Machine Translated by Google

Pengaruh Metode Ekstraksi DNA dan Pengambilan Sampel

Teknik Struktur Tampak Sapi dan Domba
Komunitas Mikroba Rumen
Gemma Henderson1*, Faith , Sandra Kittelmann1, Vahideh Heidarian Miri1, Michael Zethof1,
Peter H.Janssen1
Cox1 Samantha J.Noel1,2 , Garry C. Waghorn3 ,
1 AgResearch Ltd, Palmerston North, Selandia Baru, 2 Massey University, Palmerston North, Selandia Baru, 3 DairyNZ, Hamilton, Selandia Baru

Abstrak

Teknik ekologi mikroba molekuler banyak digunakan untuk mempelajari komposisi mikrobiota rumen dan untuk
meningkatkan pemahaman tentang peran yang dimainkannya. Oleh karena itu, metode pengambilan sampel dan ekstraksi
DNA yang menghasilkan DNA mikroba yang memadai dan juga mewakili komunitas mikroba secara akurat sangatlah
penting. Lima belas metode berbeda digunakan untuk mengekstraksi DNA dari sampel rumen sapi dan domba. Hasil dan
kualitas DNA, serta kesesuaiannya untuk amplifikasi PCR hilir sangat bervariasi, bergantung pada metode ekstraksi DNA yang digunakan.
Ekstrak DNA dari sembilan metode ekstraksi yang lolos kriteria kualitas pertama ini dievaluasi lebih lanjut dengan
enumerasi PCR kuantitatif dari lokus penanda mikroba. Jumlah mikroba absolut, yang ditentukan pada sampel rumen
yang sama, berbeda lebih dari 100 kali lipat, bergantung pada metode ekstraksi DNA yang digunakan. Komposisi komunitas
archaeal, bakteri, protozoa ciliate, dan jamur yang terlihat dalam sampel rumen yang identik dinilai menggunakan 454
Titanium pyrosequencing. Perbedaan signifikan dalam komposisi komunitas mikroba diamati antara metode ekstraksi,
misalnya pada kelimpahan relatif anggota filum Bacteroidetes dan Firmicutes.
Komunitas mikroba dalam sampel paralel yang dikumpulkan dari sapi melalui pipa perut oral atau melalui fistula rumen,
dan dalam fraksi pencernaan rumen cair dan padat, dibandingkan menggunakan salah satu metode ekstraksi DNA.
Representasi komunitas secara umum serupa, terlepas dari teknik pengambilan sampel rumen yang digunakan, namun
terdapat perbedaan signifikan dalam kelimpahan beberapa taksa mikroba seperti clade Clostridiales dan Methanobrevibacter
ruminantium . Komposisi komunitas mikroba yang tampak berbeda antara fraksi sampel rumen, dan Prevotellaceae paling
banyak terdapat pada fraksi cair. Metode ekstraksi DNA yang melibatkan ekstraksi fenol-kloroform dan langkah lisis
mekanis cenderung lebih sebanding. Namun, perbandingan data dari penelitian yang menggunakan teknik pengambilan
sampel berbeda, fraksi sampel rumen berbeda, atau metode ekstraksi DNA berbeda harus dihindari.

Kutipan: Henderson G, Cox F, Kittelmann S, Miri VH, Zethof M, dkk. (2013) Pengaruh Metode Ekstraksi DNA dan Teknik Pengambilan Sampel Terhadap Struktur Tampak Komunitas
Mikroba Rumen Sapi dan Domba. PLoS SATU 8(9): e74787. doi:10.1371/journal.pone.0074787

Editor: Stefan Bertilsson, Universitas Uppsala, Swedia

Diterima 13 Maret 2013; Diterima 6 Agustus 2013; Diterbitkan 11 September 2013 Hak Cipta: ©

2013 Henderson dkk. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan
reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan penulis dan sumber asli dicantumkan.

Pendanaan: Pekerjaan di AgResearch dilaksanakan berdasarkan kontrak dengan Konsorsium Penelitian Gas Rumah Kaca Pastoral (PGgRc; www.pggrc.co.nz). Penyandang
dana tidak mempunyai peran dalam desain penelitian, pengumpulan dan analisis data, atau persiapan naskah. Penulis memerlukan persetujuan PGgRc untuk menerbitkannya.

Kepentingan yang bersaing: Tujuh penulis berasal dari AgResearch Ltd., yang merupakan Crown Research Institute, dan didanai oleh Pastoral Greenhouse Gas Research
Consortium (PGgRc) untuk mengembangkan cara mengurangi emisi metana ruminansia. Anggota PGgRc adalah AgResearch, Fonterra, Fert Research, PGG Wrightson,
DairyNZ, Deer Research, Beef+Lamb New Zealand, Landcorp, NIWA, Kementerian Industri Primer, dan Kementerian Sains dan Inovasi (sebelumnya Yayasan Riset, Sains dan
Teknologi ). Publikasi data yang dilaporkan di sini merupakan kebijaksanaan PGgRc. PGgRc tidak mengontrol data mana yang disajikan atau bagaimana data tersebut
diinterpretasikan dalam makalah ini. Hal ini tidak mengubah kepatuhan penulis terhadap semua kebijakan PLOS ONE dalam berbagi data dan materi. Penulis lain telah
menyatakan bahwa tidak ada persaingan kepentingan. Tidak ada paten, produk dalam pengembangan, atau produk yang dipasarkan untuk diumumkan.

*
Email: gemma.henderson@agresearch.co.nz

Perkenalan awalnya ditempatkan di rumen. Di sana, mikroba memainkan peran

Hewan ruminansia seperti sapi, domba, rusa, yak, kerbau dan
kambing sangat penting untuk produksi daging dan produk susu, wol,
dan kulit. Secara global, hewan ruminansia dipelihara dalam sistem dan
lingkungan peternakan yang beragam, serta diberi makanan yang
bervariasi. Hewan ruminansia memiliki sistem pencernaan yang
kompleks, dan pencernaan pakannya memakan waktu
penting dalam pemecahan komponen pakan seperti serat, menghasilkan
asam lemak rantai pendek yang menyediakan energi bagi inangnya.
Oleh karena itu, mikroba rumen merupakan penyedia energi dan nutrisi
hewan yang penting, dan memainkan peran penting dalam produktivitas
dan kesehatan hewan ruminansia. Rumen archaea menghasilkan gas
rumah kaca metana sebagai produk akhir metabolisme. Gas metana ini
dikeluarkan oleh hewan ruminansia dan mewakili 2 hingga 12% makanan kotor

PLOS SATU | www.plosone.org 1 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google
energi yang hilang pada hewan [1]. Pemahaman fungsi dan komposisi
komunitas mikroba rumen diperlukan untuk meningkatkan produktivitas
hewan dan mengurangi jumlah energi yang hilang sebagai metana.
Komunitas mikroba rumen sangat kompleks. Ada sekitar 1011 sel
mikroba per gram isi rumen dan sel-sel ini termasuk dalam berbagai spesies
dan genera bakteri, archaea [2], jamur, protozoa ciliata [3] dan virus [4].
Sampai saat ini, hanya sedikit yang berhasil dikultur dan dikarakterisasi.
Analisis molekuler terhadap komunitas mikroba rumen memungkinkan
mikroba yang belum dibudidayakan untuk dideteksi, dan telah menjadi alat
penting untuk menentukan perubahan yang terjadi
dalam komunitas mikroba, misalnya, selama perubahan pola makan.
Perkembangan teknik pengurutan throughput tinggi telah membuat analisis
mikroba terperinci dari uji coba skala besar menjadi layak dilakukan,
memungkinkan efek halus pada komposisi komunitas mikroba untuk
dideteksi sebagai perubahan jumlah absolut dan relatif dari lokus penanda
mikroba.
DNA dengan hasil dan kualitas yang memadai merupakan bahan awal
yang penting untuk analisis ini. Penghuni mikroba dalam rumen sangat
beragam dan tidak semua metode ekstraksi DNA bekerja dengan baik untuk
kelompok mikroba yang berbeda. Hingga saat ini, beberapa penelitian
menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang digunakan telah berhasil
berdampak pada representasi komunitas mikroba dalam sampel dari habitat
yang berbeda [5-9], termasuk rumen [10].
Teknik pengambilan sampel (misalnya selang lambung oral dan
pengumpulan melalui fistula rumen) dan fraksinasi sampel rumen (misalnya
cair dan padat) juga dapat berdampak pada parameter komunitas mikroba
[3,11-13].
Untuk memungkinkan perbandingan langsung data struktur komunitas
rumen dari penelitian yang dilakukan di laboratorium berbeda
dan di seluruh dunia, pengambilan sampel rumen, fraksinasi sampel, dan
metode ekstraksi DNA harus distandarisasi, atau setidaknya terbukti
memberikan hasil serupa. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk secara
sistematis membandingkan berbagai metode ekstraksi DNA yang berbeda
dan dampaknya terhadap analisis hilir komunitas mikroba rumen
menggunakan metode ekologi molekuler. Untuk melakukan hal ini, kualitas
dan kuantitas DNA yang diperoleh dengan metode yang berbeda
dibandingkan, seperti halnya kelimpahan bakteri, archaeal, protozoa ciliate
dan jamur serta komposisi komunitas berdasarkan lokus penanda mikroba.
Selain itu, pengaruh terhadap komposisi komunitas mikroba dari pengambilan
sampel rumen melalui fistula atau menggunakan tabung lambung oral dan
pengaruh fraksinasi sampel diselidiki. Tujuan keseluruhannya adalah untuk
menemukan metode yang sebanding dan sederhana yang 1) menghasilkan
DNA berkualitas tinggi untuk sebagian besar kelompok mikroba, 2) cocok
untuk analisis ekologi mikroba molekuler yang berbeda, 3) cocok untuk
digunakan dalam studi kohort besar, dan 4) mudah ditransfer ke peneliti lain.
Bahan dan metode
Pernyataan etika
Penggunaan hewan, termasuk kesejahteraan, peternakan, prosedur
eksperimental, dan pengumpulan sampel rumen yang digunakan untuk
penelitian ini, telah disetujui oleh AgResearch
Padang Rumput (Palmerston North, Selandia Baru) dan AgResearch
PLOS SATU | www.plosone.org
Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen
Komite Etika Hewan Ruakura (Hamilton, Selandia Baru), dan mematuhi
Kode Etik Perilaku Institusional untuk Penggunaan Hewan dalam Penelitian,
Pengujian dan Pengajaran, sebagaimana ditentukan dalam Undang-Undang
Kesejahteraan Hewan tahun 1999 dan amandemennya (Selandia Baru).
Sampel rumen dikumpulkan sebagai bagian dari serangkaian uji coba yang
dilakukan di Selandia Baru dengan nomor izin 12002, 12174 dan 12391
(AgResearch, Grasslands Research Centre, Palmerston North), dan 11897
(AgResearch, Ruakura Research Centre, Hamilton). Hewan-hewan tersebut
dipelihara di Pusat Penelitian Grasslands AgResearch dan di peternakan
Lye, Hamilton. Sampel rumen dikumpulkan sesuai dengan protokol yang
disetujui dalam persetujuan Etika Hewan yang relevan dengan pengambilan
sampel melalui fistula atau melalui selang lambung.
Perbandingan metode ekstraksi DNA
Isi rumen dikumpulkan pada bulan September 2009 dari sapi persilangan
Friesian-Jersey yang berfistulasi rumen (Bos taurus, pengenal hewan
AgResearch 723) dan cuaca Romney (Ovis aries, pengenal hewan 5472).
Sapi yang sebelumnya diberi makan di padang rumput diberi makan 6 kg
jerami padang rumput/padang rumput per hari selama satu minggu sebelum
pengambilan sampel dan memiliki akses bebas terhadap air setiap saat.
Cuaca dipertahankan dengan pola makan padang rumput yang sebagian
besar terdiri dari ryegrass (Lolium perenne). Makanan dirahasiakan dari
hewan selama dua jam sebelum pengambilan sampel. Sampel rumen
(sekitar 50 g) ditimbang secara akurat, dibekukan pada suhu ÿ85°C dalam
waktu 30 menit setelah pengambilan sampel, dan dikeringkan dalam beku.
Setiap seluruh sampel beku-kering dihomogenisasi dengan penggiling kopi
rumah tangga 100 W (Russell Hobbs, Mordialloc, Victoria, Australia) dan
disimpan dalam kantong kedap udara pada suhu ÿ85°C.
Secara total, 15 protokol ekstraksi DNA dibandingkan (Tabel 1). Metode
yang dipilih digunakan untuk mengekstraksi DNA dari sampel rumen dan
feses di laboratorium kami dan laboratorium lainnya. Kecuali dinyatakan
lain, semua metode dilakukan sebagaimana diuraikan dalam instruksi yang
diberikan oleh penulis dan produsen.
Setiap metode ekstraksi DNA dilakukan dalam rangkap tiga, masing-masing
dengan 25 sampai 30 mg (ditimbang secara akurat) dari setiap sampel
rumen beku-kering, kecuali dinyatakan sebaliknya. Ekstrak DNA disalurkan
ke dalam alikuot sekali pakai berukuran 10 hingga 20 ÿl, dan dibekukan
pada suhu -20 C, untuk menghindari pencairan berulang DNA sebelum
analisis hilir.
Perbandingan waktu pemukulan manik
DNA diekstraksi dalam rangkap dua dari empat sampel rumen yang
dikumpulkan dari sapi 723 dan domba 5472 [detail di atas], dan domba
persilangan Romney yang diberi makan sekam lucerne (Medicago sativa)
(pengidentifikasi hewan 322 dan 325) menggunakan metode PCQI. Langkah
pemukulan manik dilakukan selama 1, 2, 3, 4 atau 5 menit dalam Mini-
Beadbeater-96 (Biospec Products, Bartlesville, OK, USA) atau selama 45
detik pada 6,5 m s-1 dalam FastPrep FP120 ( MP Biomedis, Santa Ana,
CA, AS).
Perbandingan metode pengambilan sampel rumen
Sampel rumen dikumpulkan dari 14 ekor sapi perah yang diberi makan
padang rumput dominan ryegrass segar dengan pengambilan sampel
menggunakan selang perut oral atau melalui fistula rumen (lihat [14] untuk
rincian lebih lanjut tentang hewan tersebut). Untuk pengambilan sampel
dengan selang lambung oral, pipa baja tahan karat (diameter luar 25 mm, tebal dinding
2 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787
Machine Translated by Google

Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen

Tabel 1. Metode ekstraksi DNA yang digunakan dalam penelitian ini.

Nama Singkatan Komentar Referensi atau pabrikan

18 unit proteinase K (New England Biolabs Inc, Ipswich, MA,

Metode berbasis CTAB CTAB USA) dalam volume 30 ÿl dan larutan CTAB 80 ÿl digunakan per [32]

Sampel

Q·BIOgene, MP Biomedis
FastDNA® Spin Kit dengan buffer TC FDTB Mengikuti instruksi pabrik
LLC, Solon, OH, AS

FastDNA® Spin Kit dengan buffer Y FDYF Mengikuti instruksi pabrik Q·BIOgen
Matriks InstaGene™ MENYUKAI Mengikuti instruksi pabrik Bio-Rad, Hercules, CA, AS

Metode berbasis NucleoSpin® NUSP [33]

Fenol-kloroform dengan pemukulan manik I PCBB [34]

Fenol-kloroform, pemukulan manik, dengan alat filtrasi untuk Sedangkan untuk PCBB, DNA disaring dengan kit pemurnian QIAquick® PCR;
PCFI [18]
pemurnian I QIAgen, Hilden, Jerman

Fenol-kloroform tanpa pemukulan manik PCNB Adapun PCBB, tetapi langkah pemukulan manik dihilangkan Tidak diterbitkan

Fenol-kloroform, pemukulan manik, dengan alat filtrasi untuk PCBB yang dimodifikasi, buffer digunakan seperti yang dijelaskan, DNA disaring
PCQI [14]
pemurnian II Kit pemurnian PCR QIAquick®

Sedangkan untuk PCBB, namun fenol-kloroform ditambahkan terlebih dahulu dan digunakan dalam bead
Fenol-kloroform dengan pemukulan manik II PCSA
langkah pemukulan

PSP®Spin Stool DNA Kit, protokol 1 PSP1 Mengikuti protokol pabrikan 1 Invitek GmbH, Berlin, Jerman

Kit DNA PSP®Spin Stool, protokol 1 PSP2 Mengikuti protokol pabrikan 2 Undangan GmbH

Mengikuti protokol pabrikan untuk isolasi DNA dari tinja

Kit Mini Bangku DNA QIAamp® QIAG QIAgen, Hilden, Jerman
deteksi patogen, menggunakan opsi pemanasan 95°C

Pemukulan manik berulang-ulang ditambah kolom RBBC [10]

Perusahaan Penelitian ZYMO,

Persiapan Mini DNA Tinja ZR ZYMO Mengikuti instruksi pabrik
Oranye, CA, AS

doi: 10.1371/journal.pone.0074787.t001

1,2 mm) berukuran panjang 520 mm dengan pegangan 'T' 350 mm dan komposisi komunitas mikroba ditentukan sebagai
dari salah satu ujungnya digunakan untuk memandu tabung lavage ke belakang dijelaskan di bawah ini.

lidah untuk memastikannya masuk ke dalam rumen. Tabung lavage

(diameter luar 19 mm) memungkinkan isi disedot
menggunakan spuit 400 ml dari bagian tengah rumen dorsal,
dan pengamatan terpisah menunjukkan pengambilan sampel berukuran 3 hingga 12 cm
di bawah permukaan isi rumen dan berdekatan dengan
hiliran. Saat pengambilan sampel melalui fistula, segenggam rumen
Isinya diambil dari titik tengah rumen, dimasukkan ke dalam
sebuah wadah dan segenggam kedua isi rumen tadi
diperas untuk mendapatkan cairan, yang ditambahkan ke dalamnya
wadah. Sampel dibekukan, dikeringkan beku, dihomogenisasi,
DNA diekstraksi menggunakan metode PCQI (lihat Tabel 1 untuk
rinciannya), dan komposisi komunitas mikroba ditentukan
seperti yang dijelaskan di bawah ini.
Perbandingan sampel rumen total, padat dan cair
pecahan
Perbandingan dibuat antara sampel yang dikumpulkan melalui
fistula 16 ekor sapi dengan menggunakan prosedur dan hewan yang sama
ditambah dua ekor sapi tambahan dari kawanan yang sama dengan
perbandingan metode pengambilan sampel rumen (di atas) dan padat dan
fraksi cair. Fraksinasi segera dilakukan setelah pengambilan sampel,
dan setiap sampel dibagi menjadi fraksi cair, yang
melewati sisi saringan lubang persegi 0,8 mm, dan
fraksi padat (bahan tertahan oleh saringan mesh 0,8 mm).
Fraksi sampel dibekukan, dikeringkan beku, dihomogenisasi, DNA
diekstraksi menggunakan metode PCQI (lihat Tabel 1 untuk detailnya),
Hasil, kemurnian dan integritas DNA
Konsentrasi DNA diukur secara spektrofotometri
(A260nm, NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
AS) dan secara fluorometri (Quant-iT™ dsDNA Broad Range
Kit Pengujian, Invitrogen, Carlsbad, CA, AS). Kemurnian DNA
dinilai secara spektrofotometri dari A260 nm/ A230 nm dan
Rasio A260 nm/ A280 nm untuk menunjukkan kemungkinan kontaminasi DNA
dengan garam penyangga dan senyawa organik. Integritas adalah
ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa (0,5% berat/vol) (2 jam,
10 × 15 cm Mini-Sub® Cell GT, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) di
60 V menggunakan 1 Kb Plus DNA Ladder dan ÿ DNA/Hind III
fragmen sebagai penanda berat molekul, pasca pewarnaan dengan
Pewarnaan gel DNA SYBR® Aman (Invitrogen), dan penerangan di bawah
Sinar UV.
Menilai kesesuaian DNA untuk mikroba berbasis PCR
aplikasi ekologi
Untuk mengetahui kesesuaian DNA yang diekstraksi untuk hilir
teknik ekologi molekuler, archaeal, bakteri, ciliate dan
lokus penanda genetik jamur diamplifikasi seperti sebelumnya
dijelaskan [15-17], kecuali bahwa 30 bukannya 25 ekstensi
siklus digunakan untuk amplifikasi gen archaeal 16S rRNA. Sebagai
Berbagai metode ekstraksi DNA menghasilkan perbedaan
sejumlah DNA dari jumlah bahan awal yang sama,
jumlah DNA di setiap PCR dinormalisasi berdasarkan

