Histopatotehnologi - 2

Evalina P Manurung
 Pemeriksaan tahap analitik

• Penerimaan spesimen
• Pemotongan
• Pencatatan makroskopik
• Pengolahan spesimen (manual/mesin)
• Pembuatan blok parafin
 Penanganan Jaringan
• Persiapan wadah yg besarnya sesuai dgn jaringan
yg akan disimpan.
• Isi wadah dgn formalin bufer dgn volume min. 5x
volume Jaringan.
• Masukkan sesegera mungkin jaringan segar ke
dalam wadah formalin (kurang dari 30mt)
• Jika jar. berukuran besar (mastektomi) irisan
sejajar berjarak ± 1cm, tanpa merusak konstruksi
bentuk.
• Beri label identitas pasien dan jenis jar. yg diambil
 Penerimaan spesimen
1. Memeriksa kelengkapan administrasi
identitas pasien (nama, jenis kelamin, usia,
jumlah/jenis spesimen). petugas loket
2. Memeriksa kembali kesesuaian ant spesimen
dgn ket dlm formulir pengantar.
3. Memeriksa apakah cara fiksasi sdh benar.
Tahap 2 & 3 dilakukan oleh teknisi kamar potong
 Fiksasi
• Diff: stabilisasi unsur penting pd jaringan shg
unsur tsb tidak terlarut, berpindah, atau
terdistorsi selama prosedur selanjutnya.
• Tahap yg sgt penting & harus dilakukan dgn
sempurna menggunakan zat fiksator yg baik.
• Kesalahan yg dilakukan pd tahap ini, tidak akan
pernah dapat diperbaiki lagi pd tahapan
selanjutnya.
• Hasil akhir sajian histologi yg baik sangat
tergantung pd cara melakukan fiksasi yg baik.
 Tujuan fiksasi
1. Mencegah terjadinya autolysis & pengaruh
bakteri
2. Mempertahankan bentuk & isi jaringan
mendekati keadaan sebelum difiksasi.
3. Memungkinkan proses pengolahan jar.
Selanjutnya berjalan dgn baik.
4. Mempertahankan komponen jar. atau sel
(mengusahakan agar sesedikit mungkin
molekul yg hilang pd proses selanjutnya).
 Manfaat Fiksasi
• Sel & jar keadaannya sama seperti hidup
• Membunuh Bakteri
• Mematikan sel secara serentak
• Mengeraskan jaringan
• Melindungi sel dari proses selanjutnya
• Mempermudah pengecatan
• Melindungi sel/jar dari autolysis
Faktor yg mempengaruhi proses fiksasi
1. Penetrasi
• Jenis fiksasi: formalin & alkohol yg terbaik,
glutaraldehida yg terburuk.
• Ketebalan jaringan : 3-5mm (terbaik) & 1cm (rutin)
2. Volume Pengawet
10 x volume jaringan (min. 5 x vol. jaringan)
3. Konsentrasi
Konsentrasi formalin terbaik : 10% , glutaraldehida pd
0,25% - 4%.
Konsentrasi yg terlalu tinggi dpt menimbulkan artefak.
Faktor yg mempengaruhi proses fiksasi

