Characterization of Cellulolytic and

Xylanolytic Enzymes of
Bacillus licheniformis JK7 Isolated from the
Rumen of a Native Korean Goat

Desta Ria Erika

05022681822003
Teknologi Industri Pertanian
Pendahuluan
 Isolasi dan penyaringan bakteri pendegradasi
selulosa

Cairan Rumen(diencekan 1% CMC dikultur scr

dengan Medium Anaerob semalam an pd
Dehority) suhu 37C

Untuk menyaring Cairan disebar ke 1%AzoCMC dibiakkan

bakteri dgn aktv piring agar MD scr Anaerob
endoglukanase semalaman pd suhu
39C
Koloni zona bening
Untuk memeriksa dimabil dan digoreskan
aktivitas enzim ke Azo CMC
dan mengisolasi
galur tunggal
dipindahkan ke kondisi
semalam pada
aerob dan dikultur pada
suhu 37oC
medium Luria-Bertani

bakteri selulolitik
anaerob fakultatif Pembentukan spora diperiksa
dipilih. menggunakan mikroskop
fase kontras
 Sequencing 16s rDNA untuk
identifikasi regangan
Sebanyak 1,5 ml kultur
LB disentrifugasi
(10.000 g 1 mnt)
untuk mendapatkan pelet sel
Amplifikasi PCR dari fragmen untuk ekstraksi DNA, yang
dilakukan dengan menggunakan
gen 16-rDNA dilakukan
DNeasy Blood & Tissue Kit
dengan menggunakan primer
universal

Produk PCR yang diperkuat divisualisasikan dengan

elektroforesis gel. Band rDNA 16-an dipotong dan
dimurnikan menggunakan kit ekstraksi DNA Gel

menggunakan pGEM-T
Produk PCR Easy Vector dan berubah
kemudian dikloning menjadi sel kompeten E.
coli top10
menggunakan kit Plasmid diisolasi
ekstraksi plasmid
Pencarian menggunakan BLAST dengan database
kesamaan urutan NCBI
menggunakan V-NTI
penyelarasan
 Pengujian enzim
Aktivitas selulase dan xilanase diukur
dengan penentuan spektrometri gula singkat campuran enzim dan larutan CMC
pereduksi dengan metode asam 3, 5- 1% (1: 1) dibuat dalam 50 mM dapar
dinitrosalisilat (DNS) fosfat (pH 6).

Aktivitas endoglanase dianalisa

Aktivitas -glukosidase ditentukan
menggunakan CMC sebagai
menggunakan salisin (2-hidroksimetil-
substrat
fenil- -D-glukopiranosida) sebagai
substrat

aktivitas xilanase ditentukan

dengan mengukur pelepasan
xilosa dari xylan kayu birch
 Kurva
pertumbuhan
Media
medium LB cair yang
kultur (100 ml)
mengandung 1% CMC

diinokulasi dengan 1% kultur

labu shake 500
benih menunjukkan 0,5
ml
dariOD 600 nilai

Aliquot dari kultur pada interval dua jam

bakteri diambil dari absorbansi diukur pada 600
media pertumbuhan nm
 Bacillus licheniformis JK7 dibiakkan dalam
medium basal (g / L, 2,5 KH2PO4, 2,5
K2HPO4, 0,1 NaCl, 0,2 MgSO4 7H2O, 0,01 pada suhu 37 C
FeSO4 7H2O, 0,007 MnSO4 7H2O, 0,05 selama 24 jam
CaCl2 2H2O, 0,05 Ca2 NH4) 2SO4, 2,5 ekstrak
ragi, 5.0 CMC, 5.0 birchwood xylan)

10 menit pada 4 C
Kultur disentrifugasi pada 13.000 g

supernatan digunakan untuk uji enzim

Campuran reaksi diinkubasi 37 C selama 30 menit

Setelah inkubasi, 300 rel reagen

hingga 99 C selama 5 menit dalam
DNS ditambahkan dan campuran
penangas air mendidih
dipanaskan
Pelepasan gula pereduksi
dihitung dari OD yang diukur
pada 546 nm
 PH optimum dan suhu selulase dan
xilanase optimal dan stabilitas
persiapan enzim kasar adalah diukur dalam
buffer yang berbeda (50 mM buffer asetat
untuk pH 3 sampai 5, 50 mM dapar fosfat
untuk pH 6 hingga 8) pada 37 C

stabilitas enzim pada nilai pra-inkubasi enzim kasar dalam berbagai

pH yang berbeda pH solusi buffer selama 4 jam pada 4 C

Untuk menentukan suhu optimal

enzim kasar diinkubasi pada a kisaran suhu (20 untuk selulolitik dan xilanolitik
hingga 80 C) dalam 50 mM fosfat buffer (pH 6) enzim

menginkubasi enzim kasar pada suhu yang
dipilih (20 hingga 80 C) selama satu jam
Untuk menentukan Stabilitas termal
Aktivitas relatif dihitung dalam
dibandingkan dengan aktivitas
maksimum yang diamati pada
masing-masing suhu.
 Efek ion dan deterjen pada aktivitas
enzim
Aditif yang digunakan dalam penelitian ini
adalah 5 mM (CaCl2, CoCl2, KCl, MnCl2, NiCl2,
MgCl2, FeCl2, CuCl2, ZnCl2)
deterjen 0,25% (TritonX-100, Tween20).

Campuran reaksi diinkubasi dengan aditif selama

60 menit pada suhu 37oC dan pH 6, dan aktivitas
enzim diuji seperti yang dijelaskan sebelumnya
 Kesimpulan

Berbagai suhu optimal (20 hingga 40 oC) dan stabilitas di

bawah pH asam (4 sampai 6) menunjukkan bahwa Enzim
selulolitik Bacillus licheniformis JK7 mungkin kandidat
yang baik untuk digunakan dalam industri biofuel, yang
mensyaratkan bahwa selulosa dapat dihidrolisis oleh asam
pada suhu tinggi (Gao et al., 2008)
THANKYOU