SKRINING FITOKIMIA

Salah satu pendekatan untuk penelitian tumbuhan

obat adalah penapis senyawa kimia yang
terkandung dalam tanaman.
Cara ini digunakan untuk
• mendeteksi senyawa tumbuhan berdasarkan
golongannya.
• Sebagai informasi awal dalam mengetahui
senyawa kimia apa yang mempunyai aktivitas
biologi dari suatu tanaman.
• Informasi yang diperoleh dari pendekatan ini juga
dapt digunakan untuk keperluan sumber bahan
yang mempunyai nilai ekonomi lain seperti
sumber tannin, minyak untuk industri, sumber
gum, dll.
Metode yang telah dikembangkan dapat mendeteksi
adanya golongan senyawa alkaloid, flavonoid,
senyawa fenolat, tannin, saponin, kumarin, quinon,
steroid/terpenoid. (Teyler.V.E,1988)
Prosedur Skrining
•Ekstraksi
•Partisi/Fraksinasi
•Kromatografi Lapis Tipis
•Identifikasi
Ekstraksi dan Ekstrak
• ARTI : extractio atau extrahere, tarik keluar
• Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan
dari campurannya dengan menggunakan
pelarut.
• Ekstrak adalah sediaan yang diperoleh dengan
cara ekstraksi tanaman obat dengan ukuran
pertikel tertentu dan menggunakan medium
pengekstrasi (menstrum) yang tertentu pula
Hal yang harus dipertimbangkan
• Sifat senyawa yang diektraksi
• Sifat solvent yang digunakan
• Jenis ekstrak
• Solvent recycling
Sifat senyawa
Polaritas
 Senyawa aktifnya telah atau belum diketahui, prinsip kerja adalah “Like
dissolves like”, Pelarut polar akan melarutkan senyawa polar
Effek PH
 Senyawa yang terionisasi harus menjadi pertimbangan
 Kelarutan senyawa dalam temperatur tinggi akan naik karena solvent
lebih dapat penetrasi pada jaringan tanaman
Senyawa Phenol, & asam organik - asam
 Untuk mendapatkan hasil optimum, PH harus diatur
 Contoh : Alkaloida --- basa/alkalis

Walau demikian, harus dilakukan hati-hati karena adanya ester atau

glikosida dapat pecah karena pengaturan PH
Thermostabilitas
 Adanya senyawa yang kurang stabil, kemungkinan terjadi “Artefacts”
Sifat solvent
“Volatility”, “Flammability” dan “Boiling point”
 “Boiling point” memberi gambaran kemudahan diuapkan
dengan sedikit pemanasan
 Tetapi semakin mudah menguap, semakin dibutuhkan
penangan lebih serius
 Penggunaan eter, dihindari (flammable & peroxides)
Toksisitas
 Sifat toksisitas terhadap operator/pelaku
 Kloroform & eter menyebabkan depresi pernafasan serta
anestesia
 Acetonitrile & metanol- beracun
 Karbontetraklorida - hepatotoksik
 Benzen -- karsinogenik
 Beberapa “solvents” defatting skin dermatologik
 Kontak dengan solvent harus maksimal dihindari
Reaktivitas
 Beberapa solvents cukup reaktif, sehingga mudah
terbentuk artefacts. Mis: solvents dengan gugus –
C=O (aseton, metiletilketon dapat bereaksi dengan
senyawa nukleofil; metanol, etanol dapat
menyebabkan alkilasi

