Dasar-dasar Bioteknologi-4

Dasar-dasar Pengklonan gen

Drs. Sutarno, MSc., PhD.

DASAR-DASAR PENGKLONAN GEN

Pengklonan gen mempunyai beberapa tujuan:

memperoleh gen sebagai penelusur
mendapatkan gen untuk dianalisis urutan
nukleotidanya
mendapatkan gen untuk diekspresikan pada
sel inang.

Tahap-tahap dalam pengklonan gen:

1.
2.
3.
4.

Membuka sel hidup. untuk sel mammalia, biasanya

dg memblender sel kemudian ditambahkan deterjen.
Mengambil informasi genetik (DNA) dari sel, dengan
teknik pemurnian DNA,
Mememotong gen khusus yang diinginkan dengan
Enzim Restriksi.
Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam
perantara yang disebut cloning vehicle (vektor) yg akan
membawa potongan DNA ke dalam sel hidup lain.
Vektor molekul DNA yg relatif pendek yang dapat
memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel.
Penyambungan menghasilkan molekul DNA kimera
(rekombinan/ vektor rekombinan).

Tahap-tahap dalam pengklonan gen:

5. Vektor yg mengandung potongan khusus DNA
dimasukkan ke dalam sel inang, biasanya
organisme monoselluler seperti bakteri atau
ragi.
6. Membiarkan sel inang untuk memperbanyak diri
membentuk klon sel identik yang jumlahnya
sangat besar. Di dalam sel inang, vektor
rekombinan memperbanyak diri sehingga gen yg
tersisip juga mengalami amplifikasi. Bila sel
inang memperbanyak diri, gen tersisip pada
rekombinan vektor juga mengalami
penggandaan diri.

Skema rekombinan DNA

Sumber DNA

Vektor kloning

DNA target
Linearisasi enzimatik
Fragmentasi enzimatik
DNA vektor

Gabungkan DNA target

dengan Vektor kloning
DNA construct
Masukkan ke sel host
Pisahkan sel yg mengandung insert
Sel host (eg. Bakteri)
Produksi protein
Protein yg dikodekan
oleh insert gen

VEKTOR UNTUK KLONING

MOLEKULER

Vektor: pembawa molekul DNA dlm proses

pengklonan gen.
Vektor yang biasa digunakan: Plasmid, Fage,
kromosom buatan dr khamir (YAC= yeast
artificial chromosome), dan Cosmid.
Plasmid biasa digunakan untuk membawa
molekul DNA berukuran kecil, sedangkan untuk
molekul DNA yang besar digunakan fage,
cosmid atau YAC.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER

1. PLASMID

Merupakan DNA utas ganda sirkuler berukuran kecil yg

terdapat di dlm sitoplasma dan dpt melakukan replikasi
secara otonom.
Ciri penting plasmid:
1. Dapat melakukan replikasi,
2. Tdp diluar kromosom ,
3. Secara genetik dpt ditransfer secara stabil.
Tdp secara alami maupun sudah mengalami modifikasi
yg disesuaikan dg keperluan didlm manipulasi genetik.
Satu sel dpt mengandung lebih dr satu kopi.
Plasmid tdp dlm sitoplasma prokryot maupun eukaryot
seder hana uniselluler. Selain pada bakteri, plasmid
juga tdp pd Saccharomyces cereviceae.

Plasmid dikelompokkan berdasarkan sifat yang disandi

oleh gen yg dikandungnya:
Plasmid F (fertilitas) membawa gen tra, yg
bertanggung jawab thd proses konjugasi
Plasmid R (resistensi) mengndung gen resistensi
thd antibiotik atau logam berat
Plasmid yg mengandung gen penyandi toksin dan
bakteriosin, seperti ColE1 dari E.coli.
Plasmid degradatif yg mempunyai kemampuan utk
melakukan metabolisme molekul organik spt toluen
(TOL dr Pseudomonas putida).

