MAKALAH

NORTHERN BLOTTING

Disusun untuk memenuhi tugas

Mata kuliah : Biologi dan Sel Molekuler
Dosen Pengampu : Atna Permana, SKM, MKM

Disusun Oleh :
1. Awanda Safira Shidiq (1011211018)
2. Dewi Ariyanti (1011211028)
3. Diarul Alvin (1011211136)
4. Intan Putri Trismayanti (10112110501)

PRODI D3 ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS KESEHATAN
UNIVERSITAS M.H. THAMRIN
TAHUN 2022
DAFTAR ISI............................................................................................................................ii

DAFTAR GAMBAR..............................................................................................................iv

BAB 1. PENDAHULUAN...............................................................................................1

1.1. Latar Belakang...................................................................................................1

1.2. Rumusan Masalah..............................................................................................1

1.3. Tujuan.................................................................................................................2

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA.....................................................................................3

2.1 Pengertian Blotting................................................................................................3

2.2 Perbedaan Analisis Western blot, Northern blot, dan Southern blot.............4

2.1.1 Western Blot............................................................................................4

2.2.2 Southern Blot...........................................................................................5

BAB 3. PEMBAHASAN.................................................................................................7

3.1 Pengertian Northern Blotting...............................................................................7

3.2 Prinsip Teknik Northern Blot...............................................................................9

3.3 Tata Laksana Northern Blot...............................................................................10

3.4 Aplikasi Northern Blotting dalam Penelitian....................................................16

BAB 4. PENUTUP..........................................................................................................17

DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................................18

DAFTAR GAMBAR

2.1 Prinsip Western Blotting.......................................................................4

2.2 Prinsip Southern Blotting......................................................................6

2.3 Perbedaan Teknik Blotting pada Southern, Western, Northern Blot......6

3.1 Prosedur Northern Blotting...................................................................7

3.2 Prinsip Northern Blot............................................................................9

iv
 BAB 1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari tentang pendayagunaan

organisme hidup atau bagian organisme (bakteri, virus, fungi, dll) dan produk
dari organisme (protein bioaktif, enzim, vitamin, asam basa organic, alcohol,
dll) dalam proses produksi untuk untuk mengahasilkan suatu produk yang
bermanfaat bagi kelangsungan hidup manusia. Seiring dengan perkembangan
zaman, bioteknologi juga berkembangan dari konvensional hingga modern.
Perbedaan keduannya yaitu apabila konvensional menggunakan seluruh bagian
makhluk hidup sedangkan modern hanya menggunakan sel hidup atau
komponen penyusunnya seperti DNA atau RNA (molekuler).

Ada 2 jenis analisis molekuler yaitu analisis asam nukleat dan analisis
protein. Analisis asam nukleat terdiri dari southern blot, northern blot,
sekuensing DNA, hibridisasi DNA, dll. Analisis protein terdiri dari elektroforesis
protein, western blot, dll.

Blotting asam nukleat adalah teknik sentral dalam studi hibridisasi dalam
pemahaman mengenai ekspresi gen, organisasi, identifikasi protein tertentu.
Blotting adalah suatu teknik dimana asam nukleat (DNA dan RNA) atau protein
di immobilisasi / ditransfer pada membran nitroselulosa. Northern Blot adalah
suatu metode untuk megidentifikasi dan menghitung jumlah RNA (mRNA) yang
mengkode protein tertentu dalam campuran kompleks RNA.

Perkembangan bioteknologi ini semakin pesat dan semakin canggih sehingga

perlu dipelajari khusunya bidang kesehatan.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun rumusan masalah

sebagai berikut :

1
 1. Apa yang dimaksud dengan teknik Blottting ? dan apa kelebihan teknik
tersebut?

