HPLC

(High Performance Liquid

Chromatography)

Anggota :
1. Indah Lestari
2. Yeyen Handriayu
 HPLC
Merupakan teknik pemisahan senyawa
dengan cara melewatkan senyawa melalui
fase diam (stationary phase)

Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi

dengan fase gerak (mobile phase)

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas

dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan
mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan
fase diam dan fase gerak
Senyawa yang keluar dari kolom akan
dideteksi dengan detektor yang sesuai
dan
dilaporkan sebagai kromatogram

Dari kromatogram dapat diidentifikasi

waktu
retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak
Fasa diam dan fasa gerak (HPLC)
• Dalam HPLC, zat cair (liquid) digunakan
sebagai fasa gerak

• Kolom berisi serbuk halus yang dipadatkan

(sebagai fasa diam)

• Agar zat cair dapat melewati kolom dengan

cepat, dibutuhkan bantuan pompa bertekanan
tinggi
 Syarat fasa gerak
utk menghindari adanya
Harus impurities yang akan
murni mengganggu intepretasi
pada kromatogram dan
mengotori kolom

Utk menghindarkan kolom

kotor dan tersumbat. Pelarut
harus disaring dan didegas.
Saringan digunakan nilon
diameter 0.45 mikrometer.
Mudah diperoleh

Tidak Viskous
Kekentalan tidak
melebihi 0,5 Cp
(CentiPoise)

Sesuai dengan
detektornya

Untuk deterkor RI, Untuk detektor UV,

pelarut harus pelarut tidak boleh
mempunyai indeks menyerap cahaya pada
bias yang berbeda gelombang cahaya yang
dengan solut dipakai
 Berdasarkan kepolaran fase diam dan
fase gerak

Fase Normal Fase Terbalik

(Normal (Reversed
Phase) Phase)

Fase diam
polar Fase gerak Fase gerak
(silika non-polar Fase diam non-polar
atau (heksana) non-polar (air,
alumina) metanol,)
 8

basic principles of HPLC suwedo

-1 hadiwiyoto

Jenis-jenis instrumen HPLC

 9

basic principles of HPLC suwedo

-1 hadiwiyoto
 Prinsip kerja HPLC
(Higher Potential Liquid Chromatography
Sampel yang dilarutkan
Fase gerak dialirkan
dalam solven dimasukkan
melalui kolom ke
ke dalam aliran fase
detektor dengan
gerak dengan cara
bantuan pompa
injeksi

Di dalam kolom terjadi pemiahan komponen-

komponen campuran
Berdasarkan
Perbedaan kekuatan interkasi antara (solut-
solut) dengan fase diam pada kolom

Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar dari
kolom terlebih dahulu. Sebaliknya, solut2 yang kuat berinteraksi dengan fasa
diam maka solut2 tsb akan keuar dari kolom lebih lama. Setiap komponen
campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram.
 Kromatogram HPLC serupa
dengan kromatogram GC 
jumlah peak menyatakan
jumlah komponen; luas area
peak menyatakan konsentrasi
dalam campuran
 Jenis-jenis pompa
Pompa Pompa Pompa
Reciprocating Displacement Pneumatic

Pompa ini menyerupai alat

Pompa ini terdiri suntik terdiri dari tabung
dari ruangan kecil yang dilengkapi
pendorong yang digerakan
tempat pelarut
oleh motor. Pompa ini juga
yang dip0mpa menghasilkan aliran yang
dengan cara cenderung tidak bergantung
gerakan piston tekanan baik kolom dan
(mundur maju). viskositas pelarut. Selain
Piston berupa itu, keluaran pompa ini
batang gelas dan bebas pulsa. Akan tetapi
berkontak pompa ini keterbatasan
kapasitas pelarut mL dan
langsung dengan
tidak mudah untuk
pelarut melakukan pergantian
pelarut.
Dalam pompa ini
pelarut di dorong
oleh gas bertekanan
tinggi. Pompa jenis
ini murah dan bebas
pulsa. Akan tetapi
mempunyai
keterbatasan
kapasitas dan
kecepatan alir
bergantung
pada viskositas
pelarut dan tekanan
balik kolom.
Pump
• Flow rate range: 0.01 to 5 mL/min
• Flow rate stability: not more than 1%
• For flow rate stability should be less than 0.2%
• It is desirable to have an integrated degassing
system, either helium purging, or membrane
filtering.
 14

basic principles of HPLC

-1

Pump
• The role of the pump is to force a liquid (called
mobile phase) through the liquid chromatograph at
a specific flow rate, expressed in ml/min
▫ Normal flow rates in HPLC are in the 1-2 ml/min
range
▫ Typical pumps can reach pressures in the range until
600 psi
• During the cromatographic experiment, a pump can
deliver a constant mobile phase composition
(isocratic) or an increasing mobile phase
composition (gradient).

UV / Visible detector
Advantages
• Hingsensitivity & small sample
volume required
• Can be used with gradient
elution
• Is relatively cheap and not
sensitive to temperature
• Sensitive to large number of
organic compounds
15
basic principles of HPLC suwedo
-1 hadiwiyoto
•Disadvantages
Does not work with
compounds that do not absorb
light at this wavelength region
• Cannot be used with the
solvents having large
absorption in the UV region
• Cannot be used for the sample
components which cannot be
absorbed in the UV region