JOURNAL READING

LifeSpan BioSciences, Inc. Mouse

TLR4 ELISA Kit (Sandwich ELISA).
Catalog No. LS-F21475
Adinda Adia Putri
1261050240
 ELISA merupakan uji serologis yang umum
digunakan di berbagai laboratorium.
Uji ini bertujuan untuk menganalisis
adanya interaksi antigen dengan antibodi di
dalam suatu sampel dengan menggunakan
enzim sebagai pelapor.
 Toll-Like Receptor
Adalah transmembran protein tipe 1 ekstraseluler
penuh leusin, yang membantu proses
penyampaian sinyal ekstraseluler menuju
intraseluler
Berperan sebagai respon imun tubuh terhadap
mikroorganisme patogen.
TLR 1,2,4,5,6
Permukaan sel

TLR 3,7,8,9
Dalam endosom
MOUSE TLR4 ELISA KIT
 Spesifikasi Assay
Target TLR4

Sinonim TLR4, toll-like receptor 4, antigen CD284, Homolog Drosophila toll, TLR-4, TOLL,
ARMD10, Toll-like receptor 4, Htoll
Spesifitas Alat ini untuk mendeteksi TLR4, Tidak terdapat reaktivitas-silang yang signifikan atau
interferensi antara TLR4 dan analog yang terpantau.
Tipe sampel Alat ini direkomendasikan untuk penggunaan dengan Plasma dan serum tikus.
Penggunaan dengan sampel tipe lain tidak didukung.
Deteksi Kolorimetrik 450nm (TMB)

Rentang deteksi 0.156 10 ng/ml

Sensitivitas Khasnya kurang dari 0.094 ng/ml

Kinerja Intra-Assay CV (<10%) ; Inter-Assay CV (<10%)

Keterbatasan Alat ini hanya untuk penggunaan penelitian dan tidak dimaksudkan untuk
penggunaan diagnostik. Alat ini tidak disetujui untuk digunakan pada manusia atau
untuk diagnosis klinis.
 Pedoman Assay
Assay ini didasarkan pada pedoman sandwich ELISA. Setiap plat mikrotiter
yang disediakan telah diselimuti sebelumnya dengan menangkap target
antibodi spesifik. Standard atau sampel ditambahkan ke isi tabung dan
antigen target mengikat menangkap antibodi.

Deteksi antibodi konjugat biotin ditambahkan sehingga mengikat antigen

yang tertangkap. Antibodi deteksi biotinilasi yang tak terikat dicuci bersih.
Konjugat Avidin-Horseradish Peroxidase (HRP) ditambahkan untuk
mengikat biotin. Konjugat Avidin-HRP yang tak terikat dicuci bersih.
Substrat TMB ditambah dan bereaksi dengan enzim HRP menyebabkan
perubahan warna.

Larutan asam sulfat ditambahkan untuk menghentikan reaksi perubahan

warna dan kemudian densitas optik (OD) dari isi tabung diukur panjang
gelombang 450 nm +/- 2 nm. Densitas optik dari sampel yang tidak
diketahui dapat dibandingkan dengan kurva standard OD menggunakan
konsentrat antigen yang diketahui untuk menentukan konsentrasi antigen.
 Komponen Alat
KOMPONEN KUANTITAS

Coated 96-well strip plate 1

Standard (terlipofilasi) 2 vial

Diluen sampel 1 vial x 20 ml

Diluent Pengujian A 1 vial x 10 ml

Diluent Pengujian B 1 vial x 10 ml

Regen Deteksi A 1 vial x 120 l

Regen Deteksi B 1 vial x 120 l

Buffer Pencuci (25x) 1 vial x 30 ml

Substrat TMB 1 vial x 10 ml

Solusi Stop 1 vial x 10 ml

Lempeng penutup adhesive 4

Instruksi manual 1
 Penyimpanan Alat
Simpan semua komponen alat pada suhu 4oC. Substrat tidak diperbolehkan
membeku. Sekali saja setiap reagen terbuka, hal itu direkomendasikan alat
tersebut digunakan dalam 1 bulan

Isi tabung strip plat yang tidak digunakan harus disimpan pada suhu 4oC dalam
kantong tertutup mengandung desiccant untuk meminimalisir pajanan terhadap
kelembabannya. Jangan gunakan diluar waktu kadaluarsanya.
 Perlengkapan

Pembaca plat
Pipet presisi tinggi
mikro dengan filter
dan ujung pipet Tabung eppendorf
panjang
steril
gelombang 450nm

