Mikrobiologi Terapan

ISOLASI, SELEKSI & IDENTIFIKASI

MIKROBA

Departemen Biologi F. MIPA UNPAD

 MIKROBA INDUSTRI
Mikroba  kunci keberhasilan suatu fermentasi/ kultivasi

Kriteria Mikroba Industri :

 Merupakan galur murni
 Sifat genetiknya stabil
 Dapat menghasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit
reproduktif lain
 Mampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasi
 Mampu menghasilkan produk yang diinginkan dalam
waktu yang pendek & tidak menghasilkan produk
sampingan yang toksik
 Mampu melindungi diri /bertahan thd. pengaruh
lingkungan /kontaminan (pH, suhu, inhibitor)
 Dapat disimpan dalam jangka waktu yang panjang
 Galur dapat dikembangkan kualitasnya (mutasi,
rekayasa genetika), sehingga produksinya meningkat
Sumber Mikroba

 Sumber alami (tanah, air, tanaman/hewan, limbah dll) atau

lembaga koleksi kultur  jumlah dan jenis mikroba sangat
beragam

 Seleksi mikroba yang akan digunakan untuk industri :

Isolasi mikroba, sehingga diperoleh kultur murni (semua
sel dlm populasi identik & berasal dari sel induk yang sama
 sifat morfologi & fisiologi seragam).

Seleksi sehingga diperoleh galur dengan kinerja terbaik

Identifikasi dengan menggunakan metode yang sesuai,

sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba tersebut 
e.g Bergey's manual panduan membedakan spesies bakteri
berdasarkan perbedaan fenotip isolat

 Mikroba yang telah diperoleh harus disimpan dengan teknik

penyimpanan waktu yang panjang.
ISOLASI

 Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari

campuran biakan mikroba di alam  sel individu terpisah

Sebelum mengisolasi, harus diketahui :

- mikroba apa yang akan diisolasi
- habitat
 menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam ,
lokasi dan media apa yang akan digunakan
 Metode Pengambilan Contoh

- Contoh berupa padatan (tanah, serpihan batu, kayu dll) :

 Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset
steril
 Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril

- Contoh berupa cairan atau semi cair (air, lumpur dll) :

 Diambil menggunakan pipet steril
 Penyimpanan contoh menggunakan botol atau tabung
polipropilen steril

Contoh segera dibawa ke laboratorium

(bila jarak jauh, gunakan es batu pada wadah penyimpanan)

Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu

dingin (kulkas)
Teknik Isolasi Kultur Murni :

- 1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran

(Spread-plate)
- 2. Penuangan (Pour-plate)
- 3. Kultur Yang Diperkaya (Enrichment Culture)
- 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
- 5. Isolasi Sel Tunggal
1. Teknik Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran
(Spread-plate)
 Umumnya digunakan untuk memperoleh kultur murni
mikroba yang tidak berhasil ditumbuhkan pada media
padat dan hanya dapat tumbuh pada media cair
Untuk bakteri paling sesuai  menggunakan agar cawan
Sampel

Pengenceran berseri dg larutan

garam fisiologis (0,85 %)

Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran

(batang gelas) pada media agar  koloni tumbuh
menyebar

Penggoresan dilakukan berulang, sehingga

Diperoleh kultur murni

1 sel  1 koloni
 Cara Penggoresan Kultur pada Agar Cawan ;
1. Goresan Langsung
2. Goresan Kuadran
3. Goresan Radian

Goresan Kuadran

http://www.personal.psu.edu/faculty/k/h/khb4/enve301/301labs/301labgraphics
/streak.gif
 Metode Penggoresan
 Dengan penggoresan terjadi pengenceran sel secara gradien
Goresan langsung
Goresan radian (unt
Unt mengkultur mikroba)
mengkultur mikroba)

Goresan Kuadran (isolasi koloni tunggal untuk

mempelajari mikroba)
http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-
culture.html
Teknik Penyebaran (Spread-plate)
Batang gelas

http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-
culture.html
 Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri
& menggunakan peralatan yang sederhana
 Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat
digunakan/disebarkan pada media
 Dua sel dapat bergabung menjadi membentuk satu
koloni
Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak
 pencegahan dengan menambahkan deterjen

2. Teknik Penuangan (Pour-plate)

 Prinsip : pengenceran contoh dengan media agar cair

(+/- 450C) alam tabung reaksi, sehingga distribusi
sampel merata  dituang ke petri dish & dibiarkan
mengeras pada suhu ruang, lalu diinokulasi
 Tidak cocok untuk isolasi mikroba psikrofilik
 Teknik Penuangan (Pour-plate)

Sampel +/- 1 g)
....
1 ml
. ...
. ... A
A Agar cair …..
. Diperiksa

....
. .. .. . B
B
Koloni terisolasi
Suspensi Pengenceran
Penuangan
Bakteri Dibiarkan mengeras
. .
.. C
C
Inkubasi