PLOS SATU | www.plosone.org 3 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google
kuantifikasi fluorometri sebelumnya. Untuk meminimalkan bias lebih
lanjut antara metode ekstraksi, 0,5 atau 1 ng DNA untuk lokus
penanda dari jamur dan protozoa ciliata, 0,2 ng untuk bakteri, dan
0,25 ng untuk archaea digunakan dalam PCR. Produk PCR
divisualisasikan dalam gel agarosa 1% (berat/vol) dengan pewarnaan
gel SYBR® Safe DNA setelah elektroforesis.
PCR real-time kuantitatif untuk menghitung populasi
mikroba
Lokus penanda untuk bakteri, archaea, protozoa ciliata, dan jamur
dihitung dengan PCR kuantitatif seperti yang dijelaskan sebelumnya
[15-17] menggunakan kit fluoresensi SYBR Green I (LightCycler 480
SYBR Green I Master atau LightCycler FastStart DNA Master SYBR
Green I kit, Roche, Mannheim, Jerman) pada alat analisa putar real-
time Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Concorde, NSW,
Australia). Standar eksternal disiapkan dengan membuat pengenceran
serial 10 kali lipat dari DNA plasmid murni yang mengandung lokus
penanda hasil kloning yang diamplifikasi dari DNA kultur murni. Tiga
hingga empat pengenceran 10 kali lipat DNA templat masing-masing
diamplifikasi dalam rangkap dua, dan hanya nilai yang berada dalam
rentang linier (r > 0,99) dari kurva standar yang digunakan dalam
perhitungan.
Penilaian komposisi komunitas mikroba
Daerah gen 16S rRNA bakteri dan archaeal, daerah spacer 1
transkripsi internal jamur (ITS1) dan daerah gen 18S rRNA protozoa
ciliate diamplifikasi dalam rangkap tiga seperti dijelaskan sebelumnya
[14,18]. Secara singkat, primer (Integrated DNA Technologies Inc.,
Coralville, IA, USA) terdiri dari 454 rangkaian adaptor Titanium A (5'-
CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') atau B (5'-
CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3'), rangkaian
penghubung dua basis antara kode batang dan primer spesifik grup,
dan kode batang Golay pengoreksi kesalahan 12 basis unik yang
terpasang pada adaptor A untuk identifikasi sampel diikuti dengan
kode batang spesifik urutan primer. Amplikon dari empat kelompok
mikroba dikuantifikasi secara fluorometri, dinormalisasi per sampel,
dan dikumpulkan per kelompok mikroba. Sebanyak 1 ÿg DNA dari
masing-masing empat kumpulan yang dihasilkan dimasukkan ke
dalam gel agarosa (1% berat: vol). Pita divisualisasikan dan dipotong
di bawah transiluminasi cahaya biru, dan amplikon dimurnikan secara
gel dengan QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Amplikon bakteri,
archaeal, dan protozoa ciliata diurutkan menggunakan kimia Titanium
454 GS FLX di Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Jerman) atau
Macrogen Inc. Data pengurutan dikirimkan melalui QIIME-DB
Processing Pipeline (//www.microbio.me/qiime/) dan tersedia di
database publik (perbandingan metode ekstraksi DNA: nomor
tambahan EBI-SRA ERP003658-ERP003661, perbandingan pemukul
manik DNA : Nomor aksesi EBI-SRA ERP003655- ERP003657,
teknik pengambilan sampel dan perbandingan fraksi: Nomor aksesi
MG RAST 4491446.3-4491449.3 (sampel AprMT, AprRT, AprRL,
AprRS)).
Analisis filogenetik dari pembacaan pirosequencing
Data pyrosequence diolah dan dianalisis menggunakan paket
perangkat lunak QIIME versi 1.5 [19]. Urutan yang panjangnya lebih
dari 200 bp dengan skor kualitas rata-rata lebih dari 25 adalah
PLOS SATU | www.plosone.org
Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen
ditugaskan ke sampel tertentu melalui 12 kode batang Golay yang
mengoreksi kesalahan dasar (Tabel S1). Urutan bakteri dihilangkan
dan dugaan chimera dihilangkan menggunakan fungsi OTUpipe
dalam QIIME. Jumlah bacaan sekuensing bakteri, archaeal, protozoa
ciliata, dan jamur yang tersedia untuk analisis dirangkum dalam
Tabel S2. Data sekuens dikelompokkan ke dalam unit taksonomi
operasional (OTU) yang memiliki kesamaan urutan lebih dari 97%
(bakteri, archaea) atau 100% (protozoa ciliata, jamur). Urutan
ditugaskan ke kelompok filogenetik oleh BLAST [20] gen bakteri 16S
rRNA terhadap database Greengenes (versi Februari 2011 [21]), dan
gen 16S rRNA archaeal, gen 18S rRNA protozoa ciliate, dan gen
ITS1 jamur terhadap in-house database [15,16,22]. Data bakteri
dirangkum pada filum, kelas, ordo, famili dan genus, data protozoa
ciliate pada genus, dan data jamur pada tingkat subgenus. Archaea
dirangkum menggunakan skema peringkat taksonomi campuran [22].
Analisis data
Analisis statistik dilakukan di GenStat untuk Windows (edisi ke-13,
VSN International, Hemel Hempstead, UK, www.genstat.co.uk).
ANOVA yang dikombinasikan dengan tes post hoc Scheffe digunakan
untuk menemukan perbedaan signifikan antara parameter yang
diukur setelah metode ekstraksi DNA yang berbeda. Probabilitas p
<0,05 dianggap menunjukkan perbedaan yang signifikan. Data PCR
kuantitatif ditransformasikan log sebelum dianalisis. Kelompok
filogenetik dengan rata-rata kelimpahan <1% dari total komunitas
dikeluarkan dari analisis data komposisi komunitas mikroba. Selain
itu, kehati-hatian harus dilakukan ketika membandingkan data
komposisi komunitas mikroba relatif secara statistik, karena nilainya
bergantung satu sama lain (yaitu jika satu kelompok mikroba
meningkat secara proporsional, kelompok mikroba lainnya harus
menurun), yang dapat menyebabkan perkiraan yang berlebihan
mengenai signifikansi perbedaan.
Korelasi Spearman's Rank dan Pearson antara berbagai metode
ekstraksi DNA dihitung untuk bakteri
(tingkat filum, famili dan genus), archaeal (tingkat taksonomi
campuran), komposisi komunitas jamur (tingkat sub-genus) dan
protozoa ciliate (tingkat genus) untuk membandingkan metode
ekstraksi (rata-rata penentuan komposisi komunitas rangkap tiga
digunakan untuk analisis ini) . Selain itu, untuk setiap sampel rumen
dan kelompok mikroba, matriks kesamaan Pearson berpasangan
dibuat, yang mentabulasi kesamaan struktur komunitas yang
ditentukan menggunakan masing-masing metode ekstraksi DNA
yang berbeda dengan struktur yang ditentukan menggunakan metode
lainnya. Matriks-matriks ini diubah menjadi jarak, dimana jarak = 1 –
kesamaan, untuk menghasilkan enam matriks (genera bakteri [domba
dan sapi], peringkat taksonomi campuran archaeal [domba dan sapi],
genera protozoa ciliate [hanya sapi], dan subgenera jamur [sapi
saja]), yang digunakan untuk menghasilkan enam pohon menggunakan
algoritma UPGMA [23], dari mana pohon konsensus dibentuk
menggunakan program CONSENSE di PHYLIP [23].
Analisis koordinat utama matriks ketidaksamaan Bray-Curtis dari
data komposisi komunitas mikroba dilakukan di QIIME.
4 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787
Machine Translated by Google

Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen

Perbedaan teknik pengambilan sampel rumen dan

Tabel 2. Kuantitas dan kualitas DNA yang diekstraksi dengan
antara fraksi sampel rumen total, cair dan padat
metode ekstraksi DNA yang berbeda.
dinilai menggunakan uji-t sampel dependen.

Hasil dan Diskusi DNA spesifik yang tampak

hasil (ÿg g-1 berat kering

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui dampak yang 15 Metode Sampel isi rumen)b kualitas DNA
ekstraksi DNA yang berbeda, dua metode pengambilan sampel rumen, dan Fluoro Spektro
fraksinasi sampel mempengaruhi parameter seperti kualitas DNA meter fotometri A260/280 nmA260/230 nmIntegritascPCRd
dan kuantitas, serta jumlah mikroba absolut dan sapi CTAB 262 1285 1.62 1.06 +++e -

komposisi komunitas mikroba relatif. FDTB 55 dan f dan dan - +

FDYF 5 dan dan dan - +

+ -
Hasil dan kualitas DNA menggunakan 15 ekstraksi DNA IGMA 184 dan dan dan
metode NUSP 0 2 3.01 0,88 - +

Kami memilih 15 metode ekstraksi DNA yang berbeda PCBBg 281 1376 1.92 1.96 ++ +++

tersedia secara komersial, diterbitkan dalam literatur, atau menjadi PCFIg 79 105 1.86 2.06 ++ +++

digunakan di laboratorium kami (Tabel 1). DNA diekstraksi, di PCNB 175 443 1.54 0,88 + +

rangkap tiga untuk semua 15 metode, dari satu sampel isi rumen kering beku PCQIg 687 730 1.86 2.42 ++ +++

dari sapi yang diberi makan jerami dan dari satu batch PCSAg 3216 5697 1,95 2.08 ++ +++

dari domba yang digembalakan di padang rumput, dengan total 90 ekstraksi. Itu PSP1g 107 465 1.88 1.41 +++ +++