Cairan deionisasi
Inkubator 37oC Kertas penyerap
atau destilasi
 Tabel Eksperimen
1 2 3 4

A Dilusi Standar 1 Dilusi Standar 1 Sampel (1:1) Sampel (1:1)

B Dilusi Standar 2 Dilusi Standar 2 Sampel (1:10) Sampel (1:10)

C Dilusi Standar 3 Dilusi Standar 3 Sampel (1:100) Sampel (1:100)

D Dilusi Standar 4 Dilusi Standar 4 Sampel (1:1k) Sampel (1:1k)

E Dilusi Standar 5 Dilusi Standar 5 Sampel (1:10k) Sampel (1:10k)

F Dilusi Standar 6 Dilusi Standar 6 Sampel (1:100k) Sampel (1:100k)

G Dilusi Standar 7 Dilusi Standar 7 Sampel (1:1000k) Sampel (1:1000k)

H Kontrol Negatif Kontrol Negatif Sampel (1:10000k) Sampel (1:10000k)

 Pengumpulan Sampel
Pengujian ini
direkomendasikan
ASI
untuk digunakan
dengan Kultur Sel Lisat Sel
Tikus Supernatan,
Plasma, Serum, Lisat Eritrosit
dan Jaringan
Homogenat. Plasma
Penggunaan
dengan jenis Plasma miskin platelet
sampel lainnya
tidak didukung.
Sperma dan Seminal Plasma
Serum
Jaringan Homogenat
Supernatan kultur sel
 ASI Cell Lysates

sentrifugasi sentrifugasi pada

sampel selama 20 1500 g selama
menit pada 10 menit pada 2-
1000g untuk 8C untuk
menghilangkan menghilangkan
partikulat. debris seluler.
Kumpulkan Kumpulkan
supernatan untuk supernatan untuk
pengujian. pengujian.
 Erythrocyte Lysates Plasma

sentrifugasi whole Kumpulkan plasma

blood selama 20 dengan menggunakan
menit pada 1000x g heparin atau EDTA
untuk pelet sel dan sebagai antikoagulan.
lepaskan supernatan. sentrifugasi sampel
selama 15 menit pada
1000 g pada 2-8C
dalam waktu 30
menit setelah
pengambilan sampel.
 Sperma dan
Platelet Serum
Seminal Plasma
Poor Plasma Biarkan air mani Gunakan tabung
Centrifuge dicairkan pada pemisah serum
sampel selama suhu kamar atau dan izinkan
15 menit pada 37C. Setelah sampel
1000 g pada 2- pencairan, menggumpal
8C dalam waktu sentrifugasi pada selama 2 jam
30 menit dari 2.000 x g selama pada suhu kamar
waktu 10-15 menit. atau semalam
pengambilan Kumpulkan pada suhu 4C
sampel supernatan sebelum
plasma mani sentrifugasi
untuk penguji selama 20 menit
pada suhu sekitar
1000 x g

Urine
Kumpulkan urine pertama pada
hari ini (pertengahan aliran)
secara aseptik, hindari aliran
langsung ke wadah steril.
Centrifuge untuk menghilangkan
partikulat Dan kumpulkan
supernatan untuk pengujian.
Supernatan kultur sel,
serebrospinal, folikel, dan lavage
paru Cairan, air liur, keringat, air
mata, dan cairan biologis lainnya
Centrifuge Sampel selama 20
menit pada 1000x g untuk
menghilangkan partikulat.
Kumpulkan urine pertama pada
hari ini (pertengahan aliran)
secara aseptik, hindari aliran
langsung ke wadah steril.
Centrifuge untuk menghilangkan
partikulat Dan kumpulkan
supernatan untuk pengujian
 Alat ini untuk mendeteksi TLR4, Tidak terdapat
reaktivitas-silang yang signifikan atau
interferensi antara TLR4 dan analog yang
terpantau
 Persiapan Sampel
Nilai Densitas Optik (OD) yang dihasilkan dari sampel Anda harus berada dalam
nilai OD dari kurva standar agar konsentrasi antigen yang dihitung akurat.

Dalam banyak kasus, sampel perlu diencerkan untuk menurunkan konsentrasi

antigen ke tingkat yang cukup. Informasi tentang konsentrasi antigen dalam
berbagai jenis sampel mungkin tersedia dari literatur yang dipublikasikan;

Namun, seringkali perlu untuk menjalankan rangkaian pengenceran dari setiap

jenis sampel. Berikut ini akan mempersiapkan volume yang cukup untuk
menjalankan seri pengenceran Sampel dalam rangkap tiga. Dalam kasus sampel
volume kecil, langkah pertama dalam rangkaian ini mungkin adalah pengenceran,
seperti 1: 5 atau 1:10, daripada sampel yang tidak dicairkan.