Tahap I Tahap II Tahap III

Media agar miring

http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap06/lecture5.htm
 Metode Penuangan  Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif
(morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba)

 Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan

menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus
sebelum penanaman pada agar cawan
Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora  contoh terlebih dulu
diberi perlakuan pemanasan s.d 850C selama 5 menit

 Media Selektif :
- Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari
faeces
- Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : Salmonellae

 Media Diferensial :
- Media agar EMB (eosin-methylene blue agar)  terbentuk
koloni berbeda & mudah dikenali
E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik
Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda
 3. Kultur Yang Diperkaya

 Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat

fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat)

 Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi

inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri
tertentu

1 2 3 4

Media cair dgn substrat khusus

Contoh : bakteri tanah :
α-conidendrin

(+) (-)

Verifikasi
4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

 Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat

dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba lain.
Contoh : S. lactis dalam susu asam

 Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya

mengandung 1 galur mikroba

 Perlu dicek kemurnian kultur

Serial-dilution Method
http://dc338.4shared.com/doc/9lEZll1X/preview.html
5. Teknik Isolasi Sel Tunggal

a. Metode Mikromanipulator

 Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung

dengan mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba
tunggal dari sampel

 Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol

gerakan mikropipet (tabung kapiler) di bawah lensa
obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal & dipindahkan
ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media
yang sesuai

 Lebih cepat, namun kelemahannya :

- alat mahal
- operator harus trampil
Micromanipulator

http://eatingforaquadrillion.blogspot.com/2011/07/how-to-get-single-cell.html
Micromanipulator
b. Metode Kapiler untuk mendapatkan sel tunggal mikroba
-Beberapa tetes media yang mengandung mikroba,
ditempatkan pada penutup gelas obyek steril menggunakan
pipet kapiler steril.
-Dengan menggunakan mikroskop, cari tetesan yang
mengandung hanya 1 mikroba. Tetesan tsb dipindahkan
dengan pipet kapiler steril ke media segar  mikroba
tunggal yang berada pada tetesan mulai berbiak untuk
menghasilkan kultur murni.
Pembuktian Kemurnian Kultur

Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur

murni  perlu dilakukan pengujian dengan kriteria
sbb. :

(Kultur murni : sel-sel mikroba yang ada  sejenis)

1. Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan

menunjukkan hasil pewarnaan yang sama
2. Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni
menunjukkan kesamaan .
3. Hasil penggoresan dll seragam
4. Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan /
karakteristik identik, contoh memfermentasi gula
yang sama dll
 SELEKSI & IDENTIFIKASI
SELEKSI

Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik

 - rendemen lebih tinggi
- tidak menghasilkan produk sampingan yang
tidak dikehendaki
- peningkatan kemampuan penggunaan sumber C
dan N yang murah  penurunan biaya prod.
- Perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang
lebih mudah dipisahkan dari produk

 Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba :

1. Mutasi
2. Rekombinasi
 Taksonomi (klasifikasi) :
penataan teratur unit-unit ke dalam kelompok satuan yang lebih
besar
 hierarkhi klasifikasi :
spesies  genus  familia  orde  kelas  filum atau
divisi

Spesies : satuan atau kelompok dasar dalam semua sistem

klasifikasi organisme

 Nomenklatur :
penamaan satuan-satuan yang dicirikan dan dibatasi oleh klasifikasi
 binomial nomenklatur : menggunakan nama kombinasi biner
Latin, misalnya Rhizopus oryzae

 Identifikasi :
penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan
nomenklatur untuk mengidentifikasi mikroba dengan
membandingkan dengan ciri-ciri/ karakteristik yang ada
 a.l Menggunakan kunci-kunci identifikasi yang sesuai
Contoh : Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
 Contoh identifikasi bakteri :
- tidak terdapat bakteroklorofil
- sel tidak berbentuk filamen
- Gram positif
- berbentuk batang
- menghasilkan endospora
- Katalase positif
- Aerobik
- Nitrit negatif
- VP (Voges Proskauer) negatif
 Bacillus megaterium

Identifikasi Kapang :
 a.l. berdasarkan spora dan miselium

Identifikasi khamir :
 a.l. berdasarkan spora & kemampuan memfermentasi gula
sebagai sumber karbon
IDENTIFIKASI
 Setelah diperoleh kultur murni, dilakukan identifikasi

 Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan

menggunakan ciri/karakteristik :

1. Morfologis
Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya
flagela, kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop,
baik dengan pewarnaan maupun tidak
2. Nutrisional
Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus
(suhu, cahaya, gas) yang diperlukan untuk
pertumbuhan mikroba
3. Kultural
Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai
macam media, baik cair maupun padat (bentuk koloni,
permukaan koloni, tepi koloni, warna dll)
Contoh 1. Karakteristik Morfologis
(Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela,
kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan
pewarnaan maupun tidak)

