dikonfirmasi oleh immunofluorescence (IFI) tidak langsung menggunakan anti body
monoklonal spesifik AntiSARS-CoV-2 (CertTest-BIOTEC, Spanyol). Kultur dianggap negatif bila tidak ada
CPE 10 hari setelah inokulasi atau a CPE tidak dikonfirmasi oleh IFI.

4. Hasil

Sebanyak 100 RT-PCR berturut-turut positif pernapasan SARS-CoV-2. Persentase dari positif pada orang
<18 tahun adalah 60,9%, dan ≥18 tahun, 55,6%.

5. Pembahasan

Efek sitopatik SARS-CoV-2 pada sel VERO E6 mudah dikenali dan muncul relatif cepat. Dalam
kebanyakan kasus, syncytia kecil mulai diamati pada lapisan tunggal pada 48-72 jam pertama setelah
inokulasi. Seiring berlalunya hari, jumlah syncytia dan ukurannya meningkat, sampai seluruh lapisan
tunggal terpengaruh, dan sel-selnya hancur.

Salah satu keterbatasan utama dalam menarik kesimpulan dari publikasi studi tentang kultur
SARS-CoV-2 adalah kurangnya standarisasi dan variabilitas besar dalam protokol kultur [27], yang
membuatnya sulit untuk membandingkan hasil yang didapatkan. Saat mengoptimalkan kultur virus,
poin penting adalah menyimpan sampel dengan benar dan menyuntikkannya sesegera mungkin
setelah pengumpulan.

Sesuai dengan literatur, penelitian kali ini menunjukkan bahwa persentase yang tinggi dari
asimtomatik dan individu anak dengan SARS-CoV-2 RT-PCR positif adalah infektif, yang mungkin
memainkan peran penting dalam penyebaran virus.

6. Kesimpulan

Berdasarkan hasil, dapat disimpulkan bahwa dalam imunokompeten individu dengan COVID-
19 ringan-sedang, infektivitas SARS-CoV-2 tidak bertahan lebih dari 14 hari sejak timbulnya gejala.
Sebaliknya, pada pasien imunokompromis atau pasien dengan COVID-19 parah, infektivitas dapat
terjadi tetap di luar 14 hari, setelah itu nilai Ct dapat dipertimbangkan. Nilai Ct <22 selalu menunjukkan
infektivitas, tetapi ketika Ct nilai ≥22 tidak meyakinkan dan budaya direkomendasikan.

Ringkasan Jurnal 2

1. Imformasi Jurnal

Judul Jurnal : ELISA Ultrasensitif Untuk Menguji Antigen SARS-CoV-2 Tingkat Femtomolar Berdasarkan
Amplifikasi Sinyal Peptida dan Tyramine Spesifik

Volume : Sensor dan Aktuator B. Kimia 387 (2023) 133746

Penulis : Junchong Liu, Shuang Pang , Mingyang Wang , Haipeng Yu , Pengxin Ma , Tao Dong , Zongmei
Zheng , Yiming Jiao , Yaru Zhang , Aihua Liu

Penerbit : Institut Biologi Kimia & Biosensing, dan Kolese Ilmu Hayati, Universitas Qingdao, 308 Ningria
Road, Qingdao 266071, Tiongkok

2. Latar Belakang

SARS-CoV-2 termasuk dalam genus beta coronavirus dan terutama terdiri dari empat protein
struktural: protein spike (S) (SP), protein nukleokapsid (NP), protein amplop dan protein membran [5].
SP adalah protein membran trimerik yang terdiri dari subunit $1 dan subunit S2, yang memediasi
pengenalan inang dan fusi membran [6,7]. Protein S1 mengandung receptor binding domain (RBD) [8],
yang merupakan area fungsional interaksi antara SP dan membran sel inang untuk mengenali reseptor
permukaan sel inang untuk transmisi [9]. Sebagai protein transmembran virus yang melimpah, SARS-
CoV-2 SP memiliki urutan asam amino yang berbeda dari virus corona lainnya, yang memiliki
imunogenisitas dan spesifisitas yang tinggi dan dianggap sebagai antigen yang paling cocok untuk
deteksi langsung partikel virus [10,11].

