Naskah Diterima

Artikel

Pengaruh Pemberian Probiotik terhadap Produksi Susu, Komponen Susu

dan Mikrobiota Bakteri Kotoran Sapi Perah

Haiyan Xu, Weiqiang Huang, Qiangchuan Hou, Lai-yu Kwok, Zhihong Sun,
Huimin Ma, Feiyan Zhao, Yuan-Kun Lee, Heping Zhang

PII: S2095-9273 (17) 30200-1

DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.scib.2017.04.019
Referensi: SCIB 121

Untuk tampil di: Buletin Sains

Harap mengutip artikel ini sebagai: H. Xu, W. Huang, Q. Hou, Ly. Kwok, Z. Sun, H. Ma, F. Zhao, YK. Lee, H. Zhang,
Pengaruh Pemberian Probiotik pada Produksi Susu, Komponen Susu dan Mikrobiota Bakteri Tinja Sapi Perah,
Buletin Sains (2017), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.scib.2017.04.019

Ini adalah file PDF dari manuskrip yang belum diedit yang telah diterima untuk publikasi. Sebagai layanan kepada pelanggan kami,
kami menyediakan naskah versi awal ini. Naskah akan menjalani penyalinan, penyusunan huruf, dan peninjauan kembali bukti yang
dihasilkan sebelum diterbitkan dalam bentuk akhirnya. Harap dicatat bahwa selama proses produksi kesalahan dapat ditemukan
yang dapat mempengaruhi konten, dan semua penafian hukum yang berlaku untuk jurnal yang bersangkutan.
Pengaruh Pemberian Probiotik pada Produksi Susu,

Komponen Susu dan Mikrobiota Bakteri Tinja Sapi Perah

Haiyan Xu1 #, Weiqiang Huang1 #, Qiangchuan Hou1, Lai-yu Kwok1, Zhihong Sun1, Huimin
Ma1, Feiyan Zhao1, Yuan-Kun Lee2, Heping Zhang1 *
1 Laboratorium Utama Bioteknologi dan Rekayasa Perah, Kementerian Pendidikan, Batin

Universitas Pertanian Mongolia, Huhhot, Mongolia Dalam 010018, Cina.

2 Departemen Mikrobiologi, Universitas Nasional Singapura, Singapura

#
Para penulis ini memberikan kontribusi yang sama untuk pekerjaan ini

* Korespondensi: Heping Zhang, E-mail: hepingdd@vip.sina.com.

Abstrak

Pemberian probiotik dapat meningkatkan kesehatan tuan rumah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

efek probiotik (Lactobacillus casei Zhang dan Lactobacillus plantarum P-8)

pemberian pada produksi susu, komponen fungsional susu, komposisi susu, dan feses

mikrobiota sapi perah. Variasi mikrobiota bakteri feses antar perlakuan adalah

dinilai berdasarkan profil 16S rRNA yang ditentukan oleh molekul tunggal PacBio secara real-time

teknologi pengurutan. Suplementasi probiotik meningkatkan produksi ASI secara signifikan

produksi dan kandungan susu immunoglobulin G (IgG), laktoferin (LTF), lisozim

(LYS) dan laktoperoksidase (LP), sedangkan jumlah sel somatik (SCC) menurun secara signifikan

(P <0,01). Namun, tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan pada lemak susu, protein dan laktosa

isi (P> 0,05). Meskipun suplementasi probiotik tidak mengubah bakteri feses

kekayaan dan keragaman, secara signifikan lebih banyak bakteri fermentasi rumen (Bacteroides,

Roseburia, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus dan Dorea) dan bakteri menguntungkan

(Faecalibacterium prausnitzii) ditemukan pada kelompok perlakuan probiotik. Sementara itu,

beberapa patogen oportunistikmis Bacillus cereus, Cronobacter sakazakii dan Alkaliphilus

oremlandii, ditekan. Selain itu, kami menemukan beberapa korelasi antara susu

produksi, komponen susu dan bakteri feses. Singkatnya, penelitian kami mendemonstrasikan

efek menguntungkan dari aplikasi probiotik dalam meningkatkan kualitas dan kuantitas susu sapi

1
produksi.

Kata kunci: Produksi susu, Komponen Susu, Bakteri tinja, Probiotik, Sapi perah,

Teknologi pengurutan waktu nyata molekul tunggal PacBio

2
1. Perkenalan

Sapi perah adalah hewan ruminansia. Akuisisi nutrisi kelompok hewan ini

ditandai dengan mikroba- daripada degradasi pakan berbasis inang [1]. Saluran cerna

bidang hewan ruminansia menyimpan keragaman yang luas dari bakteri anaerob, ciliata

protozoa, jamur anaerobik, dan archaea, yang bertanggung jawab atas degradasi dan

fermentasi 70-75% dari senyawa makanan untuk menyediakan energi. Selulosa,

hemiselulosa dan lignin dihidrolisis dan diubah menjadi asam lemak rantai pendek

mudah diserap oleh tuan rumah. Sementara itu, mikroba ini juga membantu menghilangkan racun

diproduksi oleh proses metabolisme inang [2]. Karena peran usus sapi perah yang sangat krusial

mikrobiota dalam nutrisi dan perolehan energi, tidak diragukan lagi itu harus dianggap sebagai a

target peningkatan kesehatan, produksi dan mutu susu sapi selanjutnya.

Probiotik didefinisikan sebagai 'mikroorganisme hidup yang bila diberikan secara adekuat

jumlah memberikan manfaat kesehatan pada tuan rumah '[3]. Mereka bisa mengatur keseimbangan usus

mikroba, mendorong pertumbuhan dan perkembangan hewan, dan meningkatkan ketahanan inang

penyakit [4]. Sejak bakteri probiotik tradisional terdiri dari proporsi yang signifikan

mikroba rumen sapi, tidak mengherankan jika banyak penelitian sebelumnya telah meneliti

pengaruh pemberian probiotik pada sapi perah; dan sejauh ini, suplementasi probiotik telah dilakukan

terbukti mengubah pola fermentasi bakteri rumen, meningkatkan laju pemanfaatan pakan,

hasil susu dan profil komponen, dan meningkatkan asupan bahan kering [5, 6]. Bahkan,

Sun dkk. dan Qiao et al. menemukan bahwaBacillus subtilis meningkatkan hasil susu dan rumen

fermentasi sapi perah [7, 8]. Selain itu, Sun et al. melaporkan bahwa suplementasi

Bacillus subtilis natto dapat meningkatkan serum imunoglobulin (Ig) G dan interferon

(IFN) -gamma tingkat pada betis [9]. Saccharomyces cerevisiae dapat memodulasi fermentasi

mikroba rumen dan merangsang penyerapan laktat bakteri dan pencernaan selulosa in vitro

percobaan [10]. Namun, sebagian besar karya yang diterbitkan berfokus pada efek

Bacillus subtilis dan / atau Saccharomyces tentang kesehatan sapi perah; dan efek asam laktat

bakteri (BAL) pada mikobiota usus rumen dan rendemen serta kualitas susu yang dimiliki sapi perah

belum ditangani secara memadai.