Aspergillus E. coli

Streptomyces Penicillium
 Contoh 1. Bentuk & Susunan Sel

Sel
Bakteri

http://content.answers.com/main/content/img/elsevier/dental/f0396-02.jpg
Contoh 3. Karakteristik Kultural
 Tampilan pertumbuhan pada media padat
(bentuk koloni, tepi koloni, permukaan koloni dll)
Kultur pada Agar Miring
4. Metabolik
Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang
dilakukan mikroba ( contoh kemampuan mikroba untuk
mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula
menjadi asam dan gas dll)
Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan
Salmonella typhi tidak dapat
5. Susunan Kimiawi
Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding
sel, nukleus, membran dll)

6. Susunan Antigen (Serologi)

Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khas
* Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi
produksi antibodi saat diinjeksikan ke hewan
7. Patogenik
Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan
penyakit

8. Genetik
Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA
Probe
 PEMELIHARAAN & PENGAWETAN KULTUR MURNI
 Tujuan :
menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam
kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya perubahan
genetik & tidak terkontaminasi
 harus mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba
selama diawetkan
Cara :
1. Pemindahan Secara Periodik
- Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke
media baru/segar, contoh : media agar miring
- Komposisi media & suhu serta interval waktu
pemindahan harus tepat dan disimpan pada suhu
dingin (50C)
 murah & mudah, tapi tidak cocok untuk penyimpanan
jangka panjang
 bakteri 2-3 minggu, fungi 3-4 minggu
 2. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral

- Permukaan agar miring atau media cair dilapisi

dengan minyak mineral steril (parafin) +/- 0,5 inci
- Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba
di bawah permukaan minyak mineral dg jarum Ose,
lalu diinokulasi ke media segar dengan tetap
mempertahankan kultur awal
- Lapisan parafin menjadikan kondisi anaerob dan
mencegah pengeringan medium

mikroba dorman  pengawetan dapat beberapa

tahun
3. Liofilisasi  Pengeringan beku (freeze-drying)

- Sel mikroba dikering-bekukan & aktivitas metabolisme

stop (dorman)  efektif untuk bakteri (dapat tetap hidup &
tidak berubah selama bertahun-tahun
- Cara :
* media berisi senyawa pelindung/penstabil : susu, serum,
natrium glutamat dll
* suspensi mikroba (±0,2 ml) ditempatkan dalam ampul
(vial) kaca
* Perendalam dalam es kering + alkohol (-780C)  beku
* Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum
 kering (sublimasi)
* Ampul ditutup dengan melelehkan ampul kaca tsb dlm
keadaan vakum  penyimpanan pada suhu 40 C
- Keuntungan : Cocok untuk penyimpanan jangka panjang,
(tahunan) & kemungkinan perubahan kecil & Wadah
penyimpanan kecil
 Freeze drying Chamber

Sampel

Kondensor

Pompa vakum
Foto Alat Freeze Dryer
4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah
(Cryopreservation)

- Menggunakan nitrogen cair (sekitar -156 sampai-1960C)

- Sel dibekukan dengan diberi bahan pelindung beku
(gliserol atau dimetil sulfoksida)  mencegah
pembentukkan kristal es & meningkatkan ketahanan
hidup sel mikroba
- Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen
cair
- Cocok untuk kapang
- Kelebihan :
hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat
diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini
5. Penyimpanan pada Tanah Steril

- Diterapkan untuk penyimpanan spora bakteri,

actinomycetes dan kapang

- Suspensi 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi

yang berisi 5 g bubuk tanah steril (campuran pasir halus
dan tanah liat 1:1)

- Dibiarkan pada suhu kamar selama 10 hari sampai

kering  disimpan pada lemari es
PEMANTAUAN VIABILITAS DAN KESTABILAN MIKROBA

• Sebelum dan sesudah penyimpanan, sebaiknya viabilitas

mikroba diperiksa, sehingga mikroba yang mati selama
penyimpanan dapat diketahui

•Sebaiknya diperiksa pula morfologi dan karakteristik

biokimianya,

 Bandingkan dengan referensi

QUIZ

Optimasi media kultivasi merupakan tahap penting

dalam pengembangan proses produksi yang ekonomis.
Di samping kultivasi memiliki kelebihan-kelebihan
yang dimiliki kultivasi, harga juga harus dapat
berkompetisi dengan sintesis secara kimia. Usaha-
usaha apa yang dapat dilakukan untuk menekan biaya
media kultivasi ?

Menurut sdr hasil samping atau limbah agroindustri

apa di daerah sdr yang berpotensi untuk digunakan
sebagai bahan baku pembuatan bioproduk ? Produk
apa yang prospektif dihasilkan dari hasil samping/
limbah tsb ?