Pengujian antigen adalah alat diagnostik penting untuk mendeteksi infeksi dan telah terbukti
membantu mengekang penyebaran SARS-CoV-2 [14]. Organisme Kesehatan Dunia merekomendasikan
deteksi antigen virus, yang bermanfaat untuk mengidentifikasi orang-orang yang paling mungkin
berisiko menyebarkan penyakit [15]. Sejauh ini banyak metode untuk pengujian antigen SP atau $1
telah dikembangkan, seperti enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [16,17], lateral flow
immunoassay (LFIA) [18], molecular-imprinted biosensor [19], elec- imunosensor trokimia [20,21] dan
immunoassay chemiluminescence (CLIA) [22). Namun, sensitivitas untuk sebagian besar metode tidak
memuaskan, meskipun metode tersebut didasarkan pada antibodi atau aptamer untuk mengenali
antigen. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengembangkan uji antigen ultrasensitif untuk
mendiagnosis infeksi virus SARS-CoV-2 (23). Metode dengan sensitivitas rendah sering mengarah ke
negatif palsu, sedangkan metode tradisional tidak lagi dapat memenuhi persyaratan sensitivitas tinggi.
Misalnya, ELISA adalah metode diagnostik antigen yang umum, namun demikian, ELISA mengalami
sensitivitas yang tidak memuaskan dibandingkan dengan metode lain.

Secara signifikan, ini adalah isu utama untuk mengintegrasikan amplifikasi sinyal yang kuat dan
elemen biorecognition dengan afinitas dan spesifisitas yang baik. Teknologi tampilan fag telah
digunakan sebagai salah satu metode paling umum untuk bioskrining ligan spesifik [24,25] untuk
biosensor. Sebagai contoh, kami baru-baru ini mengisolasi fag spesifik sebagai probe bifungsional
dengan pengenalan antigen dan amplifikasi sinyal untuk mengembangkan CLIA guna mendeteksi
rendah hingga 78 pg/mL. SARS-CoV-2S1(22). Rupanya, strategi ini masih dirasa kurang memuaskan
karena kepekaannya yang terbatas. Teknologi amplifikasi sinyal tyramine (TSA) adalah sejenis uji
enzimatik yang menggunakan horseradish peroxidase (HRP) untuk pelabelan in situ protein target
secara padat. Prinsip utama TSA adalah menggunakan reaksi peroksidase tyramine, di mana tyramine
terikat secara kovalen di bawah H2O2 yang dikatalisis oleh HRP, menghasilkan sejumlah besar produk
enzimatik yang berikatan dengan residu triptofan, tirosin, dan histidin dari protein.

Dalam karya ini, kami menyaring ekspresi monoklonal fag baru dari peptida WNLDLSQWLPPM
dengan tampilan fag, yang diidentifikasi dengan uji spesifisitas dan uji afinitas serta analisis epitop
antigenik dengan docking molekuler. Kemudian dengan menggabungkan peptida spesifik sebagai
probe pengenalan antigen dan amplifikasi sinyal berbasis tyramine, uji ultrasensitif peptida-ELISA (p-
ELISA) dieksplorasi, yang mampu mendeteksi rendah hingga 0,4 pg/ml (28 (M) untuk SARS-CoV 2 SP
antigen melalui mode ISA sekunder, di mana sensitivitas ditingkatkan 100 kali lipat dibandingkan
dengan mode langsung (40 pg/mL).Selanjutnya, metode yang diusulkan dapat mendeteksi
pseudovirus SARS-CoV-2 hingga 3 TCID. Metode ini bersifat universal dan dapat diterapkan secara
modular ke platform ELISA sensitif lainnya.

3. Metode

3.1 Docking molekul

Interaksi antara peptida Pn dan protein SARS-CoV-2 S disimpulkan dengan docking molekuler. Struktur
tiga dimensi (3D) protein S tersedia di bank data protein (PDB:7FG7) [38]. Peptida dibangun dan
dioptimalkan lebih lanjut dengan medan gaya OPLS3, yang juga digunakan untuk mengoptimalkan
protein SARS-CoV-2 S.

3.2 Termoforesis skala mikro (MST) menganalisis afinitas

SARS-CoV-2 SP dengan pengenceran serial dan pelabelan peptida Pn 5-carboxy fluorescein (FAM) (Pn-
FAM) diencerkan dengan PBS (pH 7,4). Setara volume larutan Pn-FAM dengan konsentrasi konstan
dicampur dengan SARS-CoV-2 SP dengan konsentrasi bervariasi dan diinkubasi selama 30 menit
terlindung dari cahaya. Campuran di atas secara terpisah ditambahkan ke kapiler premium dan
selanjutnya dilakukan analisis MST, yang dilakukan dengan metode yang dilaporkan (39-41)
menggunakan Monolith NT 115 (NanoTemper Technologies, Jerman). Pengukuran termoforesis
dilakukan pada daya eksitasi 20% dan daya MST 40%.