Baru-baru ini, kemunculan teknik pengurutan throughput tinggi telah memperdalam kami

pengetahuan dan pemahaman di bidang komunitas mikroba dan ekologi. Terutama,

3
molekul tunggal Pacific Biosciences (PacBio), teknologi sekuensing waktu-nyata (SMRT) adalah

platform yang kuat yang lebih menguntungkan dari teknologi lain dalam menghasilkan urutan yang panjang

membaca dan profil mikrobiota komprehensif berdasarkan amplikon 16S rRNA lengkap [11,

12].

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai efek suplementasi probiotik

campuran (dua LAB berbeda, Lactobacillus casei Zhang dan Lactobacillus plantarum P-8) di

produksi susu, komposisi susu, dan mikrobiota feses sapi perah. Kami juga bertujuan untuk membuat profil

perubahan yang didorong probiotik pada mikrobiota rumen sapi perah di metagenomik filogenik

tingkat dengan menggunakan teknologi SMRT.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Hewan

Penelitian dilakukan di peternakan sapi perah komersial di dekat kota Zhangjiakou, sebelah utara

Provinsi Hebei, antara 12 Desember 2015 dan 12 Januari 2016. Semua prosedur melibatkan

hewan disetujui dan dilakukan sesuai dengan standar Institute of Animal

Sains, Universitas Pertanian Mongolia Dalam. Dua puluh orang Cina primipara menyusui

Sapi perah Holstein (60 hari pascapersalinan) dipilih dan dibagi menjadi dua (kontrol dan

pengobatan) kelompok. Hasil susu laktasi serupa pada awal percobaan. Untuk

memastikan semua hewan berbagi lingkungan perumahan yang sama, semua hewan disimpan dalam satu kandang,

memiliki akses gratis ke paddock terbuka yang terpisah. Semua sapi diberi pakan basal yang sama dengan a

total ransum campuran.

2.2. Suplementasi probiotik

Suplementasi probiotik diberikan pada kelompok perlakuan 60 hari setelah nifas

terus menerus selama 30 hari. Kelompok kontrol menerima diet basal tanpa probiotik

melengkapi seluruh. Setiap hewan yang diobati menerima 50 g / hari probiotik (mengandung 1,3 ×

109CFU / g suplementasi probiotik campuran) dicampur dengan diet basal. Siaran langsung

probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah Lactobacillus casei Zhang dan Lactobacillus plantarum P-8

(proporsi masing-masing strain adalah 1: 1) disediakan oleh Key Laboratory of Dairy Biotechnology dan

4
Teknik, Kementerian Pendidikan, Universitas Pertanian Mongolia Dalam di Cina. Itu

efek menguntungkan dari Lactobacillus casei Zhang dan Lactobacillus plantarum P-8 untuk manusia

telah ditampilkan sebelumnya [13, 14]. Strain ragi telah terbukti meningkatkan produksi susu

dan keragaman bakteri rumen pada sapi [15].

2.3. Pengambilan sampel dan analisis susu

Sapi diperah dua kali sehari di kandang ikat mereka pada pukul 09.00 dan 21.00; dan susu

hasil dicatat secara elektronik. Sampel susu (kurang lebih 50 ml) dari individu sapi

dikumpulkan pada hari pertama percobaan (hari ke-0, sebelum pemberian pakan), dan pada hari ke-15

dan hari ke 30 dari dua pemerahan. Kedua sampel yang diperah pada hari yang sama digabungkan di a

rasio 1: 1 (volume: volume) untuk memastikan representasi yang adil dari kualitas susu spesifik

hari sampel. Sampel disimpan pada suhu 4 ° C sampai analisis. Kandungan lemak, protein dan laktosa

ditentukan oleh MilkoTMScan (MilkoScan Type FT120, Foss Electric, Hillerød,

Denmark). Jumlah sel somatik (SCC) ditentukan dengan menggunakan Fossomatics 5000 (Foss

A / S analitis; Foss Electric, Hillerød, Denmark). Sandwich yang terkait dengan enzim

uji imunosorben (ELISA) digunakan untuk menentukan imunoglobulin G susu (IgG),

tingkat laktoferin (LTF), lisozim (LYS) dan laktoperoksidase (LP).

2.4. Pengumpulan sampel tinja dan ekstraksi DNA

Sampel feses 20 ekor sapi diambil pada hari ke 0 (sebelum suplementasi).

dan pada hari ke 30 (suplementasi pasca probiotik) dan disimpan pada suhu -80 ° C sampai analisis. Itu

Ekstraksi DNA genom dari sampel feses dilakukan dengan menggunakan alat QIAGEN DNAS

Mini-Kit (QIAGEN, Hilden, Jerman) mengikuti petunjuk pabrik [16]. Itu

Kualitas DNA genom yang diekstraksi diperiksa dengan elektroforesis gel agarosa dan

analisis spektrofotometri (kerapatan optik pada rasio 260 nm / 280 nm). Semua DNA yang diekstraksi

disimpan pada -20 ° C sampai percobaan lebih lanjut.

2.5. Analisis sekuensing waktu nyata molekul tunggal dari mikrobiota tinja

Sekuens gen 16S rRNA bakteri dari semua sampel DNA genom diurutkan, dan
5
Pengolahan data mentah dilakukan sesuai dengan uraian sebelumnya [17]. Alfa dan beta

keanekaragaman dihitung berdasarkan pohon taksonomi de novo yang dibangun oleh

perwakilan OTU yang diperiksa chimera menggunakan FastTree [18]. Shannon-Wiener,

Keragaman Simpson, Chao1 dan penduga penghalusan dilakukan untuk mengevaluasi

kedalaman urutan dan kekayaan keanekaragaman hayati. Koordinat kepala sekolah tertimbang dan tidak tertimbang

analisis (PCoA) berdasarkan jarak UniFrac [19] yang berasal dari pohon filogenetik itu

diterapkan untuk menilai struktur mikrobiota dari sampel yang berbeda. Data urutan yang dilaporkan di

studi ini telah disimpan dalam database MG-RAST (Aksesi No. 4733612.3,

4733614.3 sampai 4733652.3).