2. Apa perbedaan antara analisis western blot, southern blot, dan northern
blot?

3. Bagaimana prinsip dasar mengenai northern blot? serta kelebihan dan

kekurangan

4. Bagaimana tata laksana northern blot?

1.3. Tujuan

Berikut tujuan dari makalah ini, yaitu :

1. Mampu mengetahui perbedaan analisis teknik blotting asam nukleat dan

protein

2. Mampu mengetahui perbedaan analisis western blot, southern blot, dan

northern blot

3. Mampu mengetahui prinsip dasar serta kelebihan dan kekurangan northern

blot

4. Mampu mengetahui tata laksana northern blot

2
 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Blotting

Analisis molekuler terdiri dari analisis asam nukleat dan analisis protein.
Analisis asam nukleat terdiri dari DNA dan RNA. Pada analisis basis DNA
terdapat 3 macam analisis yaitu analisis kualitatif dengan metode
insituhibridisasi, analisis dengan mengukur kadar dengan southern blot, dan
sequencing nukleotida dengan PCR. Analisis protein diantarannya secara
kualitatif dengan imunohistokimia (antbodi) dan imunoflouroresense, secara
kuantitatif dengan menggunakan western blot, dan dengan sequencing asam
amino dengan proteomis.

Blotting adalah suatu teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA,

atau protein ke lembaran tipis atau matriks membran sehingga komponen
tersebut dapat dipisahkan. Teknik ini berupa lanjutan dari elektroforesis gel.

Kelebihan Blotting :

a. Akses yang lebih besar kepada moleul yang telah terikat ke permukaan
lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel
atau matriks

b. Reagen yang dibutuhkan lebih sedikit

c. Waktu untuk melakukan staining dan distaining, inkubasi, mencuci, dll dapat
lebih singkat

d. Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan

sebelum dianalisis

e. Dapat dibuat banyak replica pola tersebut untuk memungkinan banyak

metode analisis yang dipakai

Dalam teknik ini matriks yang digunakan berupa nitroselulosa (NC), tetapi
NC juga memiliki kekurangan yaitu memiliki afinitas lemah dan dapat hilang
selama pemrosesan.

3
2.2 Perbedaan Analisis Western blot, Northern blot, dan Southern blot

2.1.1 Western Blot

Dalam blotting protein berbasis protein, teknik yang dilakukan yaitu teknik
Western blot. Western blot adalah istilah yang dipakai untuk proses transfer
dan imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan untuk : (1) mengetahui
keberadaan dan berat molekul protein sampel dalam suatu campuran, (2)
membandingkan reaksi silang antar protein, (3) mempelajari modifikasi protein
selama sintesis.Teknik ini digunakan untuk mendeteksi DNA-binding protein.
Teknik ini memiliki beberapa keuntungan seperti :

1. Teknik ini mampu mendeteksi protein dengan sensitivitas tinggi karena

protein dipekatkan dalam volume kecil

2. Waktu yang dibutuhkan efisien

3. Reagens yang digunakan lebih ekonomis

4. Menentukan ukuran antigen dan antibodi yang diketahui, serta untuk

diidentifikasi.

2.1 Prinsip Western Blotting

Prinsip teknik western blotting yaitu mendeteksi protein spesifik pada

sampel jaringan yang homogen ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan
kemampuan protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini

4
menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan
panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut
kemudian ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF,
dimana mereka kemudian akan dilacak dengan menggunakan antibodi yang
spesifik kepada protein target.

Proses mendeteksi protein target dapat dilakukan secara direct dan indirect.
Pendetksian secara direct (langsung) tidak membutuhkan antibodi sekunder
karena antibodi primer sudah langsung dilabeli oleh enzim maupun pewarna
fluorescent. Sedangkan pendeteksian secara indirect (tidak langsung) yaitu
antibodi primer ditambahkan lebih dahulu supaya berikatan dengan protein
antigen dalam sampel, lalu diikuti penambahan antibodi sekunder sehingga
antibodi sekunder dapat langsung berikatan dengan antibodi primer.

Western Blot dapat dilakukan melalui beberapa tahapan.

1. Tahap pertama yaitu elektoforesis

2. Tahap kedua yaitu elektotransfer

3. Tahap ketiga yaitu deteksi

2.2.2 Southern Blot

Southern blot adalah metode untuk menyelidiki keberadaan sekuense DNA

tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan
enzim restriksi dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran
dengan blotting melalui aksi kapier. Kebanyakan protocol asli yang digunakan
label radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang tersedia.