PSP2g 134 874 1,95 1.56 +++ +++

kuantitas, kemurnian, integritas dan ukuran DNA dan DNA-nya
QIAGg 61 234 1.64 0,90 +++ +++
kesesuaian untuk amplifikasi PCR dinilai (Tabel 2). Sebagai
RBBCg 463 2156 1.69 1.39 +++ +++
ditemukan oleh orang lain [7,24], hasil spesifik (g DNA/g sampel) dari
ZYMOg 240 651 1.56 0,50 ++ +++
DNA bervariasi, tergantung pada metode ekstraksi DNA yang digunakan.
1369 1.66 1.21 ++ -
Kit FDYF, FDTB dan IGMA tidak menghasilkan DNA yang seharusnya domba CTAB 49
FDTB 139 dan dan dan + +
diukur dengan spektrofotometri. PCSA dan RBBC
FDYF 95 dan dan dan + +
metode menghasilkan hasil spesifik DNA terbesar, sedangkan
IGMA 177 dan dan dan + -
hasil spesifik terkecil diekstraksi menggunakan NUSP, FDTB,
NUSP 0 5 1.81 0,81 ++ +
dan metode FDYF. Hasil DNA yang terlihat ditentukan dengan menggunakan
PCBBg 1053 5497 1.96 1.92 +++ +++
spektrofotometri dikorelasikan dengan hasil yang ditentukan
PCFIg 809 824 1.94 2.40 +++ +++
menggunakan fluorometri (koefisien korelasi Pearson r = 0,915 dan
PCNB 272 1299 1.69 0,98 ++ +
0,806 untuk sampel sapi dan domba, masing-masing, p <0,001,
PCQIg 808 824 1.87 2.46 +++ +++
menggunakan setiap ekstraksi rangkap tiga sebagai pasangan data diskrit
PCSAg 7653 21323 1.87 2.05 +++ +++
poin). Namun hasil DNA ditentukan dengan fluorometri
PSP1g 226 1073 1,98 1.87 +++ +++
lebih tinggi dibandingkan dengan yang ditentukan menggunakan spektrofotometri.
PSP2g 209 1768 1,98 1.87 +++ +++
Hal ini mungkin terjadi karena adanya gangguan pada material partikulat
QIAGg 240 651 2.02 1.72 +++ +
pembacaan spektrofotometri, atau mungkin karena fluoresensi
RBBCg 1315 4724 1.94 2.24 +++ +++
dipadamkan dengan reagen atau bahan rumen yang diekstraksi bersama dalam
ZYMOg 310 528 1.61 0,57 ++ +++
Persiapan DNA. Dalam upaya meningkatkan hasil absolut,
a Lihat Tabel 1 untuk rincian metode ekstraksi DNA. b Ekstraksi DNA adalah
100 mg sampel beku-kering juga digunakan, tetapi ini
dilakukan rangkap tiga pada setiap sampel menggunakan masing-masing metode. Nilai yang diberikan adalah
tampaknya “membebani” beberapa metode ekstraksi DNA, dan
sarana penentuan ini. c Integritas DNA dinilai dengan gel
secara proporsional lebih sedikit DNA yang diekstraksi dibandingkan dengan standar 25
D
elektroforesis. lokus Kesesuaian untuk PCR didasarkan pada keberhasilan amplifikasi
hingga 30 mg sampel (data tidak ditampilkan). Pengamatan serupa terjadi
penanda bakteri, protozoa ciliata, jamur dan archaeal. e Kriteria mutu adalah
dibuat oleh Ariefdjohan dan rekan [9], yang menemukan hal itu
F
dinilai sebagai baik (+++) , dapat diterima (++) , buruk (+) , dan tidak dapat diterima (ÿ) dan tidak
hasil spesifik DNA meningkat ketika bahan feses lebih sedikit
data yang dapat diandalkan, g Digunakan untuk penyelidikan lebih lanjut.
digunakan untuk ekstraksi DNA. Karena sifat partikulatnya
doi: 10.1371/journal.pone.0074787.t002
sampel rumen yang dihomogenisasi dan dikeringkan beku, kami memutuskan demikian
tidak diinginkan untuk menggunakan sampel <25 mg untuk menghindari pengenalan
variabilitas karena heterogenitas dalam sampel. diperoleh dengan menggunakan metode lain mungkin memerlukan tambahan
Sampel isi rumen mengandung banyak zat, seperti pemurnian, tergantung pada tujuan penggunaannya.
tanin [25], yang dapat menghambat PCR [26]. Relatif Metode PSP1, PSP2, dan QIAG mengekstraksi yang tertinggi
pembacaan serapan (A260/230 nm untuk karbohidrat, aromatik berat molekul DNA dari semua metode pengujian, sedangkan yang itu
senyawa, asam humat, fenolik; A260/280 nm untuk protein) termasuk langkah lisis mekanis seperti PCSA dan PCBB
memberikan indikasi kemurnian DNA dan idealnya 2,0 hingga cenderung menghasilkan ekstrak dengan DNA yang lebih tercukur (data tidak
2,2 untuk A260/230 nm dan 1,8 untuk A260/280 nm untuk sebagian besar biologi molekuler ditampilkan). DNA diekstraksi dari sampel rumen sapi yang diberi makan jerami
aplikasi. Dari semua metode yang diuji, hanya fenolnya umumnya lebih utuh dibandingkan yang diekstraksi dari sampel domba yang
metode berbasis kloroform PCBB dan PCSA memenuhi hal ini diberi makan di padang rumput. Isi rumen dari sapi yang diberi makan jerami
kriteria sampel sapi dan domba, artinya DNA terdiri dari partikel utuh yang tampak berserat, sedangkan itu

PLOS SATU | www.plosone.org 5 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google
dari domba yang diberi makan padang rumput segar tampak kurang berserat,
karena partikelnya telah rusak karena dikunyah dan dikelilingi oleh fase cairan
kental. DNA yang diekstraksi menggunakan semua metode umumnya
berukuran lebih dari 1 kb, sehingga berguna untuk metode yang menghasilkan
urutan yang lebih kecil, seperti amplifikasi gen penanda untuk perbandingan
struktur komunitas.
Dengan beberapa pengecualian, produk PCR diamplifikasi dari semua
ekstrak DNA menggunakan pasangan primer yang menargetkan lokus penanda
pada bakteri, archaea, protozoa ciliata, dan jamur rumen. Gen penanda dari
jamur dan protozoa ciliate tidak dapat diamplifikasi secara andal dari sampel
domba menggunakan kombinasi primer yang berbeda [15,16,18]. Hal ini
ditemukan pada semua metode ekstraksi, dan hal ini mungkin disebabkan oleh
rendahnya prevalensi mikroorganisme ini dalam sampel ini. Kami tidak dapat
memperkuat gen penanda untuk salah satu dari empat kelompok mikroba dari
ekstrak DNA yang diperoleh menggunakan metode CTAB. Beberapa modifikasi
dilakukan pada kondisi PCR dalam upaya memperoleh produk PCR dari
seluruh sediaan DNA tersebut dari metode CTAB, namun semuanya tidak
berhasil. Modifikasi ini termasuk menggunakan konsentrasi DNA yang lebih
tinggi, mengencerkan DNA cetakan untuk mengurangi efek inhibitor PCR
potensial, dan meningkatkan jumlah siklus PCR menjadi 40.
Berdasarkan kuantitas dan kualitas DNA yang diekstraksi, beberapa metode
dianggap tidak cocok untuk mengekstraksi DNA dari sampel rumen dan
dihilangkan dari sisa penyelidikan kami. Sembilan metode yang menghasilkan
DNA dengan kualitas dan kuantitas yang cukup untuk tujuan kami dibandingkan
menggunakan PCR kuantitatif dan penentuan struktur komunitas mikroba
dengan pirosequencing. Kesembilan tersebut adalah PCBB, PCFI, PCQI,
PCSA, PSP1, PSP2, QIAG, RBBC, dan ZYMO.
qPCR bakteri, archaea, jamur dan protozoa ciliate
Untuk menilai efek kuantitatif dari sembilan metode ekstraksi DNA yang
dipilih pada struktur komunitas mikroba, jumlah gen penanda bakteri, archaeal,
protozoa ciliate dan jamur dalam ekstrak DNA yang berbeda dibandingkan
menggunakan qPCR (Gambar 1). Kami menemukan bahwa pilihan metode
ekstraksi DNA berdampak signifikan terhadap jumlah mikroba yang terdeteksi
oleh qPCR. Metode individual bervariasi dalam hal kemampuan reproduksi
teknis, tetapi variasi antara replikasi rangkap tiga lebih kecil dibandingkan
variasi antara DNA yang diekstraksi dengan metode berbeda. Jumlah salinan
gen absolut bakteri, archaeal, jamur, dan protozoa ciliate tertinggi secara
konsisten diperoleh dengan menggunakan metode PCSA dan RBBC pada
sampel domba dan sapi. Jumlah salinan gen absolut berbeda lebih dari 100
kali lipat, bergantung pada metode ekstraksi DNA yang digunakan. Perbedaan
tersebut telah diamati dalam penelitian lain mengenai komunitas mikroba [7,24].
Kami menemukan bahwa jumlah salinan gen per gram sampel asli yang
diperoleh dengan qPCR berkorelasi dengan total hasil DNA yang diekstraksi
(sapi: r = 0,866, 0,962, 0,935, dan 0,901 masing-masing untuk bakteri, archaea,
jamur, dan protozoa ciliata; domba: r = 0,937 untuk bakteri dan 0,945 untuk
archaea, p <0,001), menunjukkan bahwa kuantitas DNA, bukan kualitas, adalah
penyebab variasi ini. Kami menemukan bahwa jumlah salinan gen penanda
protozoa archaeal, jamur dan ciliata yang diekspresikan relatif terhadap bakteri
berbeda tiga kali lipat antara ekstraksi DNA yang berbeda.
metode. Pengamatan serupa untuk Methanomicrobiales adalah
PLOS SATU | www.plosone.org
Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen
dicatat oleh Bergman dan rekannya [7] yang menemukan bahwa ordo ini
mewakili 9 hingga 95% dari total komunitas archaeal, bergantung pada metode
ekstraksi DNA yang digunakan. Ini berarti efisiensi ekstraksi DNA mungkin
berbeda antara komunitas bakteri, archaeal, jamur, dan protozoa, dan dengan
demikian dapat mengakibatkan populasi ini terwakili secara berlebihan atau
kurang, tergantung pada metode ekstraksi DNA yang digunakan.
Komposisi komunitas menggunakan persiapan
DNA yang berbeda
Pyrosequencing dari lokus penanda digunakan untuk membandingkan
komposisi komunitas mikroba bakteri, archaeal, protozoa ciliata dan jamur
dalam DNA yang diperoleh dengan sembilan metode ekstraksi DNA yang
dipilih. Penting untuk ditekankan bahwa komposisi komunitas sebenarnya
dalam sampel rumen tidak diketahui. Perbandingan ekstrak DNA dari komunitas
model telah dilakukan [27], namun melakukan hal tersebut dalam penelitian
kami tidak akan mereplikasi komunitas kompleks dan interaksi eratnya dengan
matriks pakan yang ditemukan dalam rumen. Relatif
kelimpahan kelompok mikroba dibandingkan dan dikontraskan untuk setiap
metode ekstraksi DNA (Gambar 2, Tabel S3). Yang penting, semua kelompok
mikroba dominan dengan kelimpahan relatif lebih dari 1% dideteksi
menggunakan semua metode ekstraksi DNA. Namun, metode ekstraksi DNA
memang mempengaruhi kontribusi kelompok-kelompok ini kepada masyarakat.
Bakteri. Pilihan metode ekstraksi DNA secara signifikan mempengaruhi
kelimpahan kelompok bakteri di berbagai tingkatan taksonomi. Pada tingkat
filum, Bacteroidetes relatif lebih sedikit jumlahnya dengan ZYMO dan PCSA,
dibandingkan dengan metode lain, sedangkan metode QIAG, PSP2 dan PSP1
menghasilkan Bacteroidetes yang relatif lebih banyak pada sampel sapi dan
domba (sapi: 29,3 hingga 47,6%, domba : 55,8 hingga 75%). Sebaliknya, filum
Firmicutes secara signifikan lebih berlimpah ketika metode ekstraksi DNA
berbasis pemukulan manik PCBB, PCQI, PCSA dan RBBC dan metode ZYMO
digunakan (sapi: kelimpahan relatif 38,1 hingga 53,6%, domba: kelimpahan
relatif 19 hingga 29,4%) . Fibrobacter bervariasi hingga 2,6 kali lipat pada sapi
(3,5 hingga 9,1%) dan 4,8 kali lipat pada domba (1,5 hingga 7,2%) dengan
metode pemukulan non-manik menghasilkan representasi DNA yang jauh lebih
besar dari Fibrobacter . Penggunaan metode ZYMO menghasilkan kelimpahan
relatif tertinggi dari filum subdominan Spirochaetes (masing-masing 2,3 dan
1,2% pada sapi dan domba). Efek serupa juga terlihat pada tingkat kelas, ordo,
famili dan genus (Tabel S3).
Arkea. Pilihan metode ekstraksi DNA secara signifikan mempengaruhi
representasi beberapa kelompok archaeal, terutama 'Methanoplasmatales' ([28];
juga dikenal sebagai kelompok Rumen Cluster C [22]). Terdapat perbedaan
hingga 6,6 kali lipat dalam kelimpahan relatif 'Methanoplasmatales' yang
diamati (2 hingga 13,2%). Secara umum, metode pemukulan manik seperti
RBBC dan PCSA cenderung menghasilkan lebih sedikit 'Methanoplasmatales',
sedangkan metode yang kurang fisik seperti PSP2 cenderung menghasilkan
lebih banyak 'Methanoplasmatales'. Hal ini mungkin disebabkan karena
organisme ini lebih mudah dilisiskan, namun hal ini masih harus dibuktikan. Hal
sebaliknya diamati pada sekuens yang termasuk dalam kelompok
Methanosphaera , yang tampaknya memerlukan gangguan lebih besar untuk
melepaskan DNA mereka. Kelimpahan sekuens milik Methanobrevibacter
ruminantium
6 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787
Machine Translated by Google

Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen

Gambar 1. Nomor salinan lokus penanda bakteri, archaeal, jamur dan protozoa ciliata absolut (A) dan relatif (B). Angka absolut
dinyatakan per gram berat kering isi rumen yang dikumpulkan dari sapi yang diberi makan jerami dan domba yang diberi makan padang
rumput dimana DNA diekstraksi dalam rangkap tiga menggunakan sembilan metode berbeda (Tabel 1). Angka relatif ditampilkan sebagai
proporsi salinan lokus bakteri. Nilai yang digambarkan adalah rata-rata dan deviasi standar dari data yang ditransformasikan log. Garis
vertikal menunjukkan satu standar deviasi. Mereka yang tidak berbagi huruf di dasar batang berbeda secara signifikan (p <0,05, ANOVA,
Scheffe post hoc test). doi: 10.1371/journal.pone.0074787.g001

PLOS SATU | www.plosone.org 7 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google
Gambar 2. Komposisi komunitas relatif (A) bakteri dan (B) archaeal dalam sampel rumen. Rata-rata (% dari total komunitas) dan
standar deviasi, dari penentuan rangkap tiga, dari kontribusi relatif masing-masing kelompok mikroba dalam DNA yang diperoleh dengan
menggunakan sembilan metode ekstraksi terbaik ditampilkan. Tombol di sebelah kanan menunjukkan komponen utama komunitas. Data
yang mendasari bakteri, archaea, jamur dan protozoa ciliate disajikan pada Tabel S3. Mbb, Metanobrevibacter. doi: 10.1371/
journal.pone.0074787.g002
clade serupa untuk semua metode. Urutan yang berafiliasi dengan
clade Methanobrevibacter gottschalkii bervariasi hingga 1,3 kali
lipat antar metode.
Protozoa bersilia. Pilihan metode ekstraksi DNA secara halus
mempengaruhi representasi beberapa kelompok protozoa ciliata
dalam sampel sapi. Kelimpahan Entodinium bervariasi hingga 1,4
kali lipat (32,2 hingga 45,7%) dan Entodinium relatif lebih melimpah
pada DNA yang diekstraksi menggunakan metode PCFI, PCQI,
PCSA dan QIAG, sedangkan representasinya paling rendah ketika
metode PCBB dan ZYMO digunakan. Kelimpahan Eremoplastron-
Diploplastron sangat berbeda antara metode ZYMO, PCFI dan
QIAG. Proporsi relatif Polyplastron serupa untuk semua metode
ekstraksi DNA.
jamur. Secara keseluruhan, komposisi komunitas jamur tidak
terlalu dipengaruhi oleh metode ekstraksi DNA. Meskipun
pembacaan urutan yang diperoleh relatif sedikit (124 hingga 168
pembacaan per sampel), beberapa perbedaan halus dalam
kelimpahan Orpinomyces, Piromyces dan kelompok SK3 diamati
antara metode ekstraksi DNA.
Korelasi dan perbedaan secara keseluruhan. Peningkatan
kelimpahan filum Firmicutes berkorelasi dengan penurunan
kelimpahan Bacteroidetes (sapi: r = -0,805; domba: r = -0,976, p
<0,001). Korelasi yang bergantung pada ekstraksi DNA antara
Firmicutes dan Bacteroidetes miliki
sebelumnya telah diamati [6]. Menariknya, jumlah total DNA yang
diekstraksi cenderung berkorelasi positif dengan
PLOS SATU | www.plosone.org
Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen
kelimpahan filum Firmicutes (sapi: r = 0,669, p <0,001; domba: r =
0,435, p = 0,023) dan berkorelasi negatif dengan kelimpahan filum
Bacteroidetes (sapi: r = -0,325, p = 0,098; domba: r = -0,455, p =
0,017). Meskipun tidak mungkin untuk menentukan metode mana
yang mengekstraksi DNA yang paling mewakili komunitas mikroba
rumen, data ini menunjukkan bahwa metode tanpa langkah lisis
mekanis mengekstraksi lebih sedikit DNA. Hal ini dapat menimbulkan
bias terhadap Bacteroidetes Gram negatif , yang mungkin lebih
mudah dilisiskan dibandingkan Firmicutes Gram-positif [29]. Patut
dicatat bahwa, untuk sampel domba, pembacaan pirosekuensing
yang dipertahankan secara signifikan lebih sedikit setelah
pemfilteran kualitas dan penghilangan chimera oleh OTUpipe untuk
metode yang melibatkan pemukulan manik (PCSA, PCBB, dan
RBBC; Tabel S2), terutama bila dibandingkan dengan metode
berbasis kit seperti seperti QIAG yang tidak melisiskan sel secara
mekanis. Sampel yang diambil dari domba yang diberi makan
rumput memiliki sifat serat yang lebih sedikit dibandingkan sampel dari sapi yang dib
Hal ini mungkin menunjukkan bahwa DNA yang diekstraksi dari
sampel domba lebih terfragmentasi setelah pemukulan manik, yang
akan menghasilkan amplifikasi yang lebih palsu pada tahap hilir
PCR, seperti pembentukan amplikon chimeric. Oleh karena itu,
penting untuk tidak membuat sampel mengalami lisis mekanis yang
terlalu keras, karena ada trade-off antara memperoleh cukup DNA
yang mewakili komunitas mikroba rumen dan merusak DNA dalam
proses ekstraksi.
8 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787
Machine Translated by Google

Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen

Perbandingan metode ekstraksi DNA

Korelasi Spearman's Rank dan Pearson antara berbagai metode
ekstraksi DNA dihitung untuk komunitas bakteri, archaeal, protozoa
ciliata, dan jamur (Tabel S4).
Secara keseluruhan, korelasi yang baik antara data komposisi
mikroba dari berbagai metode ekstraksi DNA diamati. Koefisien
korelasi Pearson r berkisar antara 1,000 untuk beberapa metode
hingga 0,823, yang merupakan korelasi Pearson terendah yang
diamati antara metode ZYMO dan PSP2 ketika komposisi bakteri
sapi dibandingkan pada tingkat keluarga. Metode PCQI dan RBBC
berkorelasi baik, korelasi terendah adalah 0,978 untuk protozoa
ciliata pada sapi dan korelasi 0,9995 dan 0,9996 diamati untuk
bakteri pada tingkat filum masing-masing pada domba dan sapi.
Untuk menentukan taksa mikroba spesifik mana yang berpotensi
paling terpengaruh oleh metode ekstraksi DNA tertentu, dilakukan
ANOVA yang dikombinasikan dengan uji konservatif Scheffe post
hoc (Tabel S5).
Gambar 3. Dendrogram konsensus yang menggambarkan
Dari analisis ini, disimpulkan bahwa struktur komunitas mikroba kesamaan komunitas mikroba yang diperoleh dengan
yang ditentukan menggunakan metode PCQI dan RBBC secara menggunakan metode ekstraksi DNA yang berbeda. Untuk setiap
umum sebanding, sedangkan untuk metode lain, seperti PSP1 dan sampel rumen dan kelompok mikroba, matriks kesamaan Pearson
ZYMO, kelimpahan relatifnya berbeda secara signifikan untuk berpasangan dibuat, mentabulasikan kesamaan struktur komunitas
yang ditentukan menggunakan setiap metode ekstraksi DNA yang
banyak taksa mikroba. Hal ini juga ditampilkan secara grafis pada
berbeda dengan struktur yang ditentukan menggunakan DNA dari setiap metode lainn
Gambar 3, yang menggambarkan kesamaan komunitas mikroba
Matriks-matriks ini diubah menjadi jarak untuk menghasilkan enam
yang diperoleh dengan menggunakan metode ekstraksi DNA yang
berbeda. matriks (genera bakteri [domba dan sapi], peringkat taksonomi
campuran archaeal [domba dan sapi], genera protozoa ciliata [hanya
Analisis koordinat utama digunakan untuk membandingkan dan
sapi], dan subgenera jamur [hanya sapi]), yang digunakan untuk
membedakan komposisi komunitas mikroba yang diperoleh dari
menghasilkan enam pohon menggunakan algoritma UPGMA [23],
metode ekstraksi DNA yang berbeda (Gambar 4). Komposisi
dari mana pohon konsensus dibentuk menggunakan program
komunitas bakteri bervariasi antar metode ekstraksi DNA. Titik data
CONSENSE di PHYLIP [23]. Bilah skala mewakili 1% perbedaan
dari berbagai metode ekstraksi DNA tidak selalu dikelompokkan
komunitas.
secara erat, yang menunjukkan bahwa metode tersebut tidak
doi: 10.1371/journal.pone.0074787.g003
mengambil komponen komunitas yang sama dengan efisiensi yang
sama. Ada beberapa pengelompokan titik data dari metode RBBC
dan PCBB, serta metode PSP1, PSP2 dan QIAG. Poin data yang berkepanjangan (4 atau 5 menit). Bersamaan dengan itu, jumlah
diperoleh dari sampel domba tersebar jauh lebih luas dibandingkan anggota filum bakteri Firmicutes lebih banyak, kemungkinan
sampel sapi, yang menunjukkan bahwa pilihan metode ekstraksi menunjukkan bahwa sel-sel ini lebih sulit untuk dilisiskan. Hasil DNA
DNA memiliki pengaruh yang lebih besar terhadap persepsi meningkat seiring bertambahnya waktu pemukulan manik,
komunitas bakteri domba. Komposisi komunitas archaeal juga menunjukkan bahwa sel-sel yang lebih sulit untuk dilisis sedang
bervariasi antar metode ekstraksi DNA. Sekali lagi, tidak ada metode terganggu. Namun, secara keseluruhan, komposisi komunitas
yang dapat dibandingkan secara langsung, meskipun ada beberapa bakteri, archaeal, dan protozoa ciliate serupa, meskipun terdapat
titik data yang tumpang tindih dan/atau berdekatan untuk PSP1, tingkat gangguan mekanis yang berbeda. Analisis koordinat utama
PCFI dan QIAG, serta metode RBBC dan PCSA untuk sampel menunjukkan bahwa titik-titik untuk setiap sampel dikelompokkan
domba dan sapi. Mirip dengan archaea dan bakteri, komposisi bersama, terlepas dari teknik pemukulan manik yang digunakan
komunitas protozoa ciliata juga bervariasi antar metode ekstraksi (Gambar S1). Untuk memecah DNA sesedikit mungkin, sambil tetap
DNA (data tidak ditampilkan). mendapatkan hasil DNA yang tinggi dan representatif, kami
merekomendasikan penggunaan Mini-Beadbeater-96 selama 4
menit untuk melisiskan mikroba dalam sampel rumen secara mekanis.
Perbandingan waktu pemukulan manik
Pemukulan manik sering digunakan untuk melisiskan sel bakteri. Komunitas mikroba dalam sampel dikumpulkan
Dampak tingkat pemukulan manik terhadap hasil DNA dan komposisi
dengan metode berbeda
komunitas mikroba dinilai pada sampel rumen dari empat hewan Kami membandingkan struktur komunitas mikroba dalam sampel
berbeda (Tabel S6). Hasil DNA terbesar diperoleh ketika sampel paralel yang dikumpulkan dari 14 sapi menggunakan selang perut
diganggu secara mekanis selama 4 atau 5 menit dengan Mini- oral atau melalui fistula rumen. Ini adalah dua metode yang umum
Beadbeater-96 atau FastPrep FP120. Anggota ordo archaeal digunakan untuk mengambil sampel isi rumen. Komposisi komunitas
'Methanoplasmatales' dan bakteri dari filum Bacteroidetes jumlahnya mikroba bakteri, archaeal, jamur dan protozoa ciliata dalam sampel
berkurang jika terjadi gangguan mekanis. rumen ini dibandingkan (Gambar 5, Tabel S7). Perbedaan dalam
kelimpahan relatif beberapa spesies