2.6. Analisis statistik

Semua data eksperimen dianalisis dengan perangkat lunak R (versi 3.1.3). Statistik

perbedaan yang signifikan diuji berdasarkan Uji Mann-Whitney secara berpasangan.

Nilai P di bawah 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Untuk menyesuaikan null yang ditolak secara salah

hipotesis, metode Benjamin-Hochberg mengontrol False Discovery Rate (FDR)

dihitung dengan membandingkan proporsi bakteri feses pada setiap tingkat filogenetik

secara terpisah [20]. Presentasi grafis dihasilkan oleh Graph Pad Prism 6. The

korelasi antara bakteri feses dan produksi susu, SCC dan parameter terukur lainnya

diwakili oleh koefisien korelasi peringkat Spearman dan divisualisasikan oleh peta panas di R

menggunakan paket "pheatmap".

3. Hasil
3.1. Komposisi susu, produksi susu dan SCC

Hasil analisis susu dirangkum dalam Tabel 1. Intervensi probiotik

menunjukkan tren peningkatan susu pada hari ke 15 (P =0,052) pasca aplikasi probiotik. Pada hari ke 30,

kenaikan menjadi signifikan (P <0,01), sedangkan produksi susu kelompok kontrol

tetap stabil selama percobaan. Perawatan probiotik juga diturunkan secara signifikan

SCC dalam kelompok perlakuan pada hari ke 15 dan hari ke 30 (P <0,01, Tabel 1). Tidak signifikan

perbedaan diamati dalam proporsi protein susu, lemak dan laktosa pada setiap titik waktu

6
setelah suplementasi probiotik.

3.2. Isi Susu IgG, LTF, LYS dan LP

Pengaruh suplementasi probiotik pada beberapa kandungan susu fungsional

komponen, IgG, LTF, LYS dan LP, disajikan pada Gbr. 1. IgG susu (Gbr. 1a) dan LP

(Gbr. 1d) konten meningkat secara signifikan pada hari ke 15 dan hari ke 30 dibandingkan dengan hari ke 0 sebelum

pengobatan probiotik. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, peningkatan pada dua parameter tersebut

juga signifikan. Tingkat LTF (pada hari ke 15) (Gbr. 1b) dan LYS (pada hari ke 15 dan hari

30) (Gbr. 1c) secara signifikan lebih tinggi pada probiotik dibandingkan dengan kelompok kontrol.

3.3 Urutan cakupan dan keanekaragaman bakteri

Sekuensing SMRT dari gen 16S rRNA dengan panjang penuh menghasilkan 171.632 bacaan dari

40 sampel, dengan rata-rata 4.290 bacaan untuk setiap sampel. Jumlah total unik dan

urutan OTU yang dapat diklasifikasikan untuk bakteri adalah 93.042 (rata-rata = 180 OTU per

sampel, rentang = 48-304, SD = 59, Tabel S1, online). Kurva keanekaragaman Shannon-Wiener

menunjukkan bahwa kedalaman urutan yang diperoleh cukup untuk semua sampel, meskipun lebih jauh

sekuensing mungkin mengidentifikasi filotipe baru berdasarkan kurva penghalusan (Gbr. S1, online).

Hasil dari indeks keanekaragaman secara menarik mencerminkan bahwa kekayaan bakteri dan

keragaman kelompok kontrol menurun secara signifikan pada akhir percobaan (P <0,01). Di

Sebaliknya, kelompok perlakuan mempertahankan tingkat indeks keanekaragaman yang sama setelah probiotik

pengobatan (P <0,01) (Gbr. 2).

3.4. Analisis koordinat kepala sekolah

Analisis PCoA berdasarkan jarak UniFrac tertimbang dan tidak tertimbang (Gbr. 3)

mengungkapkan perbedaan struktural bakteri yang jelas antara sebelum dan sesudah probiotik

intervensi. Simbol yang mewakili kelompok perlakuan sebelum dan sesudah probiotik

administrasi sebagian besar dipisahkan pada kedua plot PCoAscore dengan hanya sedikit tumpang tindih.

Simbol yang mewakili komunitas bakteri dari sapi kontrol juga dibagikan

dari kelompok yang diobati dengan probiotik.

3.5. Perubahan komposisi mikroba setelah pemberian probiotik

7
 Secara kolektif, 12 filum bakteri, 143 genera, dan 284 spesies diidentifikasi dalam tinja

sampel sapi perah. Pada tingkat filum, Firmicutes, Bacteroidetes dan Proteobacteria

adalah tiga filum dominan, mewakili 83,52%, 12,07% dan 4,16% dari semua urutan,

masing-masing (Gambar S2, online). Setelah penyesuaian untuk hipotesis nol yang ditolak secara salah, ada

tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik dalam proporsi relatif antara perlakuan dan kontrol

kelompok sebelum dan sesudah pengobatan. Namun, berdasarkan nilai P yang tidak disesuaikan, terdapat perbedaan

dalam kelimpahan relatif dari tiga filum utama terlihat jelas. Padahal kelimpahan itu

Filum Firmicutes meningkat baik pada kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan, peningkatan pada kelompok

kelompok kontrol lebih jelas. Tren berlawanan diamati di filum

Bacteroidetes. Kelimpahan filum Proteobacteria juga meningkat pada kedua kelompok di

hari ke 30 (Gbr. 4).

Distribusi urutan 16S ditugaskan ke tingkat genus dianalisis dan

diwakili dalam Gambar 5 (hanya genera dengan ≥ 0,1% dari total urutan ditampilkan). Besar

variasi individu diamati. Beberapa genera tampaknya meningkat setelah probiotik

pengobatan, termasuk Bacillus, Paenibacillus, Enterococcus, Cronobacter dan Alkaliphilus,

sementara genera lain tertindas (termasuk Bacteroides, Faecalibacterium, Lactobacillus,

Roseburia, Ruminococcus, Clostridium Coprococcus dan Dorea). Namun, hal itu perlu diperhatikan

perbedaan yang signifikan secara statistik hanya terdeteksi pada struktur mikrobiota tinja

kelompok kontrol tetapi tidak pada kelompok perlakuan pada hari ke 0 dan hari ke 30 (Tabel S2, online).