Prinsip teknik ini yaitu mentransfer DNA ke kertas NC dengan menggunakan

prosedur aliran pelarut. Carannya yaitu dengan menempatkan gel
elektroforesis ke kertas matriks yang direndam buffer dan berada di atas gel
dan ditumpuk pula beberapa kertas peresap di atasnya. Buffer kemudian akan
mengalir pelan-pelan ke membran, demikian pula dengan gel yang membawa
molekul ke kertas membran, sementara gelnya diserap oleh ketas peresap.

5
Fragmen DNA yang spesifik dideteksi dengan menggunakan pelacak. Pelacak
biasannya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas
spesifik radionukletida. Lokasi sinyal terlihat setelah autradiografi sehingga
dapat menentukan ukuran dari fragmen DNA terebut.

2.2 Prinsip Southern Blotting

Southern blot digunakan penemuan gen dan pemetaan, evolusi dan studi
pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetic, southern blot
digunakan sebagai test untuk memastikan baha bagian DNA tertentu mengenal
urutan gen. Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman.
Southern blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikai bentuk berbeda,
menentukan, memasukkan atau menyisipkan jumlah copy dan untk mentedekti
gross DNA penyusun kembali yang mungkin telah terjadi perubahan.

2.3 Perbedaan Teknik Blotting pada Southern, Western, Northern Blot

6
 BAB 3. PEMBAHASAN

3.1 Pengertian Northern Blotting

Northern blotting adalah cara untuk mengidentifikasi spesies RNA tertentu

dalam campuran kompleks RNA. Umumnya digunakan untuk mengevaluasi
secara kualitatif dan kuantitatif ekspresi gen. Northen blotting melibatkan
isolasi RNA, ukuran fraksinasi dari RNA terdenaturasi melalui elektroforesis gel,
transfer RNA dipisahkan melalui membran, hibridisasi dengan probe yang
spesifik, dan deteksi. RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian
ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel.
Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang
digunakan, intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam
sampel yang dianalisis.

3.1 Prosedur Northern Blotting

Prosedur Northern Blotting umumnya digunakan untuk mempelajari kapan

dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak
bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Beberapa hal yang
membedakan dengan Southern blotting adalah: (1) RNA jauh lebih rentan
terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena itu elektroforesis dilakukan
dalam bufer yang mengandung zat kimia yang bersifat melindungi (biasanya

7
formaldehid), (2) RNA sudah berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi
denaturasi yang lebih ringan, (3) RNA biasanya berukuran tertentu sehingga
tidak memelukan digesti enzim untuk memperoleh pola pita. Kedua prosedur
sangat mirip karena setelah elektroforesis RNA juga ditransfer ke membran
melalui difusi kapilaritas. Biasanya sinar UVdigunakan untuk mengikat
(crosslink) RNA pada membran sehingga tidak bergerak (imobilisasi).

Keuntungan dari northern blotting yaitu :

- Merupakan sesuatu yang diterima dengan baik sebagai metoda

- Northern Blotting sebagai metoda yang dapat digunakan untuk penelitian

sampai kemajuan masa yang akan datang

- Sering digunakan sebagai suatu analisis yang hasilnya valid

- Merupakan suatu protokol serbaguna dapat lanjutan dari banyak jenis

analisis (PCR) termasuk: non-radiolabeled dan radiolabeled, pada kondisi in
vitro menjelaskan RNA dan oligonucleotides

- Urutan dengan homology parsial, tidak sama dengan PCR atau lain metoda
sehingga dapat digunakan sebagai hibridisasi pemeriksaan (yaitu urutan dari
jenis berbeda untuk homology analisa, atau bahkan fragmen genomic juga
dapat digunakan).

Kerugian dari northern blotting yaitu :

- Sering radioaktifitas digunakan. Metoda baru pendeteksian tidak perlu

radioaktif

- Keseluruhan proses Northern Blotting perlu banyak waktu

8
3.2 Prinsip Teknik Northern Blot

Northern blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan informasi mengenai

identitas, ukuran dan kelimpaham RNA. Prinsip Nothern blot adalah
memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran
menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk
semua atau sebagian dari urutan basa mRNA target.