PLOS SATU | www.plosone.org 9 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google

Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen

Gambar 4. Perbandingan komposisi komunitas mikroba setelah ekstraksi DNA dengan metode berbeda. Analisis koordinat utama ketidaksamaan Bray-Curtis dari
A) komunitas bakteri (tingkat filum) dan B) komunitas archaeal (peringkat taksonomi campuran) dalam sampel rumen sapi dan domba ditampilkan. Data dari masing-
masing ekstraksi rangkap tiga yang dilakukan diplot. Tombol di sebelah kanan menunjukkan berbagai metode ekstraksi DNA yang digunakan. Nilai dalam tanda kurung
menunjukkan jumlah variasi yang dijelaskan oleh setiap koordinat. doi: 10.1371/journal.pone.0074787.g004

kelompok mikroba diamati antara dua metode pengambilan sampel. Pengambilan Meskipun struktur komunitas mikroba secara keseluruhan berasal dari sampel
sampel melalui selang perut tampaknya meningkatkan kelimpahan famili yang dikumpulkan dengan dua metode berbeda, namun tidak boleh diabaikan
Prevotellaceae (peningkatan 1,3 kali lipat, 24,8 hingga 31,3%) tetapi menurunkan bahwa kelimpahan relatif kelompok mikroba tertentu tampak berbeda secara
kelimpahan famili Lachnospiraceae (penurunan 1,4 kali lipat, 14,5 hingga 20,1%), signifikan tergantung pada metode yang digunakan. Perbedaan kelimpahan relatif
termasuk genera yang berafiliasi dengan Butyrivibrio dan Coprococcus. Dalam taksa tertentu dapat dijelaskan oleh ukuran tabung yang digunakan. Selang perut
domain Archaea, kelimpahan sekuens yang berafiliasi dengan klade oral hanya memungkinkan pengambilan sampel potongan kecil serat yang sangat
Methanobrevibacter ruminantium 1,2 kali lipat (38,9 hingga 46,3%) lebih banyak terdegradasi. Dengan demikian, penjajah utama bahan tanaman yang tertelan
pada sampel yang dikumpulkan melalui fistula rumen, sedangkan sekuens yang mungkin kurang terwakili dalam teknik pengambilan sampel ini. Kedua, rumen
termasuk dalam 'Methanoplasmatales' 1,9 kali lipat lebih umum (5,1 hingga 9,6%) terdiri dari beberapa relung mikro yang memiliki karakteristik kimia dan fisik yang
ke
dalam sampel yang dikumpulkan melalui tabung lambung oral. Efek serupa bervariasi [31], dan oleh karena itu mungkin juga bervariasi dalam komposisi
terlihat pada beberapa anggota komunitas protozoa ciliata. Misalnya, genus komunitas mikroba. Pengambilan sampel melalui fistula memungkinkan
dominan, Epidinium, relatif lebih banyak bila sampel diambil melalui rumen fistula,
pengambilan sampel yang konsisten pada situs serupa; namun penempatan
sedangkan sekuens yang termasuk dalam genera Entodinium, Eudiplodinium ,
selang lambung oral dalam rumen melalui esofagus tidak dapat dipengaruhi
dan kelompok Eremoplastron Diploplastron relatif lebih banyak bila sampel
dengan mudah [11]. Dengan demikian, hasil yang diperoleh dari sampel yang
diperoleh melalui pipa lambung oral. Metode pengambilan sampel tampaknya
dikumpulkan melalui selang lambung oral juga dapat dipengaruhi oleh lokasi
tidak memberikan pengaruh yang besar terhadap komunitas jamur anaerobik
sampel rumen tertentu [31]. Sebagai konsekuensinya, perbedaan yang signifikan
dalam sampel tersebut. Hanya perbedaan yang relatif kecil yang terdeteksi,
secara statistik dalam struktur komunitas mikroba antara inang yang menunjukkan
terutama pada kelompok Caecomyces 1, Neocallimastix 1, Piromyces 2,
fenotipe berbeda seperti sapi dengan efisiensi konversi pakan rendah dan tinggi
Piromyces 3, dan SK3, dan prevalensi beberapa rangkaian yang berpotensi baru
mungkin lebih sulit untuk dideteksi, namun sering kali dimungkinkan untuk
yang tidak terkait erat dengan rangkaian referensi dalam database GenBank.
mengambil sampel dalam jumlah yang lebih banyak dari hewan utuh, dibandingkan
Meskipun terdapat perbedaan dalam kelimpahan yang terdeteksi untuk taksa
dengan hewan yang berfistulasi.
tertentu, sampel yang dikumpulkan melalui fistula atau tabung lambung oral tidak
dapat dengan mudah dibedakan dengan analisis koordinat utama (data tidak
ditampilkan). Dalam penelitian sebelumnya, keragaman bakteri dalam sampel
cairan rumen yang diperoleh melalui fistula rumen dan melalui selang perut oral
Secara keseluruhan, perbedaan struktur komunitas kecil jika dibandingkan
dari tiga domba yang diberi makan lucerne cincang dan dua sapi yang diberi
makan jerami dibandingkan dengan menggunakan analisis elektroforesis gel dengan perbedaan yang disebabkan oleh pilihan metode ekstraksi DNA. Sampel

gradien denaturasi gen bakteri 16S rRNA [30]. Seperti dalam penelitian kami, yang diperoleh melalui fistula dan selang lambung oral keduanya memberikan

komunitas bakteri dikelompokkan berdasarkan spesies hewan dan ruminansia, representasi kualitatif yang sama validnya mengenai struktur komunitas mikroba.

bukan berdasarkan metode pengambilan sampel, sehingga menunjukkan bahwa Selain itu, pengambilan sampel melalui selang lambung memungkinkan penilaian

perbedaan antara metode pengambilan sampel dapat diabaikan dalam yang lebih mudah terhadap perbedaan komunitas mikroba rumen pada individu
perbandingan ini.
yang telah dipilih berdasarkan sifat-sifat yang diinginkan (misalnya efisiensi
penggunaan pakan untuk produksi, ketahanan terhadap penyakit atau racun)
pada ternak dan kelompok ternak komersial. Teknik ini memungkinkan sejumlah
besar individu untuk diskrining, dengan cepat dan dengan biaya rendah, dan
menghindari kebutuhan untuk melakukan penyisipan bedah pada fistula, sebuah prosedur yang

PLOS SATU | www.plosone.org 10 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google

Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen

Gambar 5. Dampak metode pengambilan sampel rumen terhadap komposisi mikrobiota rumen bakteri (A) dan (B) archaeal. Struktur komunitas mikroba
yang tampak dalam sampel paralel yang dikumpulkan dari 14 sapi menggunakan tabung perut oral atau melalui fistula rumen dibandingkan. Rata-rata (% dari total
komunitas) dan kesalahan standar dari kontribusi relatif masing-masing kelompok mikroba ditampilkan. Tombol di sebelah kanan menunjukkan komponen utama
komunitas. Data yang mendasari bakteri, archaea, jamur dan protozoa ciliate disajikan pada Tabel S7. Mbb, Metanobrevibacter. Perbedaan antara metode
pengambilan sampel rumen dinilai menggunakan uji-t sampel dependen. doi: 10.1371/journal.pone.0074787.g005

prosedur yang tidak dapat dilakukan dalam lingkungan komersial dan biasanya
terbatas pada hewan percobaan.
Perbandingan fraksi sampel rumen total, padat dan
cair
Sampel pencernaan rumen sering dipisahkan menjadi fraksi cair dan padat
untuk dianalisis. Komposisi komunitas mikroba bakteri, archaeal, jamur dan
protozoa ciliata dalam fraksi sampel rumen total, padat dan cair dari 14 hingga
16 sapi perah dibandingkan (Gambar 6, Tabel S8).
Perbedaan kelimpahan relatif beberapa kelompok mikroba diamati antara fraksi
sampel. Kami menemukan bahwa fraksi cair tampaknya mengandung
kelimpahan relatif lebih tinggi dari famili Prevotellaceae (peningkatan 1,4 kali
lipat, 25,1 hingga 36,1%) dan kelimpahan relatif lebih rendah dari famili
Lachnospiraceae (penurunan 1,6 kali lipat, 12,7 hingga 20,8%) bila dibandingkan
dengan fraksi sampel rumen total (dan padat). Temuan ini umumnya setuju
dengan temuan lain [3,12,13]. Dalam domain Archaea, kelimpahan sekuens
yang berafiliasi dengan clade Methanobrevibacter ruminantium adalah 1,9 kali
lipat
(45,7 hingga 23,8%) lebih sedikit jumlahnya pada fraksi cair, sedangkan urutan
yang termasuk dalam clade Methanobrevibacter gottschalkii 1,5 kali lipat lebih
umum (40,7 hingga 60,1%) pada fraksi sampel cair. Efek serupa terlihat pada
beberapa anggota komunitas protozoa dan jamur ciliate.
Secara keseluruhan, perbedaan signifikan dalam struktur komunitas diamati
antara fraksi rumen cair, padat dan total, dan
Perbedaan-perbedaan ini mungkin mencerminkan tempat tinggal mikroba di
dalam rumen. Perbedaan komunitas mikroba adalah yang paling besar
mencolok ketika fraksi sampel rumen cair dibandingkan dengan fraksi sampel
rumen padat dan total, dan tampak bahwa fraksi sampel rumen cair tidak
mewakili sampel rumen total.
Ringkasan dan kesimpulan
Studi tentang struktur komunitas mikroba rumen, dan kemampuan untuk
membandingkan kumpulan data yang diperoleh oleh berbagai kelompok
penelitian di seluruh dunia, akan membantu memahami hubungan antara
berbagai komponen komunitas kompleks ini, inangnya, dan pola makannya.
Namun, untuk memungkinkan perbandingan antara penelitian yang berbeda,
protokol pengambilan sampel rumen, ekstraksi DNA, dan amplifikasi PCR
harus distandarisasi atau telah terbukti menghasilkan hasil yang serupa. Hal
ini sangat relevan jika data ingin dibandingkan dalam skala global, seperti yang
terjadi pada Sensus Rumen Global.
(www.globalrumencensus.org.nz), Dan RuminOmics
(www.ruminomics.eu) proyek. Idealnya, sampel akan diproses menggunakan
jalur pemrosesan sampel dan analisis data yang disepakati.
Kami menemukan bahwa pilihan metode ekstraksi DNA berpengaruh
struktur komunitas mikroba yang tampak dengan cara yang dianggap signifikan
secara statistik dan biologis, meskipun DNA diekstraksi dari subsampel sampel
rumen yang dihomogenisasi yang sama. Ini bukanlah sub-sampling