Bersama-sama dari semua sampel, 37 spesies memiliki kelimpahan relatif> 0,1%. Secara signifikan

lebih Bacillus cereus, Cronobacter sakazakii dan Alkaliphilus oremlandii ditemukan di siang hari

30 dibandingkan dengan hari ke-0 untuk kelompok kontrol dan perlakuan. Sebaliknya, beberapa spesies

itu Bacteroides genus (mis Bacteroides plebeius, Bacteroides dorei dan Bacteroides uniformis)

menurun secara signifikan pada kelompok kontrol tetapi tidak pada kelompok perlakuan pada hari ke-30 (dibandingkan hari ke-0). Itu

kelimpahan garis keturunan ini secara signifikan lebih tinggi pada perlakuan dibandingkan kelompok kontrol.

Tren serupa diamati pada kelimpahan Ruminococcus gnavus, Ruminococcus

bromii, Roseburia hominis, Faecalibacterium prausnitzii dan Lactobacillus rogosae (Meja

S3, online).

8
3.6. Korelasi antara bakteri feses, produksi susu, SCC, dan komponen susu lainnya

Beberapa perubahan dalam kelimpahan bakteri berkorelasi dengan produksi susu,

SCC, komponen susu fungsional yang ditentukan oleh analisis korelasi rank Spearman (Gbr.

6). Konsentrasi susu dari LYS dan IgG berhubungan secara signifikan dan negatif

kelimpahan Bacillus cereus. Hasil susu berkorelasi signifikan dan negatif

dengan Bacillus cereus, Paenibacillus barcinonensis dan Paenibacillus odorifer. Itu

konsentrasi LP berkorelasi positif dengan beberapa spesies yang termasuk dalam genera

Bacteroides, Ruminococcus, dan Roseburia, sementara berkorelasi negatif dengan anggota

Bacillus, Brevibacillus dan Paenibacillus genera. Tren korelasi berlawanan diamati

untuk SCC (Gbr. 6).

4. Diskusi

Studi ini menyelidiki efek suplementasi campuran probiotik (Lactobacillus casei

Zhang dan Lactobacillus plantarum P-8) tentang produksi susu, komposisi susu, beberapa

komponen fungsional dan komunitas mikroba feses sapi perah. Banyak penelitian telah dilakukan

menunjukkan bahwa mikroorganisme tertentu dapat memberikan efek menguntungkan bagi inang dan karenanya

meningkatkan kinerja produksi sapi perah [21-23]. Selanjutnya, mengelola

probiotik dapat membantu menjaga keseimbangan mikrobiota usus dan bahkan meningkatkan rumen

komposisi bakteri [1, 15]. Namun, banyak dari studi ini yang menerapkan spesies tersebutBasil

subtilis dan Saccharomyces cerevisiae sebagai regangan probiotik, dan efek menguntungkan dari

LAB belum diselidiki secara memadai.

Pekerjaan kami menunjukkan bahwa aplikasi campuran probiotik dapat meningkatkan produksi susu

menekan SCC. Komposisi utama susu, termasuk protein, lemak, dan kandungan laktosa,

tetap sama sebelum dan sesudah pengobatan probiotik. Efek menguntungkan kemungkinan besar terkait

untuk mikrobiota rumen yang diperbaiki tunduk pada pengobatan probiotik. Contohnya,

asam amino yang diturunkan dari mikroba dapat membentuk hingga dua pertiga dari asam amino yang diserap

Dari usus halus hewan pemamah biak, beberapa bakteri rumen telah dicirikan sebagai yang poten

bakteri penghasil proteolitik dan / atau amonia (Clostridial spesies) [24]. SCC adalah a

indikator utama peradangan kelenjar susu dan mastitis, yang berhubungan langsung dengan

9
kualitas susu. Mayoritas sel somatik adalah leukosit yang berpindah ke kelenjar susu

dan jaringan terkait karena peradangan lokal. Nilai SCC lebih rendah dalam perawatan

sapi dibandingkan dengan sapi kontrol, menunjukkan mastitis pada kawanan yang dirawat lebih rendah, mungkin memang demikian

kecil kemungkinannya ada kesempatan untuk menurunkannya lebih jauh. Pengurangan SCC tunduk pada

Pemberian probiotik menunjukkan bahwa pengobatan tersebut dapat menurunkan kelenjar susu

peradangan pada sapi perah dan kemudian meningkatkan produksi susu seperti yang ditunjukkan juga oleh kami

hasil.

Meskipun kami menunjukkan bahwa suplementasi probiotik dapat meningkatkan peradangan ambing dan

produksi susu tetapi bukan komposisi susu, beberapa acara yang dilaporkan saat ini diterbitkan

temuan yang tidak konsisten. Misalnya, beberapa penelitian menunjukkan pemberian probiotik pada produk susu

sapi meningkatkan produksi susu dan sekaligus meningkatkan lemak susu, protein dan

hasil laktosa, disertai dengan penurunan SCC susu [21, 9]. Dua penelitian lain tidak menemukan

perubahan signifikan dalam lemak susu dan protein, laktosa tunduk pada suplementasi mikroba

[22, 7]. Mungkin, faktor yang berbeda berkontribusi pada perbedaan tersebut. Sejak percobaan itu

dilakukan oleh laboratorium yang berbeda dan dalam kondisi eksperimental yang berbeda. Sejumlah

faktor yang berkaitan dengan percobaan berbeda, termasuk preparasi campuran probiotik, yaitu

faktor khusus host seperti usia, tahap fisiologis, kesehatan, pola makan subjek

hewan. Selain itu, sangat mungkin bahwa efek menguntungkan yang terlihat adalah probiotik

strain tertentu.

