Anda di halaman 1dari 21

P O LY M E R A S E

CHAIN REACTION
(PCR)

T I A R A L E S TA R I PA E M B O N A N ( 1 8 7 2 8 2 5 1 0 0 8 )
M U H A M M A D A R I F M . A R S YA D ( 1 8 7 2 8 2 5 1 0 1 2 )
PRINSIP UMUM PCR

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan


beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada
setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA target
untai ganda

Untai ganda DNA template (unamplified DNA)


dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian
didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu
untuk memberi waktu pada primer menempel pada
daerah tertentu dari DNA target
PRINSIP UMUM PCR

Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer


dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan
buffer. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus,
namum secara umum digunakan 30 siklus
PRINSIP UMUM PCR

Jumlah kopian fragmen DNA target yang dihasilkan pada


akhir siklus PCR dapat dihitung secara teoritis menurut
rumus:

𝒀 = 𝟐𝒏 − 𝟐𝒏 𝑿
Ket :
Y = jumlah amplifikasi
n = jumlah siklus
X = jumlah molekul DNA template semula
KOMPONEN PCR
1. DNA template
2. Sepasang primer oligonukleotida
3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)
4 . B u f f e r P C R , i o n M g 2+ d a r i M g C l 2 d a n a i r d i s t i l a s i
5. Enzim polimerase DNA
1. DNA template

Dalam proses PCR, DNA template yang dapat


b eru pa DNA kro moso m atau DNA plasm id
berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan
molekul DNA baru yang sama.
DNA template untuk proses PCR disiapkan
dengan metode lisis sel atau isolasi DNA
kromosom / DNA plasmid.
2. Primer oligonukleotida

Dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai


pembatas fragmen DNA target yang akan
diimplifikasi serta menyediakan gugus
hidroksi (-OH) untuk proses eksistensi DNA.
Perancangan primer dilakukan berdasarkan
urutan DNA yang telah diketahui serta
memenuhi beberapa kriteria:
a. Panjang primer
b. Komposisi primer
c. Melting temperature (Tm)
d. Interaksi primer-primer
3. dNTPs

Dalam proses PCR, dNTPs ber tindak sebagai


building block DNA yang diperlukan dalam
proses eksistensi DNA. Campuran ini terdiri
a t a s d A T P, d T T P, d C T P d a n d G T P y a n g a k a n
menempel pada gugus –OH dari primer
membentuk untai baru yang komplementer
dengan untai D NA template.
4. Buffer PCR, MgCl2 dan air distilasi

Dalam proses PCR, buf fer berfungsi untuk


menjamin pH medium karena PCR hanya akan
berlangsung pada pH tertentu. MgCl2 yang
mengandung ion M g 2+ bertindak sebagai
kofaktor untuk menstimulasi aktivitas enzim
polimerase DNA. Air distilasi berfungsi
sebagai medium bagi komponen lainnya.
5. Enzim polimerase DNA

Dalam proses PCR, enzim polimerase


diperlukan pada tahap eksistensi DNA yang
berfungsi sebagai katalis untuk reaksi
polimerisasi. Enzim ini diperoleh dari isolasi
bakteri termofilik dan hipertermofilik.
Aktivitas enzim polimerase DNA bergantung
dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut
diisolasi.
TAHAPAN PCR
1. Pra-denaturasi DNA template
2. Denaturasi DNA template
3. Annealing (penempelan primer pada DNA
template)
4. Extention (pemanjangan primer)
5. Post-extention (pemantapan)

Ta h ap 2 – 4 m e ru paka n t a h ap an b e ru lan g
(siklus), dimana setiap siklus terjadi
duplikasi jumlah DNA
1. Pra-denaturasi DNA template

Dalam proses ini, komponen PCR dipreparasi


dalam suatu tabung reaksi kemudian
dipanaskan pada suhu 94 - 96 ℃ selama 2 – 10
menit. Ta h ap a n ini dilakukan untuk
mengaktifkan enzim polimerase DNA dan
mendenaturasi kontaminan dalam campuran.
2. Denaturasi DNA template

Dalam proses ini terjadi pemisahan DNA untai


ganda menjadi DNA untai tunggal melalui
pemanasan pada suhu 93-95℃ yang berlangsung
selama 30-90 detik untuk meyakinkan bahwa
molekul DNA telah terdenaturasi menjadi DNA
untai tunggal.

Untai ganda DNA target Untai tunggal terdenaturasi

Untai tunggal terdenaturasi


3. Annealing

Dalam proses ini, primer akan menempel pada


ujung DNA target yang berlangsung 30 – 45
detik pada suhu 50 - 60 ℃ . Pemilihan suhu
berkaitan dengan Tm primer yang digunakan.

Untai DNA template #1

Primer oligonukleotida
Primer oligonukleotida

Untai DNA template #2


4. Extention

Dalam proses ini, enzim polimerase DNA akan


memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer
pada suhu 72 ℃ selama 30-60 detik.

Untai DNA template #1

Enzim polimerase DNA Enzim polimerase DNA

Untai DNA template #2


DNA template

Duplikasi DNA
siklus 1

Duplikasi DNA
siklus 2
5. Post-extention

Proses ini bersifat optional yang dilakukan


pada suhu 72 - 78℃ selama 5 – 15 menit . Proses
tersebut dilakukan untuk memas tikan bahwa
untai-untai DNA sepenuhnya telah
diperpanjang. Produk kemudian disimpan pada
suhu 4 - 15 ℃ untuk penyimpanan jangka
pendek.
PROSES PCR
#1
PROSES PCR
#2
THANK YOU