3.3 Pembentukan ELISA berbasis peptida (p-ELISA) yang menguji antigen SARS CoV-2 SP

Singkatnya, peptida Pn difiksasi semalaman pada suhu 4°C pada pelat mikrotiter, yang kemudian dicuci
3 kali dengan PBST 0,05% dan diblok dengan 2% bovine serum albumin (BSA) selama 2 jam. Setelah
dicuci. Antigen SP SARS-CoV-2 diinkubasi dengan pengocokan pada suhu kamar (RT), yang
ditambahkan antibodi monoklonal (mAb) anti-SARS-CoV-2 RBD. Setelah itu. IgG-conjugated
horseradish peroxidase (HRP) (IgG-HRP) mAb ditambahkan dan diinkubasi dengan pengocokan pada
RT selama 1,5 jam Larutan pengembangan warna ditambahkan ke sumur. Akhirnya, 50 pl. dari 2 M
H50, ditambahkan untuk mengganggu reaksi pengembangan warna, dan kerapatan optik pada 452 nm
(OD) diukur dengan pembaca pelat mikro.

3.4 Percobaan p-ELISA dengan Metode TSA

Konsentrasi biotin-tyramine, waktu reaksi tyramine-biotin dan pengenceran SA-HRP dioptimalkan.

Kondisi optimal yang diperoleh digunakan untuk mendeteksi berbagai konsentrasi antigen SARS-CoV-
2 S Waktu reaksi biotin-tyramine untuk TSA sekunder adalah 10 menit.

3.5 Deteksi pseudovirus SARS-CoV-2 dengan simulasi sampel nyata

Pseudovirus SARS-CoV-2 pertama kali dinonaktifkan (65 C, 30 menit) dalam lemari biosafety Kemudian
pseudovirus yang tidak aktif ditambahkan ke sampel swab hidung yang sehat.

4. Hasil dan Pembahasan

4.1 Skrining dan identifikasi fag yang terikat pada SARS-CoV-2 SP

Pustaka tampilan fag pil 12-peptida digunakan untuk biopan klon fag yang berikatan dengan SARS-CoV-
2 SP (Skema 51 dan bagian eksperimental tambahan). Sejak putaran ke-2, tingkat pengembalian fag
meningkat dengan putaran biopanning, menunjukkan pengayaan efektif fag yang terikat ke SARS-CoV
2 SP. Kemudian 30 monoklonal fag dipilih secara acak dan diamplifikasi untuk mengekstraksi DNA
untuk diurutkan, dari mana diperoleh enam urutan peptida dan pep tide P1 dengan urutan
WNLDLSQWLPPM muncul paling sering (16/30) (label 5). Kemampuan pengikatan enam fag ke SARS-
CoV-2 SP diperiksa dengan uji fag ELISA Dibandingkan dengan fag lain, fag P1 memiliki nilai absorbansi
yang lebih tinggi dan secara signifikan lebih tinggi daripada kontrol g 1), menunjukkan bahwa fag P1
terikat pada (M). SARS-CoV 2 SP dengan afinitas yang baik. Pengikatan fag P1 ke berbagai antigen
(masing-masing 2 µg/ml) telah ditetapkan () Nilai OD untuk SARS-CoV-2 SP jauh lebih tinggi daripada
MERS-CoV SP dan SARS-CoV 2 SP. Artinya, disana tidak ada reaktivitas silang antara P1-phage dan
protein S virus corona lainnya serta beberapa penanda tumor dan antibodi yang dipilih secara acak.
Lebih menarik lagi, nilai ODean untuk SARS-CoV-2 52 sedikit kurang dari nilai untuk SARS-CoV-2 SP,
tetapi jauh lebih tinggi daripada untuk SARS-CoV 251, menunjukkan fag P1 mengikat secara besar-
besaran ke 52 subunit Di sisi lain Di sisi lain, sinyal untuk SARS-CoV 281 jelas masih lebih tinggi daripada
nilai antigen lain, menunjukkan bahwa P1 juga dapat berikatan dengan SARS-CoV-2 S1 secara longgar.
Sementara PI tidak bereaksi silang dengan SP dari coronavirus lain, dan tidak terikat pada penanda
tumor dan antibodi yang dipilih secara acak, menunjukkan bahwa peptida P1 yang menampilkan fag
memiliki spesifisitas tinggi.