Kami juga memantau perubahan beberapa komponen fungsional susu, termasuk IgG,

LP, LTF, dan LYS. IgG susu berasal dari darah; molekul diangkut

melintasi sel-sel alveolar mammae yang dimediasi oleh mekanisme reseptor aktif. Yang paling disukai,

pengobatan probiotik meningkatkan tingkat IgG plasma (seperti yang dilaporkan juga oleh Sun P [9]), dan

karenanya lebih banyak molekul ini diangkut ke area ambing. Apalagi spesiesnya

Lactobacillus casei secara signifikan meningkatkan tingkat IgG pada sapi perah, meskipun peningkatan tersebut

hanya terlihat dengan kombinasi dengan vaksin babesiosis [25].

Komponen fungsional terukur lainnya, LTF, LYS dan LP, disintesis oleh

sel epitel dari kelenjar susu sebelum diangkut ke sekretori susu

sel. Laktoferin dapat melepaskan peptida antimikroba, laktoferrisin, tunduk pada proteolitik

pembelahan, dan berfungsi menekan mikroba lain. Laktoperoksidase mengkatalisis oksidasi

10
tiosianat (SCN-) dengan adanya H.2HAI2 untuk menghasilkan zat antara antimikroba, sementara

beberapa Lactobacillus dapat menghasilkan H.2HAI2 [26]. Meskipun kami menemukan korelasi antara ini

faktor fungsional dan beberapa mikroba feses yang teridentifikasi setelah suplementasi probiotik,

apakah ada hubungan sebab akibat di antara mereka dan mekanisme di baliknya tetap ada

tidak jelas.

Data kami menunjukkan bahwa pengobatan probiotik tidak menyebabkan perubahan pada bakteri

kekayaan dan keanekaragaman mikrobiota, yang konsisten dengan studi lain yang diterbitkan [27],

sedangkan penurunan indeks keanekaragaman yang signifikan terlihat pada sapi kontrol pada hari ke-30

Hasil penelitian menggambarkan bahwa aplikasi probiotik dapat menjaga kekayaan komunitas bakteri

dan sejumlah besar spesies berbeda. Pada plot skor PCoA, simbol mewakili

kelompok kontrol pada hari ke-30 membentuk kelompok yang berbeda, menunjukkan bahwa mikrobiota tinja ini

subkelompok berbeda dari sampel lain. Kemungkinan, hilangnya kekayaan mikroba dan

keragaman itu disebabkan oleh tingginya bulir dan rendahnya pakan kasar yang diberikan kepada sapi, sehingga menyebabkan

perubahan populasi mikroba rumen [28]. Sebaliknya, suplemen probiotik mengandung a

beragam gen / enzim penghidrolisis karbohidrat yang membantu dalam memaksimalkan pakan

pemanfaatan dan mendukung keanekaragaman mikroba.

Firmicutes adalah filum yang paling umum dalam dataset kami, khususnya kontrol

dibandingkan dengan kelompok perlakuan pada hari ke 30, seperti pada hasil yang dipublikasikan lainnya [29-31].

Bacteroidetes juga sering ditemukan sebagai filum dominan lain dalam rumen sapi perah

[32, 33]; kelimpahan filum ini sangat rendah pada hari ke-30 (dibandingkan dengan pada hari ke-0)

sapi kontrol. Alasan penurunan yang nyata tidak jelas. Mungkin, butiran tinggi rendah

pakan kasar yang diumpankan ke sapi selama percobaan mengurangi proporsi Bacteroidetes

[34]. Sampel dari kelompok perlakuan (pada hari ke 30) memiliki tingkat Bacteroidetes yang diperkaya

sementara mengurangi kelimpahan Firmicutes dan Proteobacteria. Biasanya, proporsi

Proteobacteria kurang dari 4% dari total komunitas rumen [35]; dan meningkat

Populasi proteobakteri dapat menyebabkan asidosis rumen subakut [30]. Hasil seperti itu ditunjukkan

bahwa probiotik mungkin berkontribusi pada keseimbangan mikroorganisme rumen di filum

tingkat.

Kami menemukan probiotik yang digunakan dalam penelitian ini menstabilkan mikrobiota usus dan mengurangi

risiko kolonisasi patogen. Meskipun pengobatan probiotik tidak membuahkan hasil

11
 Perubahan komposisi mikrobiota feses yang signifikan pada tingkat genus dan spesies, yaitu

perbedaan antara kelompok perlakuan dan kontrol pada hari ke-30 sangat mencolok. Basil,

Enterococcus, Cronobacter dan Alkaliphilus pada kelompok kontrol meningkat, sementara beberapa

bakteri pencernaan seperti rumen Bacteroides, Roseburia, Ruminococcus, Clostridium,

Coprococcus dan Dorea menurun. Hal tersebut menunjukkan bahwa sapi mengalami dysbiosis dengan karakteristik rendah

kelimpahan Clostridium dan Ruminococcus dan konten tinggi Basil dan

Enterococcus, menyebabkan malabsorpsi, diare, dan penurunan berat badan [36]. Jauh lebih banyak

Bacillus cereus ditemukan dalam kontrol dibandingkan dengan kelompok perlakuan, yang dianggap

sebagai kontaminan umum dalam susu [37] dan faktor predisposisi untuk pengembangan klinis

mastitis [38]. Bakteri mungkin ada untuk sementara waktu di mamalia saluran usus, atau,

sebagai alternatif bertindak sebagai patogen oportunistik yang terlibat dalam infeksi lokal dan sistemik

[39]. Selain itu, kami mengidentifikasi beberapa patogen oportunistik lain misalnyaCronobacter

sakazakii, Alkaliphilus oremlandii [40, 41] yang secara signifikan lebih sedikit dalam pengobatan

dibandingkan kelompok kontrol pada hari ke-30.