PLOS SATU | www.plosone.org 11 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google

Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen

Gambar 6. Dampak fraksinasi sampel rumen terhadap komposisi mikrobiota rumen bakteri (A) dan (B) archaeal. Struktur komunitas mikroba
yang terlihat dalam sampel yang dikumpulkan dari 16 sapi dipisahkan menjadi fraksi sampel rumen cair, padat dan total, lalu struktur komunitas
mikroba yang terlihat dibandingkan. Rata-rata (% dari total komunitas) dan kesalahan standar dari kontribusi relatif masing-masing kelompok mikroba
ditampilkan. Tombol di sebelah kanan menunjukkan komponen utama komunitas. Data yang mendasari bakteri, archaea, jamur dan protozoa ciliate
disajikan pada Tabel S8. Mbb, Metanobrevibacter. Perbedaan antara fraksi sampel rumen total, cair dan padat dinilai dengan menggunakan uji-t
sampel dependen. doi: 10.1371/journal.pone.0074787.g006

artefak, karena tiga sub-sampel paralel yang diperlakukan dengan cara
yang sama untuk setiap metode yang diuji selalu menghasilkan struktur
komunitas yang serupa. Tak satu pun dari metode ekstraksi DNA
menghasilkan 100% komposisi komunitas bakteri, archaeal, atau
protozoa ciliate yang sebanding, baik dari perspektif komposisi atau
numerik. Faktanya, hanya beberapa metode ekstraksi DNA yang
tampak cukup mirip untuk memungkinkan perbandingan langsung
terhadap sebagian besar parameter komunitas.
Meskipun ekstraksi DNA mempunyai dampak besar, variasi antara
sampel rumen sapi yang diberi makan jerami dan sampel rumen domba
yang diberi makan padang rumput umumnya lebih besar dibandingkan
variasi antara metode ekstraksi DNA dan atau replikasi dalam metode
ekstraksi. Hal ini menunjukkan bahwa komunitas yang berbeda dari
sampel ini dapat dibedakan terlepas dari metode ekstraksi DNA yang
dipilih. Hal ini mungkin tidak mungkin terjadi jika perbedaan antar
sampel tidak terlalu terlihat, misalnya ketika membandingkan hewan
individu dengan pola makan yang sama.
Saat memilih metode ekstraksi DNA, faktor-faktor lain juga harus
dipertimbangkan, seperti kualitas yang diperlukan untuk analisis hilir,
variabilitas metode secara keseluruhan antar peneliti yang berbeda,
serta ketersediaan peralatan, reagen, dan perlengkapan. Misalnya,
metode yang meminimalkan pergeseran adalah yang terbaik untuk
pengurutan genom, metode dengan koefisien variasi yang rendah lebih
disukai untuk mendeteksi perbedaan kecil dalam parameter, sedangkan
metode yang dapat ditingkatkan skalanya akan lebih disukai untuk
memproses jumlah sampel yang besar.
Karena alasan ini, kami tidak dapat mendukung atau menyarankan untuk tidak menggunakan
metode ekstraksi DNA tertentu. Kami secara rutin menggunakan
metode ekstraksi DNA PCQI di laboratorium kami. Metode ini
memberikan hasil yang mirip dengan metode RBBC namun memiliki
keunggulan tambahan yaitu dapat dengan mudah disesuaikan dengan
format pelat 96 sumur, sehingga sampel nantinya dapat diproses
dengan robot untuk meminimalkan variasi, kesalahan manusia, dan
mengurangi waktu pengambilan sampel. persiapan.
Yang paling penting, para peneliti perlu menyadari bahwa struktur
komunitas mikroba yang diperoleh dari penelitian yang menggunakan
metode ekstraksi DNA berbeda belum tentu sebanding. Hal ini sangat
relevan ketika merancang penelitian kohort yang besar atau ketika
melakukan meta-analisis data dari penelitian yang berbeda.
informasi pendukung
Gambar S1. Komposisi komunitas mikroba setelah ekstraksi DNA
menggunakan metode dan durasi pemukulan manik yang berbeda.
DNA diekstraksi dalam rangkap dua dari isi rumen tiga ekor domba
dan satu ekor sapi dengan metode ekstraksi DNA PCQI menggunakan
metode pemukulan manik dan waktu yang berbeda. Analisis koordinat
utama dari ketidaksamaan Bray-Curtis dari A) bakteri tingkat filum dan
B) komunitas archaeal tingkat peringkat taksonomi campuran dalam
konten rumen sapi dan domba digambarkan di sini. Data dari masing-
masing ekstraksi duplikat yang dilakukan diplot. Itu

PLOS SATU | www.plosone.org 12 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787

