TEKNOLOGI DNA

REKOMBINAN
Kelompok 1

Saidatun Nimah (A1C208048)

Nurbidayah (A1C208045)
Devy Dwi Rahayu (A1C208070)
Zubaidah (A1C208073)
Sugiannor (A1C208039)
Hamdan (A1C208044)
Risa Aulia (A1C208029)
Mella Mutika Sari (A1C208031)
Rina Ocktaviana (A1C208013)
M. Sidiq Oktaviandi (A1C208001)
Pengertian Teknologi DNA
Rekombinan

pembentukan kombinasi
materi genetik yang baru

Dengan cara
penyisipan molekul DNA
ke dalam suatu vektor
 Teknologi DNA rekombinan
mempunyai dua segi manfaat.

dengan mengisolasi diperolehnya produk

dan mempelajari gen tertentu dalam
masing-masing gen
waktu lebih cepat dan
akan diperoleh
pengetahuan tentang jumlah lebih besar
fungsi dan mekanisme daripada produksi
kontrolnya secara konvensional
Teknologi DNA rekombinan melibatkan
beberapa tahapan tertentu, yaitu
isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon

pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen

dengan berbagai ukuran
isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam
vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan
transformasi sel inang menggunakan molekul DNA
rekombinan
reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang

analisis DNA rekombinana

 Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau
pembuangan dinding sel
Langkah selanjutnya adalah lisis sel
Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel
harus dibuang
DNA yang telah dibersihkan dari protein dan
remukan sel masih tercampur dengan RNA
sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk
membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang
telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan
dengan penambahan amonium asetat dan
alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan
menggunakan CsCl.
 Enzim Restriksi
Tahap kedua dalam kloning gen adalah
pemotongan molekul DNA, baik genomik
maupun plasmid
Tempat pemotongan pada kedua untai DNA
sering kali terpisah sejauh beberapa pasang
basa
 Ligasi Molekul molekul DNA
Ada tiga cara, yaitu:

ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri

ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli

yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau
lazim disebut sebagai enzim T4 ligase

pemberian enzim deoksinukleotidil transferase

untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3
 Seleksi Transforman dan Seleksi
Rekombinan
Dikarenakan DNA yang dimasukkan ke dalam
sel inang bukan hanya DNA rekombinan
Cara seleksi sel transforman akan diuraikan
lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid
Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang
dapat terjadi setelah transformasi dilakukan,
yaitu:
 (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau
berarti transformasi gagal

(2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti

ligasi gagal

(3) sel inang dimasuki vektor rekombinan

dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan
Seleksi sel rekombinan yang membawa
fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan
fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik
reaksi polimerisasi berantai atau polymerase
chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang
diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui
cara yang dinamakan hibridisasi koloni.
Pembuktian Gen sebagai bahan reaksi
Diagnostik dan Sidik Jari Molekular
Bahan reaksi diagnostik :
1. Bahan reaksi biokimia untuk menguji kadar
logam enzim spesifik.
2. Antibodi untuk mendeteksi protein yang
spesifik oleh ilmu pengetahuan tentang
teknik tersebut seperti immunofluorescence,
immunoassay radio (RIA) dan enzim
menghubungkan immunosorbent uji kadar
logam (ELISA).
PELABELAN DNA ASAM NUKLEAT IN VITRO

Pelabelan Asam nukleat IN VITRO.

Yang merupakan satu ilmu pengetahuan tentang
teknik yang dikenal sebagai nick translation
Mempergunakan metode acak primer.
Suatu campuran dengan urutan acak
hexanukleotida ditambahkan ke DNA. Beberapa
hexanukleotida itu akan dihibridisasi ke DNA dan
berperan sebagai inisiasi untuk DNA Polimerase
Synthesis of labeled DNA by nick
translation
 PENGGUNAAN GEN PEMERIKSA MELAWAN
PENDETEKSIAN IMUNOLOGI

Penggunaan pemeriksaan gen tidak terbatas

kepada pendeteksian viroids; dengan sedikit
modifikasi mereka dapat juga digunakan untuk
mendeteksi bakteri. Dalam hal ini, contohnya
diberlakukan bagi suatu nitrocellulose
saringan sama dengan sebelumnya.
 Kerugian Menggunakan Gen
Pemeriksa
1. penggunaan label radioaktif, walaupun bukan
metoda pemberian label yang aktif, asam
nukleat sedangdikembangkan dan ini
diuraikan dalam bagian yang berikutnya.
2. keseluruhan waktu test, yang mana pada
umumnya 24- 72 jam
 Pada sisi positif , teknologi pemeriksaan
mempunyai dua keuntungan dibanding metoda
pendeteksian imunologi :

1. Metoda dapat diterapkan tanpa modifikasi sebagai

contoh darah, tinja, badan atau nanah exudates
yangmana terlalu kotor untuk mengijinkan zat darah
menyerang kuman dengan interaksi antigen
2. Teknologi pemeriksaan dapat mendeteksi pathogenicas
faktor penentu yangmana tidak dapat diungkapkan
secara imunologi; sebagai contoh, banyak dari kasus
diare dan muntah-muntah yang terjadi pada orang yang
bepergian keluar negeri, yang disebut' perut pelancong',
muntah-muntah disebabkan oleh tegangan Escherichia
coli yang mengeluarkan suatu enterotoxin
PEMERIKSAAN UNTUK LABEL NON-RADIOAKTIF

Walaupun pemeriksa berlabel dengan fosfor

radioaktif memudahkan untuk pekerja riset,
tetapi tidak pantas untuk suatu laboratorium
diagnostik jika pengendalian mutu adalah penting
untuk standardisasi test. Dengan penggunaan
secara radioaktif berlabel thionucleotides
mengakibatkan pemeriksaan dapat diperluas.
Suatu solusi alternatif dengan menggunakan
biotin- berlabel nucleoside triphosphates selama
nick translation
 BLOTTING SOUTHERN

Potensi DNA yang diagnostik- DNA hybridisasi

sangat dapat ditingkatkan dengan bantuan
Blotting Southern. Teknik ini dinamai Ed
Southern yang dikembangkan pada tahun
1975
 DNA dicerna dengan suatu pembatasan endonuclease dan
fragmen yang mana diproduksi dengan cara dipisahkan pada
suatu basis ukuran oleh electrophoresis dalam suatu agarose
'gel' agar-agar.
DNA fragmen kemudian mengubah sifat ke dalam rantai
tunggal oleh endapan 'gel' agar-agar dalam alkali. Sesudah itu,
'gel' agar-agar ditempatkan pada suatu kertas saringan yang
menutupi sampai terbenam dalam suatu palung
penyangga/bantalan.
Suatu lembar selaput nitrocellulose ditempatkan di paling atas
sehingga 'gel' agar-agar dan suatu tumpukan kertas penyerap
besar ( yang pada umumnya menutupinya dengan kertas
handuk) tersangkut di atas sekali. Larutan disiapkan oleh
penyerap yang ditutupi dengan kertas, melalui 'gel' agar-agar
dan nitrocellulose dan membawa DNA ke luar dari 'gel' agar-
agar ke atas selaput itu.
Sama dengan sebelumnya, DNA diperbaiki pada tempatnya
dengan mengeringkan saringan dalam suatu ruang hampa.
Hasil saringan adalah suatu tiruan pada DNA fragmen
mempola dari agarose 'gel' agar-agar.
 Manfaat Teknologi DNA
Rekombinan
Meliputi empat bidang:
Bidang kesehatan
Bidang Pertanian
Bidang Hukum
Bidang Pengemangan Ilmu Pengetahuan