Di sisi lain, salah satu fungsi penting dari mikroba rumen adalah untuk mendegradasi

selulosa, pati hemiselulosa, serat dan peptida [42]. Kelompok perlakuan probiotik memiliki

proporsi yang lebih tinggi dari bakteri fermentatif rumen, seperti Bacteroides uniformis,

Ruminococcus gnavus dan Roseburia hominis, yang dapat meningkatkan fermentasi rumen

kapasitas. Pengayaan bakteri selulolitik dengan pengobatan probiotik sebelumnya telah dilakukan

melaporkan [43]. Selain itu, banyaknya bakteri menarik lainnya,Faecalibacterium

prausnitzii, meningkat pada kelompok perlakuan. Bakteri ini meningkatkan berat badan dan

mengurangi kejadian diare [44]. Komposisi mikrobiota ini berubah pada

suplementasi probiotik mengarahkan mikrobiota ruminal ke keadaan seimbang dan sehat

berpotensi meningkatkan fermentasi dan menurunkan risiko penyakit pada sapi menyusui [45]

Kami juga menemukan bahwa beberapa korelasi antara beberapa variasi yang digerakkan oleh probiotik

mikroba feses dan parameter yang diteliti (termasuk produksi susu, SCC dan susu

komponen fungsional), menunjukkan bahwa bakteri usus mungkin terkait dengan perubahan

dalam parameter ini setelah pengobatan probiotik. Diketahui bahwa mikrobiota usus berperan

peran penting dalam kesehatan sapi, jika ususnya terinfeksi, sapi perah akan sering mengalami gangguan kesehatan

pencernaan dan berkurangnya penyerapan nutrisi dan masalah pencernaan ini sering kali muncul
12
menjadi diare. Lactobacillus telah dikaitkan dengan peningkatan resistensi terhadap infeksi dan diare

penyakit dan stimulasi aktivitas sistem kekebalan, kemungkinan karena komposisi kimianya

dan struktur komponen dinding selnya. Memang, beberapaLactobacillus bentuk spesies

zat yang antagonis terhadap organisme lain, seperti asam organik dan bakteriosin,

karenanya probiotik kami meningkatkan parameter susu dengan cara menjaga stabilitas bakteri rumen. [46].

Selain itu, beberapa anggota Bacteroides, Roseburia, Ruminococcus dan rumen lainnya

bakteri pencernaan dapat menghidrolisis pakan dan meningkatkan penyerapan nutrisi [42], yang mana bisa

telah menyebabkan peningkatan komponen fungsional susu dan menghasilkan hal yang positif

korelasi. Makalah sebelumnya telah mengkonfirmasi peningkatan kekebalan pada sapi secara positif

berkorelasi dengan konsentrasi IgG [47]. Bakteri ini menurunkan SCC dan

menyebabkan korelasi negatif. SCC merupakan penanda penting dari kelenjar susu

peradangan, kinerja dan kondisi kesehatan sapi perah terkait dengan karakteristik

perubahan mikrobiota rumen [48, 49]. Juga, kemampuan suplementasi probiotik hidup

dalam meningkatkan produksi susu dan pertambahan bobot pada sapi diiringi dengan pergeseran jurusan

kelompok bakteri dalam komunitas [1]. Sebaliknya, kelimpahan meningkat

Bacillus cereus mungkin telah meningkatkan SCC dan menurunkan produksi ASI dan

komponen fungsional [39]. Bacillus cereus adalah agen penyebab pada mastitis gangren [43].

Dengan demikian, suplementasi probiotik yang digunakan dalam percobaan ini dapat memodulasi rumen

komposisi dan struktur mikrobiota, mengarahkan menuju status yang lebih stabil dan lebih sehat.

Secara keseluruhan penelitian ini menunjukkan bahwa sediaan probiotik kami mampu meningkatkan

produksi susu dan zat fungsional sementara itu mengurangi SCC. Bakteri tinja

mikrobiota berbeda nyata dari kelompok kontrol tanpa menerima probiotik.

Kelompok perlakuan dikarakterisasi dengan lebih banyak bakteri pencernaan rumen, termasuk

anggota dari Bacteroides, Roseburia, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus dan DoreSebuah,

sementara patogen yang kurang oportunistiks Bacillus cereus, Cronobacter sakazakii dan Alkaliphilus

oremlandii.

Konflik kepentingan

Penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan.

13
Pengakuan

Pekerjaan ini didukung oleh Sistem Penelitian Pertanian China (CARS-37) dan

Proyek Utama di wilayah Otonomi Mongolia Dalam.

Referensi

[1] Pinloche E, McEwan N, Marden JP, dkk. Efek ragi probiotik pada bakteri

keanekaragaman dan struktur populasi di dalam rumen ternak. Plos One, 2013, 8 (7): e67824.

[2] Jouany JP. Mengoptimalkan fungsi rumen pada periode transisi close-up dan awal

laktasi untuk mendorong asupan bahan kering dan keseimbangan energi pada sapi. AnimReprod Sci, 2006, 96:

250-264

[3] McFarland LV. Dari yak ke yogurt: Sejarah, perkembangan, dan penggunaan saat ini

probiotik. Clin Infect Dis, 2015, 60: S85-S90

[4] Sarowska J, Choroszy-Krol I, Regulska-Ilow B, dkk. Efek terapeutik probiotik

bakteri pada penyakit gastrointestinal. Adv Clin Exp Med, 2013, 22: 759-766

[5] Stein DR, Allen DT, Perry EB, dkk. Pengaruh pemberian propionibacteria pada sapi perah

produksi susu, komponen susu, dan reproduksi. J Dairy Sci, 2006, 89: 111-125

[6] Stella AV, Paratte R, Valnegri L, dkk. Pengaruh administrasi hidupSaccharomyces

Cerevisiae pada produksi susu, komposisi susu, metabolit darah, dan flora feses secara dini

kambing perah menyusui. Res Ruminansia Kecil, 2007, 67: 7-13

[7] Qiao GH, Shan AS, Ma N, dkk. Pengaruh tambahanBasil budaya di rumen

fermentasi dan hasil susu pada sapi holstein Cina. J Anim Physiol an N, 2010, 94:

429-436

[8] Sun P, Wang JQ, Deng LF. Efek dariBacillus subtilis natto pada produksi susu, rumen

fermentasi dan mikrobioma rumen sapi perah. Hewan, 2013, 7: 216-222

[9] Ming P, Wang JQ, Zhang HT. Efek suplementasiBacillus subtilis natto Na dan

Strain N1 pada perkembangan rumen pada anak sapi perah. Anim Feed Sci Tech, 2011, 164: 154-160

[10] Callaway ES, Martin SA. Efek dari aSaccharomyces Cerevisiae budaya di ruminal

bakteri yang memanfaatkan laktat dan mencerna selulosa. J Dairy Sci, 1997, 80: 2035-2044

[11] Hou QC, Xu HY, Zheng Y, dkk. Evaluasi kontaminasi bakteri dalam susu mentah,

susu suhu sangat tinggi dan susu formula bayi menggunakan molekul tunggal, pengurutan waktu-nyata
14
teknologi. J Dairy Sci, 2015, 98: 8464-8472

[12] Mosher JJ, Bernberg EL, Shevchenko O, dkk. Khasiat generasi ke-3

platform sekuensing throughput tinggi untuk analisis gen 16s rRNA dari lingkungan

sampel. J Microbiol Meth, 2013, 95: 175-181

[13] Kwok LY, Wang L, Zhang J, dkk. Sebuah studi percontohan tentang pengaruhLactobacillus casei

zhang pada parameter mikrobiota usus pada subjek Cina dari usia yang berbeda. Manfaat

Mikroba, 2014, 5: 295-304

[14] Wang L, Zhang J, Guo Z, dkk. Pengaruh konsumsi oral probiotikLactobacillus

planatarum p-8 pada mikrobiota tinja, SIgA, SCFAs, dan TBAS orang dewasa dari berbagai usia.