Menjalankan wells duplikat atau triplik untuk setiap sampel dianjurkan. * Selalu
encerkan sampel dalam buffer yang sama dengan Standar yang digunakan untuk
menghasilkan Kurva Standar.
 Persiapan Standar
Larutan Stok Standar (10 ng / ml): Rekonstitusi 1 tabung Standar
lipofilisasi dengan 1,0 ml Pengencer Sampel. Inkubasi pada suhu kamar
selama 10 menit dengan agitasi yang lembut (hindari berbusa).

D1 (10 ng/ml) : Pipet 500l larutan Stok Standar menjadi 0l

Pengencer Sampel
D2 (5 ng/ml) : Pipet 250l dari D1 menjadi 250l Pengencer Sampel
D3 (2.5 ng/ml): Pipet 250l dari D2 menjadi 250l Pengencer Sampel
D4 (1.25 ng/ml): Pipet 250l dari D3 menjadi 250l Pengencer Sampel
D5 (0.625 ng/ml): Pipet 250l dari D4 menjadi 250l Pengencer Sampel
D6 (0.313 ng/ml): Pipet 250l dari D5 menjadi 250l Pengencer Sampel
D7 (0.157 ng/ml): Pipet 250l dari D6 menjadi 250l Pengencer Sampel

Standar Nol (0 ng/ml) : Gunakan Pengencer Sampel saja

 Prosedur Assay
Bawa seluruh reagen-reagen dan sampel ke suhu kamar tanpa
penghangat tambahan dan campurkan sepenuhnya sebelum
diambil dengan pipet (cegah busa). Siapkan seluruh reagen,
standards, dan sampel seperti pada bagian sebelumnya.

Tambahkan 100ul standard, blank, atau sampel per isi tabung,

tutupi dengan plat penutup, dan inkubasi selama 90 menit
pada suhu 37oC

Aspirasi cairan setiap isi tabung, jangan dicuci.

Tambahkan 100ul 1x biotinilasi deteksi antibodi pada setiap isi

tabung, tutupi dengan plat penutup, dan secara tegas
goyangkanuntuk memastikan tercampur seluruhnya.
Inkubasikan selama 1 jam pada suhu 37oC
Aspirasi cairan dari setiap isi tabung dan cuci 3 kali. Cuci
dengan penambahan sekitar 350ul Wash buffer menggunakan
botol penyemprot, pipet multi chanel, dispenser lipat ganda
atau pencuci oomatis. Biarkan setiap pencucian selama 1-2
menit sebelum secara sempurna diaspirasi.

Tambahkan 100ul 1x HRP Konjugat larutan pada setiap isi

tabung, tutupi dengan plat penutup baru, dan ikubasikan
selama 30 menir pada suhu 37oC

Aspirasi carian dari setiap isi tabung dan cuci 5 kali seperti pada
langkah ke-4

Tambahkan 90ul larutan substrat TMB pada setiap isi tabung,

tutupi dengan plat penutup baru, dan inkubasikan selama 15
menit pada suhu 37oC. Lindungi dari cahaya dan pantau secara
berkala hingga perubahan warna terjadi secara optimal
Tambahkan larutan penghenti pada
setiap isi tabung. Warna biru akan
berubah menjadi kuning dengan
segera. Jika warna perubahan
warna tidak seragam, secara jantan
tekan plat untuk memastikan
selurhnya tercampur.

Pastikan nilai OD dari setiap isi

tabung secara segera
menggunakan pembaca plat
mikro pada 450nm panjang
gelombang
 Ringkasan
Tambahkan 100ul sampel,
standard, atau blank pada
Siapkan seluruh reagen,
setiap isi tabung (genangan)
sampel, dan standard
dan inkubasi selama 90
menit pada suhu 37oC
Aspirasi dan tambahkan 100
ul 1x biotinilasi deteksi
antibodi dan inkubasi
selama 1 jam pada suhu
37oC

Tambahkan 100 ul 1x HRP

konjugat dan inkubasikan
Aspirasi dan cuci 3 kali Aspirasi dan cuci 5 kali
selama 30 menit pada suhu
37oC

Tambahkan 90ul larutan

substrat TMB dan inkubasi Tambahkan 50ul larutan Baca segera pada panjang
selama 15 menit pada suhu penghenti (asam) gelombang 450nm
37oC