MAKALAH

SOUTHERN BLOTTING

Disusun Oleh
1. Adam Zelvi 1011211073
2. Deasy Retno palupi 1011211024
3. Reszy Gea Anjani 1011211127
4. Verlina Safitri 1011211098

UNIVERSITAS MH THAMRIN
FAKULTAS KESEHATAN
PROGRAM STUDI DIII ANALIS KESEHATAN
20212/2022
A. Pengertian
Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA,
atau protein ke dalam lembaran tipis/membran menggunakan proses
elektroforesis gel. Secara umum teknik ini dibagi menjadi empat
yaitu southern blotting, northern blotting, western blotting, dan easrtern
blotting. Perbedaan dari empat macam teknik tersebut adalah apabila
southern blotting digunakan untuk mendeteksi molekul DNA, nortern
blotting untuk mendeteksi molekul RNA, western blotting untuk
mendeteksi protein, dan eastern blotting untuk mendeteksi karbohidrat dan
lemak.

Southern blotting adalah metode yang digunakan dalam biologi molekuler

untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dalam suatu sampel DNA. Metode
ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward
M. Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di
Universitas Edinburgh. Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel
agarosa untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan kemudian
ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan hibridisasi
dengan probe. Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen
DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak (probe). DNA dipisahkan terlebih
dahulu dengan elektroforesis. Probe yang dilabel akan hibridisasi pada
pita-pita DNA untuk mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen
yang diinginkan. Blot Southern mendeteksi DNA rantai tunggal dengan
menggunakan DNA sebagai pelacak.

Prinsip dari southern blotting adalah kapilaritas, dimana bufer yang

merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel
ke membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran
positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran.
Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah membran
nitroselulosa. Kunci dari metode ini adalah hibridisasi dimana proses
pembentukan molekul DNA untai ganda antara probe DNA untai tunggal
dan target DNA untai tunggal.

Komponen utama dari southern blotting terdiri atas DNA yaitu materi
yang akan diidentifikasi, enzim restriksi yang berguna untuk memotong
DNA menjadi fragmen-fragmen tertentu, DNA probe yaitu fragmen DNA
sebagai pelacak gen, membran nitroselulosa yang digunakan sebagai
tempat hasil jiplakan fragmen DNA dari gel agarosa, larutan buffer untuk
membawa DNA dari gel dan meng-imobilisasi DNA pada membran, dan
detector yang digunakan untuk melihat (mem-visualisasi) pola hibridisasi.
B. Cara Kerja
1. Tahap awal dari southern blotting adalah Isolasi DNA.Isolasi DNA
adalah suatu proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul
lain di inti sel. Terdapat tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan
dalam prosedur isolasi DNA ini, yaitu preparasi ekstrak DNA
(perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan
presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease)
dan RNA (dengan RNAse). Teknik ini diawali dengan perusakan
dinding sel. Pemecahan dinding sel dapat dilakukan secara kimiawi,
misalnya dengan menggunakan enzim lisozim, etilen diamin tetra
asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya. Pada kondisi tertentu
pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA,
akan tetapi sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan
dinding sel antara lain deterjen triton X-100 atau sodium dodesil sulfat
(SDS). Setelah sel mengalami lisis, tahap selanjutnya adalah
memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi. Komponen sel yang
tidak larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga meninggalkan
ekstrak sel dalam supernatan yang jernih
Proses selanjutnya adalah pemurnian (purifikasi) DNA. Proses ini
bertujuan untuk menghilangkan beberapa kontaminan seperti senyawa
sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein. Pemurnian dari
kontaminan protein dan RNA dilakukan menggunakan senyawa
kloroform isoamilalkohol, asam asetat, dan enzim RNAse. Senyawa
kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi mendenaturasi
protein sedangkan enzim RNAse berfungsi melisiskan RNA dari
ekstrak DNA tersebut. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut
kemudian dilakukan presipitasi (pemekatan) dengan cara “presipitasi
etanol”.
2. Tahapan kedua dari southern blotting adalah pemotongan dengan
enzim restriksi. DNA hasil dari proses isolasi kemudian dipotong
menggunakan enzim restriksi endonuklease tertentu yang dipilih
 dengan hati-hati. Hasil dari pemotongan DNA akan terbentuk
fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil.
3. Tahapan ketiga adalah elektroforesis. Elektroforesis digunakan untuk
memisahkan fragmen sesuai dengan ukuran. Fragmen-fragmen yang
diperoleh dari hasil pemotongan DNA selanjutnya dipisahkan oleh
elektroforesis pada gel Gel yang biasa digunakan adalah agarosa. Gel
agarosa adalah suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis
ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi
DNA dengan kisaran ukuran yang luas. Dengan gel agarosa dapat
dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga 20.000 pasang basa (pb).
4. Tahap keempat yaitu denaturasi yaitu memindahkan fragmen restriksi
yang terdapat dalam gel, didenaturasi menggunakan alkali. Proses ini
mengakibatkan untai ganda DNA berubah menjadi untai tunggal
seperti yang terlihat pada gambar di bawah ini.
5. Tahap kelima adalah memindahkan DNA ke membrane nitroselulosa.
Fungsi dari memindah DNA dari gel ke membrane untuk membuat
replica (blot), membrane biasanya terbuat dari nilon atau nitroselulosa.
Pengikatan nilon (500 μg/cm) lebih banyak dibandingkan nitroselulosa
(100 μg/cm). Nitroselulosa ideal untuk blotting protein dan asam
nukleat. Setelah DNA dipindahkan ke membrane, untuk membuatnya
menempel maka dapat dilakukan dengan cara pengeringan pada suhu
sekitar 80℃ dan menyinari dengan sinar UV.
6. Tahap keenam yaitu menambah label probe untuk hibridisasi. Hal ini
dapat dilakukan dengan cara menginkubasi filter di bawah kondisi
hibridisasi dengan DNA probe yang dilabeli secara spesifik.
Selanjutnya Pelabelan dapat dilakukan dengan 2 metode, yaitu dengan
bahan bersifat radioaktif (32P) ata non radioaktif (Biotin). Probe
digunakan untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang tertarik atau
mendeteksi target yang spesifik. Probe dihibridisasi (kawin silang)
dengan fragmen komplemen DNA.
7. Tahap ketujuh adalah pencucian. Probe yang berlebih akan terikat
secara tidak spesifik pada membrane. Membran diinkubasi dengan
larutan pencuci buffer yang mengandung NaCl untuk membuang
kelebihan probe. Untuk tahap yang terakhir adalah autoradiografi. Jika
probe bersifat radioaktif, partikel akan dipancarkan ketika terekspos
pada film X-ray dengan autoradiograf. Deteksi biotin / streptavidin
dilakukan dengan metode kolorimetri, dan visualisasi bioluminescent
menggunakan luminesence. Akan ada bagian atau titik yang gelap
pada film ketika probe terikat.