Harga /“Cost”
 Digunakan solvent dengan kemampuan hampir
sama dengan harga lebih murah
 Petroleum eter lebih murah dibanding n-heksana,
keduanya mempunyai kemampuan sama
Jenis ekstrak
• Jenis ekstrak yang akan digunakan turut
menentukan metoda ekstraksi.
• Pada penggunaan ekstrak dimaksudkan untuk
makanan & obat, terdapat batasan sisa solvent
yang tergantung pada sifat ketoksikan residu.
• Ekstrak yang digunakan untuk bioassay, kriteria
khusus harus diperhatikan karena pada
umumnya bioassay dilaksanakan dalam
“aquaeous” media. Salah satu alternatif
digunakan DMSO untuk melarutkan ekstrak
yang non polar.
Solvent recycling
• “Solvent recycling” sangat penting dalam
pertimbangan lingkungan (ekologi) dan
ekonomi
• “Recovery” dan penggunaan non azeotrop
solvent (mis. Kloroform: metanol 1:1 v/v)
baik, tetapi pemisahan menjadi
komponennya sulit & mahal
• Sehingga lebih disukai solvent tunggal
Metode-Metode Ekstraksi
• Metoda ekstraksi secara umum dilakukan dengan
pelarut tertentu pada temperatur kamar dan tekanan
1 atmosfir; kadangkala temperatur dinaikkan untuk
menaikkan efisiensi. Pemilihan metoda tergantung
pada faktor-faktor tersebut diatas.
• CARA : - sari, peras, destilasi
- dingin dan panas
- dingin : maserasi, perkolasi, soxhlet
- panas : refluks, infundasi, destilasi, soxhlet
Metode Partisi/Fraksinasi
• Pengendapan
• Ekstrak Cair Cair
• Distilasi
Metode Pengendapan
• Menurunkan suhu larutan
• Mengubah kepolaran pelarut dengan
penambahan pelarut yang kepolarannya berbeda
dan dapat bercampur
• Salting-out
• Pereaksi pengendap
Pereaksi Pereaksi Pengendap
Pereaksi kompleksasi Tipe fitokimia yang
pengendap diendapkan
Larutan timbal subasetat Flavonoid, klorofil, senyawa
10% polifenol
Kalsium hidroksida (pasta) Polifenol (tanin), alkaloid
Asam pikrat Alkaloid
Dragendorff (kalium Alkaloid
iodobismutat)
Mayer (kalium Alkaloid
iodomerkurat)
Larutan gelatin 10% Polifenol (tanin)
Polivinilpolipirolidin (PVPP) Polifenol (tanin)
Ekstraksi Cair Cair
• Jika suatu cairan ditambahkan ke dalam ekstrak
yang telah dilarutkan dalam cairan lain yang
tidak bercampur dengan yang pertama akan
terbentuk 2 lapisan
Ekstrak Berganda
• Fraksinasi lebih baik menggunakan elusi
berturutan dengan volume relatif kecil
dibandingkan dengan satu kali elusi dengan
keseluruhan volume
• Contoh : Suatu ekstrak air (100 ml)
mengandung senyawa A, dengan koefisien
partisi K (kloroform:air=4:1). Ekstrak dapat
diekstraksi empat kali berturut-turut dengan 25
ml kloroform atau satu kali dengan 100 ml
Pemecahan Emulsi
• Masukkan emulsi ke dalam corong pisah yang
bersih, lalu
• Balik corong pisah secar hati-hati dalam arah
vertikal dan ketuk secara hati-hati sisinya dengan
jari atau benda yang agak keras
• Tambahkan sedikit metanol/etanol diikuti dengan
perlakuan sebelumnya
• Saring melalui kerats saring silikon pada tekanan
yang diturunkan
• Jika terdapat partikel kecil, penyaringan pada
tekanan rendah dapat dicoba
Distilasi
• Pemisahan campuran senyawa-senyawa
menguap dapat dilakukan dengan distilasi fraksi
• Distilasi fraksi bergantung pada gradien suhu
Metode Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan
komponen dari suatu campuran menggunakan prinsip
perbedaan distribusi komponen tsb dalam 2 fase,
fase gerak dan fase diam.

• Analisis
Pemisahan • Identifikasi
• Kemurnian
• Kuantifikasi
Campuran Komponen
Ilustrasi
Kromatografi
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Fasa diam yg digunakan:
TLC plate
silica gel - silicon dioxide (SiO2)x
(a common, inexpensive stationary phase)

O O O
| | |
-O-Si-O-Si-O-Si-O-H
| | | These exposed OH units
O O O give silica gel a
| | | relatively polar surface.
-O-Si-O-Si-O-Si-O-H
| | |
O O O

bulk (SiO2)x surface

Fase Gerak
• Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka,
tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena
waktu yang diperlukan hanya sebentar.
• Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2
pelarut organik karena daya elusi campuran
kedua pelarut ini dapat mudah diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat
terjadi secara optimal.
Prosedur KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
2. PENOTOLAN SAMPEL - sampel
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL
1. PERSIAPAN

