Pewarnaan Gram

Praktikum Blok 10
Mikrobiologi
7 September 2013
 Pewarnaan
 Membuat struktur internal dan eksternal
terlihat dengan cara meningkatkan
perbedaan dengan latar belakang
 Tipe – tipe pewarnaan
1. Pewarnaan Negatif
2. Pewarnaan sederhana
3. Pewarnaan diferensial:
a. Pewarnaan Gram
b. Pewarnaan Tahan Asam (Ziel-Neelsen Method)
c. Pewarnaan Spora (Schaeffer-Fulton Method)
4. Pewarnaan Khusus:
a. Pewarnaan kapsul
b. Pewarnaan flagel
c. Pewarnaan fluoresensi
Pewarnaan Sederhana

 Pada pewarnaan ini hanya

digunakan satu maçam zat
pewarna.
 Pewarnaan ini biasanya hanya
digunakan untuk mengamati
bentuk-bentuk morfologi
seperti kokus, basil, spíral dan
bermacam-macam variasinya
 Pewarnaan diferensial

• Pewarnaan differensial menggunakan 2

macam zat pewarna yang memíliki sifat
berlawanan.
• Tujuan pewarnaan ini umumnya untuk
pemisahan kelompok seperti pewarnaan
Gram dan pewarnaan tahan asam serta
visualisasi perbedaan struktur seperti
pewarnaan flagella, kapsul, spora dan
pewarnaan inti.
Property Gram-positive Gram-negative

Thickness of wall thick (20-80 nm) thin (10 nm)

Number of layers 1 2
Peptidoglycan (murein)
>50% 10-20%
content
Teichoic acids in wall present absent

Lipid and lipoprotein content 0-3% 58%

Protein content 0 9%

Lipopolysaccharide content 0 13%

no (some
Sensitivity to Penicillin G yes
exceptions
Sensitivity to lysozyme yes no
Gram Positive: Has a thick peptidoglycan (murein) layer and teichoic acids. Teichoic
acid is responsible for the antigenic determinant of the organism.
Gram Negative:Has a thin peptidoglycan layer with an outer membrane (made of protein,
phospholipid and lipopolysaccharide) attached by lipoproteins. In the lipopolysaccharide, the
lipid portion is embedded in the phospholipid and the O antigen polysaccharide is on the
surface. The lipid is called Lipid A and it is toxic, but the whole lipopolysaccharide is called an
Endotoxin.
 Prosedur pewarnaan gram
1. Sedikit sampel kultur bakteri
diambil dari kulturnya. Dalam
contoh ini itu sedang diambil
dari kultur broth mikroba
murni.
.
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

2. Suspensi bakteri diletakkan di

atas kaca preparat. Jika
bakteri telah diambil dari
suatu kultur pada media
padat, maka akan segera
dicampur sedikit dgn
aquadest.
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

3. Apusan bakteri kemudian

dikeringkan secara pelan-
pelan pada mulanya, ketika
kering, dipanaskan untuk
beberapa detik secara
langsung. Fiksasi ini akan
membunuh bakteri dan
pemanasan jangan terlalu
panas.
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

4. Setelah dingin, preparat

dipindahkan ke bak tempat
pewarnaan dan diwarnai
dengan pewarnaan kristal
violet dan dibiarkan sekitar 1
menit. Pewarnaan ini pada
seluruh bakteri dipreparat
memperlihatkan warna ungu
gelap.
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

5. Kristal violet dilunturkan

dengan air yg mengalir
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

6. Apusan bakteri kemudian

diwarnai dengan larutan
Gram-iodine. Larutan ini akan
membentuk kompleks iodin
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

• 7. Setelah sekitar 30 detik

preparat dibilas dengan
alkohol 96% (biarkan saja
mengalir pada preparat) yang
menyebabkan zat warna
iodine kompleks, beberapa
bakteri dapat hilang tetapi
tidak yg lainnya. Hal ini yang
disebut decolourisasi.
Jangan berlebihan pada
tahap ini!
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

• 8. Counter stain dengan

safranin selama 1-2 menit.
 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

9. Bilas lagi dengan air

 Prosedur pewarnaan gram….(lnjtn)

• 10. Setelah counterstain

dibilas dan terlepas dari
preparat, preparat diletakkan
di antara beberapa kertas
penyerap dan air dapat lepas
dari preparat. Perlakuan ini
tidak dilakukan untuk pada
bagian yang akan diamati
dibawah nikroskop.
Garis besar pewarnaan gram
 Demos: Gram stained slides of
Neisseria, Streptococcus, Pseudomonas, Actinomyces species.

Pseudomonas

Neisseria

Streptococcus
Cryptococcus
neoformans

Pewarnaan kapsul
 Jadwal
1 - 36 08.00 – 08.45

37 – 72 08.45 – 09.30

73 - 108 09.30 – 10.15

109-144 10.15 – 11.00