3.2 Prinsip Northern Blot

Teknik ini pada dasarnya hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA
sebagai target. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA.
Didalam eukariot pemilihan mRNA lebih efisien karena genomik DNA tidak
mempunyai intron yang mungkin interference yang mengikat probe untuk
mengoreksi sekuen. Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada
agarose gel tidak menggunakan perlakuan denaturasi dengan asam kuat.
Tahapan yang digunakan dalam metode ini yaitu: pemisahan mRNA dengan
elektroforesis, dipindahkan kedalam membran nylon dan diinkubasi dengan
probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel dengan biotin atau
digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atau
substrad kromegenic. Variasi dari hibridisasi Northern blot adalah dengan
teknik blot titik dimana sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui
teknik ini mudah dilakukan hanya dengan membran ditetesi dengn mRNA dan

9
 probe. Sepertihalnya sourthern blot DNA harus dibuat utas tunggal sebelum
dblot. Sebelum ditetesi dengan DNA sampel maka probe terlebih dahulu untuk
menghibridisasi probe. Kemudian membran difisualisasikan di filem. Jika probe
dan DNA atau RNA target mirip maka filem akan berwarna hitam.

Tahapan Northern blot secara garis besar, yaitu :

1. Isolasi RNA

2. Elektroforesis

3. Transfer ke membran dan imobilisasi

4. Prehiridisasi dan hibridisasi dengan probe

5. Pencucian

6. Deteksi

3.3 Tata Laksana Northern Blot

1. Menyiapkan sampel RNA

a. Menambahkan 15 µg RNA dalam tabung eppendorf steril
b. Menambahkan formamida 50%
Tujuannya adalah formamide akan menurunkan suhu pendinginan dari
interaksi probe-RNA, dan mencegah degradasi RNA oleh suhu tinggi.
c. Menambahkan formaldehyde (2.2 M)
Formaldehida digunakan untuk agen denaturasi RNA untuk membatasi
struktur sekunder
d. Menambahkan MOPS 1x
MOPS adalah buffer yang paling umum digunakan untuk gel RNA karena
kapasitas buffernya pada pH 7,0.
e. Menambahkan pemuat dye

10
2. Mengisi sampel dalam sumur

Sampel RNA yang paling sering dipisahkan pada gel agarosa adalah sampel
yang mengandung formaldehid

3. Visualisasi RNA menggunakan UV (photograph the gel)

Gel dilihat di bawah sinar UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA
sebelum blotting.

4. Transfer menuju membran nilon

Membran nilon yang paling efektif untuk digunakan dalam northern blotting
adalah yang bermuatan positif karena memiliki afinitas tinggi.

a. Menyiapkan pemindahan RNA

b. Tempatkan pada kertas saring whattman berukuran 3mm
c. Tambahkan buffer
d. Rendam kertas saring tersebut
e. Tambahkan kertas saring yang telah direndam di atasnya
f. Hilangkan sisa-sisa gelembung udara yang ada
g. Tempatkan gel

11
h. Tempatkan membran nilon pada gel
i. Aliri membran nilon tersebut dengan larutan buffer
j. Tutup dengan menggunakan 2 kertas saring whatman berukuran 3mm
k. Hilangkan gelembung-gelembung yang ada
l. Tutup pula dengan plastic wrap
m. Tumpuk kertas tersebut dengan menggunakan handuk, tutupi dengan
piringan kaca diatas gel untuk memberikan berat
n. Tunggu hingga semalam

12
5. Membongkar sistem transfer
a. Pindahkan handuk dan kertas saring
b. Menyiapkan RNA pada membran nilon menggunakan crosslinker UV
transilluminator

6. Hibridisasi
a. Prehibridisasi membran dalam prehibridisasi buffer
 SSC 6x
 Denhardts 5x
 SDS 0,5%
 Denatured DNA 100 µg/ml
 Formamide 50%

13
 b. Inkubasi pada suhu 42oC selama 2-4 jam

c. Buang prehibridisasi buffer

d. Tambahkan hibridisasi buffer

7. Penambahan probe (isotop-label dCTP)

Probe dari northern blot tersusun atas asam nukleat dengan
sequence lengkap untuk semua atau bagian dari RNA tertentu, bisa DNA,
RNA atau oligonukleotida dengan 25 basa lengkap untuk target sekuen.