• chamber
1. PERSIAPAN

• chamber

Tuangkan pelarut/eluen ke dalam chamber

setinggi < 1 cm
1. PERSIAPAN

• chamber

Agar chamber jenuh dengan eluen, masukkan

potongan kertas saring di sisi dalam chamber.
Tutup, diamkan hingga eluen naik hingga kertas
saring terbasahi semua.
1. PERSIAPAN

• plat KLT

Potong plat KLT dengan ukuran tertentu

(biasanya 2 x 10 cm)
1. PERSIAPAN

• plat KLT

Ukur 1 cm, tandai dengan pensil (jaga jangan

sampai merusak/menggores plat), buat garis
melintang setinggi 1 cm dari bawah. Ini adalah
tempat sampel ditotolkan.
Prosedur KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL
2. PENOTOLAN SAMPEL

TLC plate

“finishing line”
 1 cm.

“starting line”
 1 cm.
ACE ASP CAF ACE ASP CAF
#5 #5 #5 Ref. Ref. Ref.
2. PENOTOLAN SAMPEL

Totolkan sampel dengan mikropipet (atau batang

kapiler yang diruncingkan) sebanyak 1 atau 2 µL.
MIKROPIPET

Mikropipet, sering
disebut juga spotter,
dapat dibuat dari
batang gelas kapiler.

Panaskan/bakar
dengan api, tarik
perlahan hingga
terpisah menjadi 2
bagian.
Prosedur KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL
3. PENGEMBANGAN KLT

eluen
merambat
pada plat
3. PENGEMBANGAN KLT
3. PENGEMBANGAN KLT

A. Tempatkan plat ke dalam chamber TLC plate

B. Elusi plat dengan eluen,

hingga eluen mencapai garis atas

C. Ambil plat jika eluen sudah

mencapai garis batas atas.

eluen
}
TLC Developing Chamber
(just a glass jar with solvent in it!)
3. PENGEMBANGAN KLT

Pada saat diambil dari chamber, berilah tanda

garis dengan pensil akhir eluen.
Prosedur KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL
4. VISUALISASI BERCAK

• Langsung / mata telanjang

• Lampu UV

• Uap iodin

• Reagen penyemprot
4. VISUALISASI BERCAK

A. Biarkan eluen yg tersisa

di pemukaan plat KLT
mengering.

B. Lihat dibawah lampu UV UV light.

look for grayish spots on the UV
fluorescent green background

C. Tandai bercak dengan pensil.

Prosedur KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT / ELUSI
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL
5. INTERPRETASI HASIL

Tentukan Retention factors(Rf) masing2 bercak.

distance spot ___________

____________ has moved X
Rf = distance solvent has moved
=
Y
T

distance spot has moved

_______________________ Z
Rf = distance solvent has moved
= Y
Y
Z Z

distance spot has moved

_______________________ T
Rf = distance solvent has moved
= X
Y
perhitungan nilai Rf
• Perhitungan nilai Rf (retention factor/rate of
flow) didasarkan atas rumus :

• Nilai Rf dinyatakan hingga angka 1,0 beberapa

pustaka menyatakan nilai Rf yang baik yang
menunjukkan pemisahan yang cukup baik
adalah berkisar antara 0,2-0,8.
Troubleshooting KLT
 Bercak tidak membulat (mbleber)
 Sampel terlalu pekat. Kembangkan lagi KLT setelah sampel diencerkan.
 Sampel terlalu banyak mengandung komponen. Perlu dilakukan partisi
terhadap sampel.
 Tidak nampak bercak
 Sampel terlalu encer. Pekatkan sampel, atau tambahkan volume sampel
yang ditotolkan.
 Beberapa senyawa memang tidak menunjukkan pemadaman di bawah
lampu UV. Pakailah reagen semprot untuk menampakan bercak
(biasanya uap iodin atau serium sulfat)
Troubleshooting KLT
 Garis batas atas (akhir eluen) tidak rata
 Chamber tidak/kurang jenuh eluen (penjenuhan kurang optimum).
 Pemasangan plat dalam chamber tidak pas (miring).

 Bercak berekor
 Senyawa mengandung gugus yang bersifat asam atau basa kuat (amina
atau asam karboksilat). Tambahkan beberapa tetes NH4OH (amina) atau
asam asetat (asam karboksilat) pada eluen.
TERIMA KASIH