4. Interval waktu
• Jar. harus segera difiksasi (kurang dari 30mt
setelah dikeluarkan/dipisahkan dari tubuh)
• Semakin lama jaringan menunggu unt
difiksasi, semakin banyak kehilangan organel
sel & pengerutan nukleus  banyak artefak
terbentuk
• Bila belum mendapat fiksasi, rendamlah dlm
lar. garam fisiologis.
Faktor yg mempengaruhi proses fiksasi
5. Suhu
Peningkatan suhu, akan meningkatkan laju
fiksasi. Formalin panas akan mengawetkan
lebih cepat
6. Jenis Larutan Pengawet
Jenis lar. fiksasi yg digunakan bergantung pd
jenis unsur jaringan yg ingin didemonstrasikan
& pewarnaan yg akan dilakukan.
 Jenis larutan fiksasi
(menurut komposisinya)
1. Lar. Fiksasi sederhana:
Hanya mengandung satu macam zat saja.
cont: etanol 70-100% ; Formaldehyde 4-10%;
Asam asetat 0,3-5% ; Asam pikrat ; asam
Chromiat 0,5-1 %.
2. Lar. Fiksasi campuran/majemuk:
Mengandung lebih dari satu macam zat.
cont: larutan Bouin ; Larutan Zenker
 Jenis larutan fiksasi
(menurut mekanisme kerja)
Aldehydes
• Cont: formaldehida (formalin) & glutaradehida
• Formalin: jar. terawetkan oleh cross-linkage yg
terbentuk pd protein  tidak banyak m’ganggu
struktur protein shg antigenisitas tidak hilang.
• formaldehida cocok unt teknik
imunoperoksidase.
• Formalin menyusupi jar. dgn baik, tetapi relatif
lambat. banyak digunakan unt kondisi yg tak
ideal & tak ada jaringan yg dirusaknya.
• Glutaraldehida menyebabkan deformasi struktur
heliks-alfa protein  tidak baik unt
imunoperoksidase.
• Glutaraldehida mengawetkan dgn sangat cepat
(baik unt mikroskopi elektron), penetrasi dgn
lambat, tetapi memberi rincian sitoplasma &
nukleus.
• Glutaraldehida harus dlm keadaan dingin.
Jaringan haruslah sesegar mungkin dan irisan
jaringan tidak boleh lebih tebal dari 1 mm (unt
meningkatkan pengawetan).
Mercurials
• Memiliki kemampuan rendah dalam hal penetrasi &
menyebabkan bbrp jar. mengeras.
• Bekerja cepat & m’berikan rincian nukleus yg sangat
bagus.
• Penggunaan terbaik unt pengawetan jaringan
hematopoietik & retikuloendotel.
Oxidizing agents
• Cont: permanganat (kalium permanganat), dikromat
(kalium dikromat), dan osmium tetroksida.
• Pengawet ini menimbulkan cross-link protein, tetapi
menyebabkan denaturasi yg berlebihan.
Alcohols
• Cont: metil alkohol (metanol) & etil alkohol (etanol)
• Mekanisme kerja dgn denaturasi protein  tidak rutin
digunakan ok menyebabkan terlalu rapuh & keras.
• Kemampuannya sangat bagus unt apusan sel ok
kerjanya cepat & memberi rincian nukleus yg bagus
Picrates
• Cont: asam pikrat, yg terkenal adalah lar. Bouin.
• Hampir sama baiknya dgn merkuri dlm hal rinci nukleus
ttpi tidak banyak menimbulkan pengerasan jar.
• Direkomendasikan unt pengawetan jar. testis, sal. cerna
& endokrin. Cukup baik unt mengawetkan jar.
hematopoiesis
Larutan Fiksasi yg sering digunakan

• Lar. Formalin
• Lar. Muller
• Lar. Bouin
• Lar. Zenker Formol (Cairan Helly)
• Lar. Etil Alkohol (Etanol/Alkohol)
• Lar. As Asetat−Alkohol−Formalin (Tellyesniczky)
• Lar. Heidenhain’s Susa
• Lar. Carnoy
 Kelebihan lar. formalin
• Merupakan cairan pengawet umum;
• pH mendekati netral;
• Pigmen formalin (acid formaldehyde haematin)
tidak terbentuk;
• Potongan jaringan dpt ditinggalkan di dalam
cairan formal-saline untuk jangka waktu lama
(dapat s/d 1 thn) tanpa ada perubahan yg berarti;
• Bila diperlukan, jaringan yg direndam dlm cairan
fiksatif ini dpt diambil & dimasukkan ke dalam
cairan fiksatif lain.
 Kekurangan lar. formalin
• Jar. yg difiksasi dgn cara rendam memerlukan
waktu ± 24 jam baru dapat diproses.
• Terjadi pengerutan pd jar. oleh alkohol dalam
proses dehidrasi.
• Formaline-saline menjadi asam saat disimpan
lama karena formaldehida teroksidasi menjadi
asam format.
• Jaringan yg disimpan bbrp bulan sering gagal
menghasilkan pewarnaan yg baik.
 Pigmen formalin
• Terbentuk bila terdapat interaksi antara larutan
formalin ber-pH asam dengan hemoglobin atau
produknya.
• Sering dijumpai pada organ yang mengandung
banyak darah seperti hati, limpa, dan sumsum
tulang.
• Dapat dihilangkan dengan perlakuan asam pikrat-
alkohol atau larutan alkohol 1% dalam natrium
hidroksida (NaOH) saat rehidrasi irisan jaringan
(rendam selama ½ - 2 jam)
 Cara pembuatan zat
fiksasi formalin
• Lar. Formaldehide 40%
............................100cc
• Aquadest.............900cc
• Sodium dihidrogen fosfat
monohidrat.........4.0g
• Disodium hidrogen fosfat
anhidrat..............6,5g
Cara fiksasi yang benar
• Fiksatif berupa lar.
Formalin 10% bufer fosfat
• Vol. fiksatif min. 5x vol.
spesimen
• Jar. besar dibuat sayatan
sejajar dgn jarak 0,5-1cm
• Jar. siap diproses bila sdh
terfiksasi dgn sempurna
(matang) konsistensi
keras dan berwarna
putih/coklat.
 Pemotongan jaringan
• Prinsip dasar: mengambil bagian jaringan yang
representatif.
• Potongan dgn tebal max. tidak melebihi tebal
kaset jar.  masukkan dlm kaset yg sdh di beri
nomer sesuai no. formulir.
• Banyak potongan bergantung pd jenis jaringan
dan besar jaringan. Ada bbrp organ yg
memerlukan jumlah potongan tertentu.
• Setelah jaringan dimasukkan kedalam kaset &
ditutup, kaset dimasukkan ke dlm wadah berisi
formalin 10% bufer fosfat.
Organ yg memerlukan jumlah potongan tertentu

