BAB III

METODOLOGI
1.1 Alat dan Bahan
A. KULTIVASI DAN ISOLASI FUNGI DARI JARINGAN TUMBUHAN
Alat : Bahan :
1. Waterbath 1. Medium PDA
2. Cawan Petri 2. Aquades seril
3. Lampu spiritus 3. Alkohol 70%
4. Entcase 4. Tisu
5. Scalpel 5. Jaringan Tanaman yang busuk
6. Pinset
7. Kertas saring steril
8. Ruang inkubasi
Cara Kerja :
1. Permukaan bagian tanaman yang menunjukkan adanya asosiasi dengan mikroorganisme
dibersihkan dari kotoran-kotoran yang menempel, kemudian diseka dengan kapas
beralkohol.
2. Bagian tanaman dipotong-potong sebesar 0.5 cm3 dengan skalpel steril pada batas bagian
yang berasosiasi.
3. Siapkan cawan petri steril, kemudian isi dengan dengan medium kultur (PDA,NA)
sebanyak 12,5 mL.
4. Setelah medium memadat, potongan jaringan dimasukan ke dalam cawan petri yang
berisi medium, kemudian inkubasikan selama 72 jam.
5. Setelah 72 jam, koloni yang tumbuh pada potongan jaringan dipindah ke medium baru
kemudian diinkubasikan lagi selama 72 jam
6. Setelah 72 jam berikutnya diamati kemurnian koloni, kenampakan koloni, bentuk koloni,
warna koloni, ukuran koloni, morfologi mikroskopisnya dan digambar skematis.

B. ISOLASI DAN KULTIVASI BAKTERI DARI TANAH

Alat : Bahan :
1. Waterbath 1. Medium NA
2. Cawan petri 2. NaCl 50%
3. Gelas ukur 3. Na2CO3 10%
4. Gelas Erlenmeyer 4. Asam asetat 1%
5. Tabung reaksi 5. Alkohol
6. Batang pengaduk 6. Aquades
7. Lampu spiritus 7. Tanah
8. Entcase
9. Stopwatch
10. Timbangan
11. Ruang inkubasi
Cara Kerja :
1. medium NA dipanaskan di dalam waterbath sampai mencair.
2. Contoh tanah ditimbang seberat 10 gr pada gelas arloji atau aluminium foil,kemudian
dimasukkan ke dalam gelas erlemeyer 200 ml steril.
3. Tanah ditambah air steril sampai menjadi 100 mL dan dikocok sampai homogen,
sehingga diperoleh suspensi tanah berkonsentrasi 10-1.
4. Siapkan 5 tabung reaksi steril masing-masing diisi 9 mL aquades steril. Kemudian
suspensi 10-1 dipipet sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi 1
yang telah berisi 9 mL air steril kemudian dikocok sampai homogen, untuk mendapatkan
pengenceran 10-2.
5. Hal yang sama dilakukan pada tabung 2, 3, 4, dan 5 untuk mendapatkan pengenceran 10-
2,
10-4, 10-5, dan 10-6.
6. Tiga cawan petri steril masing-masing dituangi 100 µL 50% dan 50 µL Na 2CO 310%
untuk menghambat fungi tanah.
7. Ketiga cawan petri yang sudah diisi NaCl dan Na2CO3 dituangi medium NA yang
sedang mencair, masing-masing sebanyak 10 ml. langkah ini dilakukan diatas nyala
lampu spritus, di dalam entcase atau laminer air flow.
8. Setelah medium membeku, masing-masing medium dalam cawan petri ditetesi 100 µL
suspensi tanah dari pengenceran yang berbeda-beda, yaitu 10-1, 10-3, dan 10-6, kemudian
diratakan dengan menggunakan tabung gelas bentuk L. Langkah ini juga dilakukan
diatas nyala lampu spritus, di dalam entcase atau laminar air flow.
9. Cawan-cawan petri diberi label tanah-bakteri (TB10 -1, TB-3, dan TB-6) Kemudian
diinkubasikan dalam suhu kamar dalam keadaan tertutup dan terbungkus.
10. Setelah 2-3 hari, hasil dari ke tiga pengenceran tersebut dibandingkan dari segi jumlah
dan variasi mikroorganisme yang tumbuh.
11. Setelah diamati, dipilih satu atau beberapa koloni yang terpisah untuk dimurnikan
(dipindah) kemedium kultur baru.
12. Diinkubasikan lagi selama 2-3 hari, kemudian diamati kenampakan koloni, bentuk
koloni, warna koloni, karakter mikroskopis dan gambar skematis.
13. Setelah melakukan pengamatan, beri kesimpulan atas kemurnian biakan yang diperoleh.