4.2 Docking Molekul

Hasil docking output yang optimal didapatkan hasil residu asam amino (Gin7, Trp8, Leu9, Pro10, Pro11,
Met12) dari peptida berikatan dengan subunit S2, sedangkan fraksi asam amino (Trp1, Asn2) berikatan
dengan subunit S1 dengan ikatan hidrogen, Ikatan hidrogen ganda terbentuk antara residu asam amino
peptida dan protein S Secara khusus, Gln7 membentuk dua ikatan hidrogen dengan Arg1039 dan
Asp1041, Trp8 membentuk satu ikatan hidrogen dengan Asp1041, sementara Met12 membentuk dua
ikatan hidrogen dengan Lys1045 untuk menghasilkan kompleks (Gbr. S2), menunjukkan bahwa Gln7,
Trp8, Met12 adalah kemungkinan asam amino kunci.

4.5 Analisis afinitas oleh MST

Pelabelan neon FAM Pn peptida (Pn-FAM) disintesis untuk pengukuran MST. MST memverifikasi
pengikatan langsung antara peptida Pn dan SARS-CoV-2 SP.

4.6 Penetapan kamera dan optimasi kondisi uji p-ELISA secara langsung

Dalam penelitian ini, peptida Pn digunakan sebagai probe penangkap, antibodi (anti-SARS-CoV-2 RBD
mAb) yang terikat pada domain RBD dari subunit $1 dipilih sebagai antibodi pendeteksi, di mana
"peptida-antigen- sandwich antibodi p-ELISA dibuat untuk mendeteksi antigen SP SARS-CoV-2 (ne 1).
Antibodi pendeteksi adalah parameter kunci dalam ELISA. Nilai OD452 nm dari kelompok positif
dengan antigen SARS-CoV-2 S dan kelompok negatif tanpa antigen SARS-CoV-2 S dicatat secara terpisah
untuk menghitung rasio positif-ke-negatif (P/N). Rasio P/N tertinggi diamati pada 0,2 µg/ml. anti-SARS-
CoV-2 RBD mAb (Gambar 4D). Menariknya, meskipun sinyal kelompok positif meningkat dengan dosis
mAb anti-SARS-CoV-2 RBD, nilai P/N menurun, yang mungkin disebabkan oleh peningkatan nilai latar
belakang yang disebabkan oleh antibodi. Selain itu, sinyal mencapai rasio pengenceran mAb anti-IgG-
HRP optimum sebesar 1:20000.

4.7 Optimalisasi uji p-ELISA dengan TSA

Untuk meningkatkan sensitivitas uji pept de ELISA, kami selanjutnya memperkenalkan teknik TSA ke p
ELISA. Ketika biotinylated tyramine dikatalisis oleh HRP dan disimpan pada sinyal situs untuk diperkuat,
SA-HRP ditambahkan untuk mengambil keuntungan dari afinitas tinggi antara streptavidin dan biotin,
sehingga memperkenalkan lebih banyak HEP ke dalam sumur pelat mikro positif tempat sampel diuji.
dan menghasilkan reaksi warna yang lebih kuat dengan chromogenic 1.3.5.5 tetramethylbenzidine.