14
 Perlakuan :
a. Hibridisasi semalam

b. Buang larutannya

c. Cuci membran dengan larutan buffer

d. Inkubasi pada 52⁰C selama 30 menit dalam hibridisasi chamber

e. Pindahkan membran dan siap untuk di film

15
3.4 Aplikasi Northern Blotting dalam Penelitian

1. Deteksi Chemokine

Penelitian yang dilakukan oleh Irifune et al (2005) dengan judul Adoptive

transfer of T-helper cell type 1 clones attenuates an asthmatic phenotype in
mice, mendeteksi chemokine menggunakan Northern blotting. Deteksi
chemokine yang dilakukan di jurnal ini bertujuan untuk melihat perbandingan
effek pemberian Th 1 terhadap chemokine yang dihasilkan antara tikus yansg
terkena asma dan tikus normal. Ada 2 chemokine yang dilihat eotaxin dan
RANTES.

Hasil dari penelitian ini transfer Th 1 pada cell memiliki effect dalam ekpresi
chemokine secara in vivo. Th1 cell akan menghambat ekpresi eotaxin, dimana
eotaxin ini diekpresikan sangat kuat pada model asthma. RANTES akan
diinduksi secara kuat pada model yang ditransfer Th1, dan tidak terinduksi pada
model asthma. Eotaxin diketahui berpotensi sebagai kemoatarkatan untuk
eosinophils. Kesimpulan dalam penelitian ini pemberian TH 1 dapat digunakan
dalam terapi asthma.

16
 BAB 4. PENUTUP

Northern Blot merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui

konstruksi RNA yang mempunyai barat molekul lebih basar. Kelebihan dari
northern blotting yaitu :Merupakan sesuatu yang diterima dengan baik
sebagai metoda, Northern Blotting sebagai metoda yang dapat digunakan
untuk penelitian sampai kemajuan masa yang akan datang, Sering digunakan
sebagai suatu analisis yang hasilnya valid, Merupakan suatu protokol serbaguna
dapat lanjutan dari banyak jenis analisis (PCR) termasuk: non-radiolabeled dan
radiolabeled, pada kondisi in vitro menjelaskan RNA dan oligonucleotides,
Urutan dengan homology parsial, tidak sama dengan PCR atau lain metoda
sehingga dapat digunakan sebagai hibridisasi pemeriksaan (yaitu urutan dari
jenis berbeda untuk homology analisa, atau bahkan fragmen genomic juga
dapat digunakan).

Analisa dilakukan dengan cara isolasi RNA dari jaringan yang mempunyai
ekspresi gen yang paling tinggi.Dasarnya, teknik ini menggunakan mRNA
sehingga pada agarose gel tidak menggunakan perlakuan denaturasi dengan
asam kuat. Tata laksana pada metode Northern Blot dengan Menyiapkan
sampel RNA,Mengisi sampel dalam sumur dan alat dinyalakan pada 100 volt
selama 2 jam, Visualisasi integritas dari RNA menggunakan UV atau dengan
pewarnaan EtBr, Transfer menuju membran nilon, Membongkar sistem
transfer, Hibridisasi, Penambahan probe.

17
 DAFTAR PUSTAKA

Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekular. Jakarta. Erlangga

Hayes, Peter C., Thomas W. Mackay. 1997. Diagnosis dan Terapi (alih bahasa).
Jakarta : EGC

Irifune, A., Yokohama,A., Sakai, K., Watanabe, H., Katayama, H., Ohnishi, H.,
Hamada, H., Nakajima, M., Kohno, Higaki, J. 2005. Adoptive transfer of T-helper cell
type 1 clones attenuates an asthmatic phenotype in mice. Eur Respir J (25): 653–
659.

Nugroho, Endik Deni., Dwi Anggorowati Rahayu. 2017. Pengantar Bioteknologi

(Teori dan Aplikasi). Yogyakarta : Deepublish

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor: New York.

Trayhurn, P. 1996. Northern Blotting. Proceedings of the Nutrition Society (55): 583-
589.

Zimmers-Koniaris, T. 2001. Northern Blotting and RNA Detection. eLS.

18