Machine Translated by Google
nilai dalam tanda kurung memberikan jumlah variasi yang dijelaskan oleh setiap
koordinat.
(TIF)
Tabel S1. Parameter yang digunakan untuk menetapkan urutan ke sampel
tertentu melalui 12 kode batang Golay yang mengoreksi kesalahan.
(XLSX)
Tabel S2. Rata-rata jumlah pembacaan sekuensing digunakan untuk
menentukan komposisi komunitas mikroba rumen. Pengaruh metode
ekstraksi DNA dan pengambilan sampel rumen terhadap komposisi komunitas
mikroba diselidiki menggunakan A) DNA yang diekstraksi rangkap tiga dari isi
rumen sapi yang diberi makan jerami dan B) DNA yang diekstraksi rangkap tiga
dari isi rumen domba yang diberi makan rumput, diekstraksi menggunakan
sembilan metode berbeda (Tabel 1), C)
DNA diekstraksi dari sampel rumen yang dikumpulkan secara paralel dari 14
sapi perah melalui selang perut oral atau fistula rumen, dan D) DNA diekstraksi
dari fraksi total, padat atau cair sampel rumen yang dikumpulkan secara paralel
dari 14 sapi perah ditambah dua sapi tambahan dari kawanan yang sama melalui
fistula rumen.
(DOCX)
Tabel S3. Efek signifikan dari metode ekstraksi DNA pada struktur
komunitas mikroba rumen.
DNA diekstraksi rangkap tiga dari isi rumen A) sapi yang diberi makan jerami
dan B) domba yang diberi makan padang rumput menggunakan sembilan
metode berbeda yang dinilai dalam penelitian ini (Tabel 1). Kelimpahan rata-rata
(%) dari taksa mikroba bakteri, archaeal, jamur dan protozoa protozoa yang
dominan pada peringkat taksonomi yang berbeda dihitung. SE – Kesalahan
standar perbedaan; p – Kemungkinan kelimpahan kelompok mikroba tidak
berbeda nyata dengan menggunakan uji F. Lihat Tabel S5 untuk hasil
perbandingan post hoc .
(DOCX)
Tabel S4. Korelasi struktur komunitas mikroba setelah ekstraksi DNA
dengan metode berbeda. Korelasi Pearson (A, B) dan peringkat Spearman (C,
D) antara berbagai bagian komunitas mikroba pada tingkat taksonomi yang
berbeda dihitung menggunakan rata-rata kelimpahan taksa bakteri, archaeal,
jamur, dan protozoa ciliate yang dominan (dari data pada Tabel S3) yang diukur
dalam DNA dari sampel isi rumen sapi (A, C) dan (B, D) domba yang diekstraksi
menggunakan sembilan metode ekstraksi berbeda (Tabel 1).
(DOCX)
Referensi
1. Johnson DE, Ward GM (1996) Perkiraan emisi metana hewan.
Penilaian Lingkungan Monit 42: 113-141. doi:10.1007/BF00394045.
2. Kim M, Morrison M, Yu Z (2011) Status sensus keanekaragaman filogenetik mikrobioma
rumen. Mikrobiol FEMS Ekol 76: 49-63. doi:
10.1111/j.1574-6941.2010.01029.x. PubMed: 21223325.
3. Fouts DE, Szpakowski S, Purushe J, Torralba M, Waterman RC dkk.
(2012) Urutan generasi berikutnya untuk menentukan keanekaragaman
prokariotik dan jamur dalam rumen sapi. PLOS SATU 7: e48289.
doi:10.1371/ jurnal.pone.0048289. PubMed: 23144861.
PLOS SATU | www.plosone.org
Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen
Tabel S5. Pengaruh metode ekstraksi DNA pada
nilai-nilai post-hoc struktur komunitas mikroba rumen yang jelas . Metode
ekstraksi DNA (Tabel 1) yang tidak berbagi huruf berbeda secara signifikan untuk
takson tertentu yang mencantumkan huruf-huruf tersebut (p <0,05, ANOVA, uji
post-hoc Scheffe ).
Pengujian dilakukan pada ulangan individu yang mendasari data pada Tabel S3.
(DOCX)
Tabel S6. Pengaruh metode pemukulan manik pada ekstraksi DNA dari
sampel rumen. Komposisi komunitas mikroba (A,% dari total komunitas), hasil
DNA spesifik (B), dan jumlah rata-rata pembacaan sekuensing per sampel (C).
DNA diekstraksi dalam rangkap dua (cara penentuan duplikat ditunjukkan)
dengan metode ekstraksi DNA PCQI dari isi rumen tiga domba dan satu sapi,
menggunakan metode dan waktu pemukulan manik yang berbeda.
(DOCX)
Tabel S7. Pengaruh metode pengambilan sampel rumen terhadap struktur
komunitas mikroba. Komposisi komunitas mikroba (% dari total komunitas) dari
DNA yang diekstraksi dari sampel rumen yang diperoleh melalui pipa lambung
oral dan melalui fistula dari 14 ekor sapi perah.
(DOCX)
Tabel S8. Pengaruh fraksinasi sampel rumen terhadap struktur komunitas
mikroba. Komposisi komunitas mikroba (% total komunitas) dari fraksi sampel
rumen (cair, padat dan total) 16 ekor sapi perah.
(DOCX)
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada John Koolaard dan Dongwen Luo atas sarannya
mengenai analisis statistik data, Michelle Kirk atas bantuan teknisnya, Stefan
Muetzel atas penyediaan sampel rumen domba 322 dan 325, Christina Moon
dan Adrian Cookson atas peninjauan kritis naskah (AgResearch), dan Gail
Ackermann dan Doug Wendel (Universitas Colorado) untuk penyerahan urutan
ke EBI.
Kontribusi Penulis
Menyusun dan merancang percobaan: GH SK GCW PHJ.
Eksperimen yang dilakukan: GH FC VHM MZ SK SJN GCW.
Analisa data : GH FC VHM MZ SK SJN PHJ. Naskah yang ditulis: GH SK GCW
PHJ.
4. Berg Miller ME, Yeoman CJ, Chia N, Tringe SG, Angly FE dkk. (2012)
Hubungan fag-bakteri dan elemen CRISPR diungkapkan oleh survei metagenomik
mikrobioma rumen. Mikrobiol Lingkungan 14: 207-227. doi:10.1111/j.1462-2920.2011.02593.x.
PubMed: 22004549.
5. Krsek M, Wellington EM (1999) Perbandingan berbagai metode untuk isolasi dan pemurnian
DNA komunitas total dari tanah. J Metode Mikrobiol 39: 1-16. doi:10.1016/
S0167-7012(99)00093-7.
PubMed: 10579502.
13 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787
Machine Translated by Google
6. Ó Cuív P, Aguirre de Cárcer D, Jones M, Klaassens ES, Worthley DL dkk.
(2010) Pengaruh metode ekstraksi DNA terhadap evaluasi keanekaragaman
mikroba yang terkait dengan jaringan kolon manusia.
Mikroba Ekol 61: 353-362. PubMed: 21153634.
7. Bergmann I, Mundt K, Sontag M, Baumstark I, Nettmann E dkk. (2010)
Pengaruh isolasi DNA pada kuantifikasi Archaea metanogenik berbasis Q-
PCR dalam fermentor biogas. Sistem Aplikasi Mikrobiol 33: 78-84. doi:10.1016/
j.syapm.2009.11.004. PubMed: 20097028.
8. McOrist AL, Jackson M, Bird AR (2002) Perbandingan lima metode ekstraksi
DNA bakteri dari sampel tinja manusia. J Metode Mikrobiol 50: 131-139.
doi:10.1016/S0167-7012(02)00018-0. PubMed: 11997164.
9. Ariefdjohan MW, Savaiano DA, Nakatsu CH (2010) Perbandingan kit ekstraksi
DNA untuk analisis PCR-DGGE komunitas mikroba usus manusia dari
spesimen tinja. Kacang J 9 : 23. doi : 10.1186/1475-2891-9-23. PubMed:
20492702.
10. Yu Z, Morrison M (2004) Peningkatan ekstraksi DNA komunitas berkualitas
PCR dari sampel pencernaan dan tinja. BioTeknik 36: 808-812. PubMed:
15152600.
11. Geishauser T, Gitzel A (1996) Perbandingan sampel cairan rumen dengan probe oro-
ruminal versus fistula rumen. Batu Kecil Res 21 : 63-69.
doi:10.1016/0921-4488(95)00810-1.
12. de Menezes AB, Lewis E, O'Donovan M, O'Neill BF, Clipson N dkk.
(2011) Analisis mikrobioma sapi perah yang diberi pakan padang rumput atau
ransum campuran total. Mikrobiol FEMS Ekol 78: 256-265. doi:10.1111/j.
1574-6941.2011.01151.x. PubMed: 21671962.
[ PubMed ] 13. Pitta DW, Pinchak E, Dowd SE, Osterstock J, Gontcharova V dkk.
(2010) Dinamika keanekaragaman bakteri rumen terkait dengan perubahan pola
makan dari rumput bermuda menjadi gandum musim dingin yang digembalakan.
Mikroba Ekol 59: 511-522. doi:10.1007/s00248-009-9609-6. PubMed: 20037795.
14. Rius AG, Kittelmann S, Macdonald KA, Waghorn GC, Janssen PH dkk. (2012)
Metabolisme nitrogen dan pencacahan mikroba rumen pada sapi menyusui
dengan sisa asupan pakan berbeda yang diberi pakan padang rumput dengan
daya cerna tinggi. J Ilmu Susu 95: 5024-5034. doi:10.3168/jds.2012-5392.
PubMed: 22916906.
15. Kittelmann S, Janssen PH (2011) Karakterisasi komposisi komunitas ciliata
rumen pada domba, rusa, dan sapi peliharaan, yang diberi pakan bervariasi,
melalui PCR-DGGE dan perpustakaan klon. Mikrobiol FEMS Ekol 75: 468-481.
doi:10.1111/j.1574-6941.2010.01022.x.
PubMed: 21204869.
16. Kittelmann S, Naylor GE, Koolaard JP, Janssen PH (2012) Usulan taksonomi jamur
anaerob (kelas Neocallimastigomycetes) yang cocok untuk analisis struktur
komunitas berbasis urutan skala besar. PLOS SATU 7: e36866. doi:10.1371/
journal.pone.0036866. PubMed: 22615827.
17. Jeyanathan J, Kirs M, Ronimus RS, Hoskin SO, Janssen PH (2011)
Struktur komunitas metanogen dalam rumen peternakan domba, sapi, dan
rusa merah yang diberi pakan berbeda. Mikrobiol FEMS Ekol 76: 311-326.
doi: 10.1111/j.1574-6941.2011.01056.x. PubMed: 21255054.
[PubMed] 18. Kittelmann S, Seedorf H, Walters WA, Clement JC, Knight R dkk.
(2013) Urutan amplikon simultan untuk mengeksplorasi pola kemunculan
mikroorganisme bakteri, archaeal, dan eukariotik dalam komunitas mikroba
rumen. PLOS SATU 8: e47879. doi:10.1371/ jurnal.pone.0047879. PubMed:
23408926.
19. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD dkk. (2010)
QIIME memungkinkan analisis komunitas dengan throughput tinggi
PLOS SATU | www.plosone.org
Ekstraksi DNA Mikroba dari Isi Rumen
mengurutkan data. Metode Nat 7: 335-336. doi:10.1038/nmeth.f.303.
PubMed: 20383131.
20. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Alat pencarian
penyelarasan lokal dasar. J Mol Biol 215: 403-410. doi:10.1016/
S0022-2836(05)80360-2. PubMed: 2231712.
21. McDonald D, Harga MN, Goodrich J, Nawrocki EP, DeSantis TZ dkk.
(2012) Taksonomi Greengenes yang ditingkatkan dengan peringkat eksplisit
untuk analisis ekologi dan evolusi bakteri dan archaea. ISME J 6 : 610-618.
doi:10.1038/ismej.2011.139. PubMed: 22134646.
22. Janssen PH, Kirs M (2008) Struktur komunitas archaeal rumen. Mikrobiol
Lingkungan Aplikasi 74: 3619-3625. doi:10.1128/AEM.
02812-07. PubMed: 18424540.
23. Felsenstein J (1989) PHYLIP - Paket Inferensi Filogeni (Versi 3.2). Kladistik 5:
164-166.
24. Salonen A, Nikkilä J, Jalanka-Tuovinen J, Immonen O, Rajiliÿ Stojanoviÿ M
dkk. (2010) Analisis perbandingan metode ekstraksi DNA tinja dengan
microarray filogenetik: pemulihan efektif DNA bakteri dan archaeal
menggunakan lisis sel mekanis. J Metode Mikrobiol 81: 127-134. doi:10.1016/
j.mimet.2010.02.007. PubMed: 20171997.
25. McSweeney CS, Palmer B, McNeill DM, Krause DO (2001) Interaksi mikroba
dengan tanin: konsekuensi nutrisi bagi ruminansia. Pakan Anim Sci Technol
91:83-93. doi:10.1016/S0377-8401(01)00232-2.
26. Kontanis EJ, Reed FA (2006) Evaluasi efisiensi amplifikasi PCR real-time
untuk mendeteksi inhibitor PCR. J Ilmu Forensik 51: 795-804. doi: 10.1111/
j.1556-4029.2006.00182.x. PubMed: 16882221.
27. Willner D, Daly J, Whiley D, Grimwood K, Wainwright CE dkk. (2012)
Perbandingan metode ekstraksi DNA untuk profil komunitas mikroba dengan
aplikasi pada sampel lavage bronkoalveolar pediatrik. PLOS SATU 7: e34605.
doi:10.1371/journal.pone.0034605.
PubMed: 22514642.
28. Paul K, Nonoh JO, Mikulski L, Brune A (2012) "Methanoplasmatales", archaea terkait
Thermoplasmatales di usus rayap dan lingkungan lainnya, adalah metanogen urutan
ketujuh. Mikrobiol Lingkungan Aplikasi 78: 8245-8253. doi:10.1128/AEM.02193-12.
PubMed: 23001661.
29. Olson ND, Morrow JB (2012) Proses karakterisasi ekstrak DNA untuk
pengembangan dan validasi metode deteksi mikroba. Catatan Resolusi BMC
5: 668. doi:10.1186/1756-0500-5-668. PubMed: 23206278.
30. Lodge-Ivey SL, Browne-Silva J, Horvath MB (2009) Catatan teknis:
Keanekaragaman bakteri dan produk akhir fermentasi dalam sampel cairan
rumen dikumpulkan melalui lavage oral atau kanula rumen. J Anim Sains 87:
2333-2337. doi:10.2527/jas.2008-1472. PubMed: 19329475.
31. Shen JS, Chai Z, Song LJ, Liu JX, Wu YM (2012) Kedalaman penyisipan tabung
lambung oral dapat mempengaruhi parameter fermentasi cairan rumen yang
dikumpulkan pada sapi perah. J Ilmu Susu 95: 5978-5984. doi:10.3168/
jds.2012-5499. PubMed: 22921624.
32. Wright AD, Dehority BA, Lynn DH (1997) Filogeni rumen ciliates Entodinium,
Epidinium dan Polyplastron (Litostomatea:Entodiniomorphida) disimpulkan
dari rangkaian RNA ribosom subunit kecil. J Mikrobiol Eukariota 44: 61-67.
33. Dridi B, Henry M, El Khéchine A, Raoult D, Drancourt M (2009) Prevalensi
tinggi Methanobrevibacter smithii dan Methanosphaera stadtmanae terdeteksi
di usus manusia menggunakan protokol deteksi DNA yang ditingkatkan.
PLOS SATU 4: e7063. doi:10.1371/journal.pone.
0007063. PubMed: 19759898.
34. Lueders T, Manefield M, Friedrich MW (2004) Peningkatan sensitivitas pemeriksaan
isotop stabil berbasis DNA dan rRNA melalui fraksinasi dan analisis kuantitatif
gradien sentrifugasi isopiknik. Mikrobiol Lingkungan 6 : 73-78. PubMed: 14686943.
14 September 2013 | Jilid 8 | Edisi 9 | e74787