4.8 Uji antigen SARS-CoV-2 SP berbasis p-ELISA dengan mode langsung atau dengan mode TSA

Berdasarkan kondisi optimal, respon dari tiga mode deteksi p-ELISA sebagai fungsi konsentrasi standar
antigen SP yang berbeda diuji (Gbr.S3). Berdasarkan Gambar S3, titik data dengan hubungan linier
dipilih untuk menggambar kurva kalibrasi, masing-masing (Gbr. 6). Dalam mode langsung, nilai
AOD452 nm (perbedaan OD452 am antara kelompok positif dan kelompok kosong negatif) meningkat
dengan meningkatnya konsentrasi antigen (Gbr. 6A), dari mana nilai AOD452 nm linier antara 40-10000
pg/mL SARS- CoV-2SP. Dalam mode TSA, untuk TSA pertama, dibuat kurva kalibrasi (Gbr. 6B) dengan
kisaran linier 2-400 pg/ml. Dalam mode TSA sekunder, kisaran linier dari pengujian adalah 0,4-10
pg/mL (C), Dari Gambar 50, batas deteksi yang lebih rendah (LOD) yang sebenarnya ditentukan
menjadi 40 pg/ml. (280 fM), 2 pg/ml. (14 fM) dan 0,4 pg/ml. (2,8 fM) untuk mode langsung, mode TSA
pertama dan mode TSA sekunder, secara terpisah. Ternyata, deteksi dengan mode TSA lebih sensitif
dibanding mode deteksi langsung. Streptavidin memiliki afinitas yang sangat tinggi untuk mengikat
biotin secara spesifik. Setiap streptavidin dapat mengikat empat biotin, dan reaksi spesifik antara biotin
dan SA-HRP qan mengurangi hambatan situs spasial dari reaksi dan membuat alasannya menguat
secara signifikan. Setelah amplifikasi sinyal pertama, sejumlah besar HRP dan streptavidin baru terikat,
dan residu asam amino aromatik pada protein ini dapat menyediakan tempat pengikatan untuk
tyramine terbiotinilasi untuk mengikat kembali. Di dalam mengumpulkan kinerja deteksi berbagai
metode untuk antigen SARS-CoV-2 S. LOD dilaporkan untuk biosensor elektrokimia berbasis aptamer
(66 pg/ml.) [43], biosensor tercetak molekuler (100 pg/mL) [19), hamburan Raman resonansi yang
ditingkatkan permukaan (10 pg/ml) [44), ELISA berbasis nanobody (0,147 ng/mL) [16], dan LFIA (0,1
ng/mL) [45). Jelas p-ELISA secara signifikan lebih unggul dari sebagian besar metode yang dilaporkan
sejauh ini. P-ELISA dengan model TSA sekunder juga menegaskan bahwa HRP dan streptavidin yang
baru terikat ini dapat menyediakan tempat pengikatan untuk pengikatan tyramine terbiotinilasi
putaran berikutnya. Sebenarnya, TSA ke-3, ke-4, ke-5 pun bisa dilakukan juga. Jadi, setelah beberapa
putaran amplifikasi siklik seperti itu, sejumlah besar molekul HRP dapat diikat, menghasilkan sinyal
yang diperkuat secara geometris atau bahkan diperkuat secara nirkabel untuk pendeteksiannya, dan
untuk sensitivitas pendeteksian.

4.9 Uji sensitivitas p-ELISA untuk pseudovirus SARS-CoV-2

Biasanya, pseudovirus SARS-CoV-2 dirakit oleh human immunodeficiency virus tipe 1. Permukaan
pseudovirus menyerupai SARS-CoV-2, yang dapat memasuki sel manusia tetapi tidak dapat mereplikasi
dirinya sendiri, memungkinkan untuk digunakan sebagai model virus. Kami menonaktifkan
pseudovirus dan kemudian mengumpulkan sub leachate hidung dari individu sehat untuk
pengenceran yang berbeda. Pseudovirus kemudian diuji pada substrat hidung menggunakan p-ELISA
dengan mode langsung atau mode TSA Pseu dovirus turun hingga 60 TCID/ml. dapat dideteksi dengan
mode langsung (A), meskipun komponen lain dalam sampel hidung mengganggu identifikasi analit.
Menariknya, LOD dengan TSA pertama serendah 10 TCID/mL (B), yang merupakan 6 kali lipat
peningkatan sensitivitas dibandingkan dengan mode langsung. Setelah TSA ke-2, serendah 3 TCID/ml,
pseudovirus dapat dideteksi (Gbr. 7C), menunjukkan peningkatan sensitivitas 20 kali lipat dibandingkan
dengan mode langsung. Meskipun dalam hal efek peningkatan sensitivitas, deteksi pseudovirus lebih
lemah daripada antigen SARS-CoV-2 5, yang mungkin disebabkan oleh fakta bahwa pseudovirus
dipalsukan dengan subsampel hidung manusia yang sehat.

5. Kesimpulan

Singkatnya, monoklonal fag yang mengekspresikan pertide dengan urutan WNLDLSQWLPPM khusus
untuk SARS-CoV-2 SP diperoleh melalui empat putaran penyaringan tampilan fag. Selanjutnya, a p
ELISA dibuat berdasarkan peptida dan TSA terpilih yang memiliki sensitivitas yang sangat baik dan
fleksibilitas yang tinggi. LODS untuk antigen SARS Cuv 25 adalah 40,2, 0,4 pg/mL untuk p-ELISA dengan
mode langsung. Apakah TSA, mode TSA ke-2, masing-masing. LOD untuk pseuduvirus dalam na mula
adalah 60, 10, dan 3 TCL untuk p-ELISA dengan mode langsung, 1 TSA dan mode TSA ke-2, terpisah.
Oleh karena itu, pekerjaan ini akan memberikan metode inespende dan ultrasse baru untuk diagnosis
cepat SARS-CoV-2.