Plasmid virulensi: yg bertanggung jawab thd

patogenositas dr sel inang (pTi pd Agrobacterium
tumefaciens).
Untuk replikasi, plasmid dpt dlm keadaan: terpisah
dari kromosom (non-integratif), dan ada yg
terintegrasi ke dlm kromosom bakteri (episom).
Untuk kloning gen, plasmid yg ideal bersifat:

a). berukuran kecil,

b). minimal memiliki satu situs penyisipan yg mudah
diidentifikasi, dan
c). membawa sifat yg mudah utk seleksi bagi inang yg
mengandungnya.

Efisiensi transformasi berbanding terbalik dengan

ukuran plasmid, semakin kecil ukuran plasmid
efisiensi transformasi semakin besar.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER

2. FAGE

Fage atau bakteriofage adalah virus yg

menginfeksi bakteri.
Struktur fage sangat sederhana, tersusun dr
molekul DNA yg membawa beberapa gen dan
molekul protein yg membungkusnya yg disebut dg
Kapsid.
Tdp 2 macam siklus hidup fage:

1). Siklus litik, dan

2). Siklus lisogeni.

Siklus litik diakhiri dg pelepasan fage baru dr

bakteri inang karena tjd lisis, sedangkan pd
lisogeni, DNA fage tersisip di dlm kromosom
bakteri yg berfungsi sgb sel inangnya.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER

3. COSMID

Vektor yg diturunkan dr plasmid yg

mengandung ujung kohesif (cos) dari fage .
Merupakan molekul DNA hibrid antara fage
dan plasmid bakteri.
Di dlm bakteri, cosmid membentuk molekul
sirkuler spt halnya plasmid, dan tdk dapat
melisis sel ingnya krn tidak (atau sedikit sekali)
mengandung gen .

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER

4. KROMOSOM BUATAN KHAMIR (YEATS
ARTIFICIAL CHROMOSOME, YAC).

Diperlukan dalam pengklonan DNA yg

ukurannya besar.
Pada beberapa gen eukaryot, tdp gen yg
ukurannya sangat besar seperti Cyztic fibrosis
pada manusia yg besarnya 240kb, sehingga
baik plasmid, fage maupun cosmid tidak bisa
digunakan sebagai vektor.

INTRODUKSI VEKTOR KE DALAM

SEL INANG

Agar dapat mengalami penggandaan, vektor

rekombinan diintroduksikan ke dalam sel
inang. Penggandaan vektor DNA tersisip
juga mengalami penggandaan klon dari DNA
sisipan.
Introduksi vektor rekombinan dibedakan
menjadi 2:
1. Transformasi, bila vektor yg digunakan
adalah plasmid, dan
2. Transfeksi, bila virus dan turunannya yg
digunakan sebagai vektor.

Transformasi pd bakteri biasa dilakukan dengan

menggunakan bahan kimia atau menggunakan aliran
listrik (fisik).
Agar DNA bisa masuk dlm bakteri, dinding dan membran
bakteri dibuat sedemikian rupa shg DNA dapat melewati
membran (rentan kompeten), dengan penambahan
kation Ca atau Mg dan penambahan detergen (eg Triton
X). Kombinasi perlakuan kimia dan fisik seperti heat
shock pada suhu 42oC selama 1-2 menit sering dilakukan.
Kejutan listrik (elektroporasi) dg tegangan tertentu dlm
waktu relatif singkat, membran sel inang akan terbuka
membentuk pori.
Cara lain utk sel eukaryot transfer gen secara langsung
dengan menggunakan protoplast dan mikroinjeksi.

Contoh Kloning
pd domba

Cloning
phenotypic similarities among clones
genetic identical
have same environmental variance that
would normally be present
phenotypic similarities among clones
will not perform in identical manner
greater similarity could be useful in research
applications
reduced variance not a likely benefit for
livestock, at least in near term