• Uterus: ekto-endoservik, endometrium, myometrium,

tumor, bag penting lain
• Usus: ujung sayatan, batas sehat sakit, dalamnya
infiltrasi, tumor, nodul limfoid.
• Turr prostat: 4 kaset/10cc
• Huvos pd osteosarkoma: min 10 kaset
• Mata: batas sayatan nervus, tumor, bola mata.
• Tulang/kulit: batas operasi , tumor.
• Payudara: putting, batas tumor terjauh & terdekat,
tumor
• Tiroid : min 9 kaset
 Pencatatan makroskopik
• Ukuran, warna, konsistensi & bentuk permukaan
jaringan
• Apakah ada perkapuran, perdarahan, nekrosis
• Daerah potongan jaringan yg diambil.
• Jumlah potongan yang diambil.
• Ukuran, letak, konsistensi & bentuk tumor
• Cont: jaringan compang-camping vol ±2cc warna coklat
kehitaman, kenyal, semua dicetak. 3 kaset atau
jaringan berbentuk oval ukuran 3x5x2cm warna putih
kekuningan, kenyal, sebagian dicetak 2 kup 2 kaset
 Prosesing jaringan
• Fiksasi :
Untuk mempertahankan morfologi sel dan jaringan sesuai dengan
struktur aslinya.

• Dehidrasi :
 Tujuan : menarik cairan atau cairan fiksasi dari sel dan jaringan
 Dengan alkohol konsentrasi bertahap

• Clearing :
 Tahap transisi antara dehidrasi dan infiltrasi, dengan bahan yang dapat
bercampur baik dengan larutan dehidran maupun medium infiltrasi,
sehingga alkohol dapat keluar  parafin masuk ke dalam jaringan
 Larutan xylol
 Prosesing jaringan
• Impregnasi (infiltrasi):
 Proses penggantian cairan di dalam sel pada jaringan
dengan parafin, titik lebur 60oC
 Jaringan direndam dalam parafin cair