Nutrisi, 2014, 30: 776-783

[15] Wallace RJ. Mikrobiologi rumen, bioteknologi dan nutrisi ruminansia: The

penerapan temuan penelitian ke ekosistem mikroba yang kompleks. Mikrobiologi FEMS

Letters, 1992, 79: 529-534

[16] Tanaka S, Kobayashi T, Songjinda P, dkk. Pengaruh paparan antibiotik di awal

periode postnatal tentang perkembangan mikrobiota usus. Fems Immunol Med Mic, 2009,

56: 80-87

[17] Li J, Xu HY, Sun ZH, dkk. Pengaruh intervensi diet pada mikrobiota usus

host Mongolia. Sci Bull, 2016, 61 (20): 1605-1614

[18] Harga MN, Dehal PS, Arkin AP. Fasttree: Menghitung pohon evolusi minimum yang besar dengan

profil, bukan matriks jarak. Mol Biol Evol, 2009, 26: 1641-1650

[19] Lozupone C, Knight R. Unifrac: Sebuah metode filogenetik baru untuk membandingkan mikroba

komunitas. Appl Environ Microb, 2005, 71: 8228-8235

[20] Benjamini Y, Hochberg Y. Mengontrol tingkat penemuan palsu - cara yang praktis dan ampuh

pendekatan untuk beberapa pengujian. Jurnal Royal Statistics Society, 1995, 57: 289-300

[21] Lehloenya KV, Stein DR, Allen DT, dkk. Pengaruh makan ragi dan propionibacteria

untuk sapi perah tentang produksi dan komponen susu, dan reproduksinya. J Anim Physiol an N, 2008,

92: 190-202

[22] Moallem U, Lehrer H, Livshitz L, dkk. Efek suplementasi ragi hidup terhadap

sapi perah selama musim panas mengenai produksi, efisiensi pakan, dan daya cerna. J Susu Sci,

2009, 92: 343-351

15
[23] Peng H, Wang JQ, Kang HY, dkk. Pengaruh pemberian makanBacillus subtilis natto fermentasi

produk pada produksi dan komposisi susu, metabolit darah dan fermentasi rumen

sapi perah laktasi dini. J Anim Physiol an N, 2012, 96: 506-512

[24] Dewhurst R, Davies D dan Merry R. Pasokan protein mikroba dari rumen. Ani m

Umpan Sci Technol, 2000, 85: 1–21

[25] CR Bautista-Garfias, Lozano AR, Martinez CR, dkk. Ko-imunisasi ternak dengan a

vaksin melawan babesiosis dan Lactobacillus casei inmeningkatkan tingkat IgG1 spesifik pada babesia

bovis dan B. Bigemina. Parasitol Int, 2015, 64: 319-323

[26] Shah NP. Pengaruh bioaktif yang diturunkan dari susu: Gambaran umum. Jurnal Gizi Inggris,

2000, 84 Suppl 1: S3-S10

[27] Garcia-Mazcorro JF, Lanerie DJ, Dowd SE, dkk. Pengaruh sinbiotik multi-spesies

formulasi mikrobiota bakteri feses kucing dan anjing sehat seperti yang dievaluasi oleh

pyrosequencing. Fems Microbiol Ecol, 2011, 78: 542-554

[28] Hook SE, Steele MA, Northwood KS, dkk. Dampak asidosis rumen subakut (sara)

adaptasi dan pemulihan kepadatan dan keanekaragaman bakteri dalam rumen sapi perah.

Fems Microbiol Ecol, 2011, 78: 275-284

[29] Durso LM, Harhay GP, Smith TPL, dkk. Variasi hewan-ke-hewan dalam mikroba tinja

keragaman di antara sapi potong. Appl Environ Microb, 2010, 76: 4858-4862

[30] Khafipour E, Li SC, Plaizier JC, dkk. Komposisi mikrobioma rumen ditentukan dengan menggunakan

dua model nutrisi asidosis rumen subakut. Microb Lingkungan Appl, 2009, 75:

7115-7124

[31] Sadet-Bourgeteau S, Martin C, Morgavi DP. Dinamika keanekaragaman bakteri dalam rumen

epitel wethers yang diberi pakan hijauan dan pakan konsentrat campuran. Dokter hewan

Mikrobiologi, 2010, 146: 98-104

[32] Fernando SC, Purvis HT, Najar FZ, dkk. Dinamika populasi mikroba rumen selama

adaptasi untuk diet tinggi biji-bijian. Appl Environ Microb, 2010, 76: 7482-7490

[33] Kong YH, Teather R, Forster R. Komposisi, distribusi spasial, dan keragaman

komunitas bakteri di rumen sapi yang diberi pakan hijauan berbeda. FEMS Microbiol Ecol,

2010, 74: 612-622

[34] Gonzalez LA, Manteca X, Calsamiglia S, dkk. Asidosis rumen pada sapi penggemukan:
16
Interaksi antara bahan pakan, fungsi rumen dan perilaku makan (review). Anim

Pakan Sci Tech, 2012, 172: 66-79

[35] Pitta DW, Pinchak WE, Dowd SE, dkk. Dinamika keragaman bakteri rumen terkait

dengan perubahan dari jerami bermudagrass menjadi makanan gandum musim dingin yang digembalakan. Microb Ecol, 2010, 59:

511-522

[36] Yu ZT, Yu M, Morrison M. Peningkatan analisis serial tag urutan ribosom v1

(sarst-v1) memberikan karakterisasi bakteri berbasis urutan yang cepat, komprehensif

keragaman dan komposisi komunitas. Lingkungan Microbiol, 2006, 8: 603-611

[37] Christiansson A, Bertilsson J, Svensson B. Bacillus cereus spora dalam susu mentah: Faktor

mempengaruhi kontaminasi susu selama periode penggembalaan. J Dairy Sci, 1999, 82: 305-314

[38] Jones TO, Turnbull PC. Mastitis sapi yang disebabkan oleh bacillus cereus. Rekam Kedokteran Hewan,

1981, 108: 404-405

[39] Arnesen LPS, Fagerlund A, Granum PE. Dari tanah ke usus: Bacillus cereus dan makanannya

meracuni racun. FEMS Microbiol Rev, 2008, 32: 579-606

[40] Dumen E. Cronobacter sakazakii (Enterohacter sakazakii): Hanya masalah bayi?