• Embedding :
 Suatu proses penanaman jarngan di dalam medium yang
cukup kokoh untuk mendukung jaringan ketika dipotong
tipis
 Diberi parafin cair hingga menutupi kaset
 Metode prosesing jaringan
• Penyempurnaan fiksasi: formalin 10%........0-3j
• Dehidrasi: Alkohol 70%...............................1/2j
Alkohol 95%...............................1/2j
Alkohol 100%.............................1j
Alkohol 100%.............................1j
Alkohol 100%.............................1j
Alkohol 100%/xylol....................1/2j
• Clearing: Xylol.............................................1j
Xylol.............................................2j
• Impregnasi: Parafin.....................................2 1/2j
Parafin.....................................4j
 Metode prosesing jaringan
(manual/jalan tangan)
• formalin 10%..............................0-3 jam
• Alkohol 70%...............................20 menit
• Alkohol 95%...............................20 menit
• Alkohol 100%.............................20 menit
• Alkohol 100%.............................20 menit
• Xylol I.........................................20 menit
• Xylol II........................................20 menit
• Xylol III.......................................20 menit
• Parafin.......................................30 menit
• Parafin.......................................30 menit
 Prosesing jaringan
(menggunakan mesin)
Citadel Elcesior
• Formalin 2x 30 menit
• Formalin 2x 2 jam • Alkohol 70% 2x 1 jam
• Alkohol 96% 2x 1 jam • Alkohol 96% 2x 1jam
• Etanol 100% 4x 1 jam • Etanol 100% 2x 1jam
• Xylol 2x 1 jam • Xylol 3x 1jam
• Parafin wax 2x 1 jam • Parafin wax 3x 1jam
 Pembuatan blok parafin
• Penting unt diperhatikan adalah orientasi
jaringan (terutama kulit).
• Diperhatikan jg jenis jaringan (kulit, dinding kista,
tuba falopii, nervus optikus, apendiks)
• Jumlah jaringan sesuai dgn formulir/ket. di kaset.
• Dipestikan seluruh jaringan berada dipermukaan
• Memeriksa nomer pd blok parafin msh jelas
sebelum dipotong.
• Sebelum pemotongan, blok parafin di trimming
terlebih dahulu.
 Mikrotom
• Alat unt memotong irisan sangat tipis yg digunakan unt
menyayat jaringan sebelum ditempelkan ke atas
permukaan slide.
• Secara garis besar mikrotom dibagi menjadi 2 golongan:
1. Mikrotom Schantz  mikrotom dimana pd saat
menyayat, blok jaringan yg hendak disayat tetap diam
di tempatnya sementara pisau melewati blok parafin
tsb. sayatan yg dihasilkan terpisah satu sama lain.
2. Mikrotom Spencer  mikrotom dimana pd saat
menyayat dpt menghasilkan pita sayatan yg panjang
sehingga sangat cocok untuk pembuatan preperat
sayatan serial.
 Bagian-bagian terpenting mikrotom:

1. Skala pengatur ketebalan sayatan (di bagian

kanan atas badan mikrotom). skala ini dapat
digeser ke kiri dan ke kanan sesuai dgn
ketebalan sayatan yg diinginkan.
2. Pisau mikrotom  komponen yg bisa
menentukan kualitas sayatan.
3. Pegangan blok jaringan  komponen yg
menghubungkan mikrotom dgn blok jaringan yg
hendak disayat.
4. Pengatur jarak berfungsi untuk mengatur blok
jaringan dgn mata pisau
 Jenis mikrotom
(yang paling umum digunakan)
• Mikrotom Putar,  sayatan parafin dan teknik kriostat.
• Mikrotom geser,  sayatan nitroselulase atau palstik
• Mikrotom klinis beku,  keperluan diagnosis
yg bersifat segera.
• Mikrotom sayatan ultra tipis,  menghasilkan sayatan
dgn ketebalan < 1 milimikron
• Mikrotom base sledge,  menyayat jaringan yg sangat
besar seperti otak
• Mikrotom faust,  ketipisan max. 254 milimikron
• Mikrotom Smith & farguhur,  menyayat jar. segar yg
tidak difiksasi.
 JENIS MATA PISAU JENIS-JENIS PISAU
MIKROTOM: MIKROTOM

• Wedge • Stellite tipped

• Planoconvex • Cobalt tipped
• Biconcave • Tungsten tipped
• Tool Edge • Diamond
• Glass
• Disposible
 Perawatan mikrotom

• Mikrotom sebaiknya ditutup dgn plastik, atau

dimasukkan ke kotaknya jika tidak sdg digunakan.
• Jangan memindahkan mikrotom dgn cara
memegang bagian yg dpt bergerak, karena dapat
menggangu akurasinya.
• Sebelum & sesudah digunakan, mikrotom
dibersihkan dari serpihan parafin  melap dgn
kain lap yg telah dibasahi dgn xilol.
• Mikrotom harus selalu diminyaki unt mencegah
keausan & kemacetan.
 Persiapan yg harus diperhatikan
• Persiapan pisau mikrotom
Pisau mikrotom harus tajam agar jaringan dpt
dipotong dgn baik & tidak koyak.
• Persiapan Kaca Objek
Kaca objek yg akan direkatkan preparat harus telah
dicoated (disalut) dgn zat perekat seperti albumin
(putih telur), gelatin atau tespa
• Persiapan Waterbath dgn temperatur 60-650C
• Persiapan spatel atau kuas.
• Blok jaringan harus dingin
• Ketebalan pemotongan harus disesuaikan dgn jenis
jaringan.
Terima kasih