Kafkas Ün̈iversitesi Veteriner Fakül̈tesi Dergisi, 2010, 16: S171-S178

[41] Pramanik N, Mukherjee K, Nandy A, dkk. Analisis perbandingan properti yang berbeda

polihidroksialkanoat diisolasi dari dua strain bakteri yang berbeda: Alkaliphilus

oremlandii ohilas dan rekombinan Escherichia coli xl1b. J Appl Polym Sci, 2014,

131 (22): 547-557

[42] Fecteau ME, Pitta DW, Vecchiarelli B, dkk. Disbiosis mikrobiota tinja pada sapi

terinfeksi dengan Mycobacterium avium subsp paratuberculosis. Plos One, 2016, 11 (8)

[43] Nocek JE, Kautz WP. Suplementasi mikroba yang diberi makan langsung pada pencernaan rumen, kesehatan,

dan performa sapi perah sebelum dan sesudah melahirkan. J Dairy Sci, 2006, 89: 260-266

[44] Oikonomou G, Teixeira AGV, Foditsch C, dkk. Keragaman mikroba tinja pada pra-penyapihan

anak sapi perah seperti yang dijelaskan dengan pyrosequencing dari metagenomic 16s rDNA. Asosiasi dari

spesies bakteri feses dengan kesehatan dan pertumbuhan. PLOS One, 2013, 8 (4): 7377-7382

[45] Nocek JE, Kautz WP, Leedle JAZ, dkk. Suplementasi rumen yang diberi makan langsung

mikroba pada variasi ph diurnal dan pencernaan in situ pada sapi perah. J Dairy Sci, 2002, 85:

429-433
17
[46] Vizoso Pinto MG, Rodriguez Gómez M, Seifert S, dkk. Lactobacilli merangsang bawaan

respon imun dan memodulasi ekspresi TLR sel epitel usus HT29 di

vitro. Int. J. Food Microbiol, 2009, 133: 86–93

[47] Quigley JD, Wolfe TM. Pengaruh semprotan plasma hewan kering dalam pengganti susu anak sapi

kesehatan dan pertumbuhan anak sapi perah. J Dairy Sci, 2003, 86: 586–592

[48] Newbold CJ, Wallace RJ, Chen XB, dkk. Strain yang berbeda dariSaccharomyces cerevisiae

berbeda dalam pengaruhnya terhadap jumlah bakteri rumen in vitro dan pada domba. Jurnal Hewan

Sains, 1995, 73: 1811-1818

[49] Nocek JE. Asidosis sapi: Implikasi pada laminitis. J Dairy Sci, 1997, 80: 1005-1028

Legenda tokoh

Gambar 1 Konsentrasi komponen fungsional susu (a: imunoglobulin G, b: laktoferin, c:

lisozim dan d: laktoperoksidase) dalam kelompok kontrol dan perlakuan probiotik (*P <0,05,

* *P <0,01, ***P <0,001).

Gambar 2 Perubahan keragaman alfa mikrobiota feses sapi perah tunduk pada probiotik

pengobatan (**P <0,01).

Gambar 3 Tertimbang (a) dan tidak tertimbang (b) analisis koordinat utama UniFrac dari bakteri

komunitas sebelum (BF) dan setelah (AF) pemberian probiotik

Gambar 4 Perubahan komposisi mikrobiota feses di tingkat filum tunduk pada pengobatan probiotik

Gambar 5 Peta panas menunjukkan perubahan dalam genera bakteri utama yang tunduk pada pemberian probiotik.

Catatan: Kode subjek ditampilkan di sebelah kanan; 'B' dan 'A' menunjukkan sebelum dan sesudah probiotik

administrasi, masing-masing.

Gambar 6 Peta panas menunjukkan korelasi antara spesies bakteri tinja yang berubah secara signifikan

antara kapasitas produksi susu dan berbagai komponen susu (*P <0,05, **P <0,01,

* * *P <0,001).

Tabel 1 Pengaruh suplementasi probiotik terhadap produksi dan komposisi susu sapi

18
 Hari 0 Hari 15 Hari 30

Diobati Kontrol P-nilai Kelompok yang dirawat Kontrol P-nilai Kelompok yang dirawat Kontrol P-nilai
kelompok kelompok kelompok kelompok

Hasil susu (kg) 23.79 ± 4.11 23.75 ± 3.99 NS 27.82 ± 3.19 25.28 ± 2.87 0,052 33.43 ± 4.54Sebuah 24,35 ± 3,70 <0,01
Lemak (%) 4.01 ± 0.11 3,79 ± 0,09 NS 3.34 ± 0.21 3,42 ± 0,12 NS 3,48 ± 0,23 3,56 ± 0,17 NS
Protein (%) 3,26 ± 0,17 3.27 ± 0.23 NS 3,31 ± 0,14 3.42 ± 0.20 NS 3.40 ± 0.21 3,45 ± 0,13 NS
Laktosa (%) 5.18 ± 0.11 5,25 ± 0,07 NS 5.15 ± 0.13 5.11 ± 0.12 NS 5.20 ± 0.10 5,22 ± 0,06 NS
SCC (x104 sel / mL) 8,27 ± 0,25 8,40 ± 0,37 NS 5.00 ± 0.20Sebuah 8.16 ± 0.34 <0,01 3,96 ± 0,54Sebuah 8.21 ± 0.21 <0,01

Catatan: Huruf superskrip menunjukkan perbedaan signifikan dari parameter yang sama antara grup yang sama pada titik

waktu yang berbeda. NS mewakili tidak signifikan.

19
20
21
22
23
24
25