Restriction Fragment Length

Polymorphism Analysis (RFLP) of

Some Streptomyces Strains from Soil.

By :
1. Desi Trilipi (18725251012)
2. Fitra Purnama Agung (18725251013)
Pendahuluan
Sejumlah penelitian sidik jari asam nukleat telah dirancang untuk memisahkan spesies yang
terkait erat dan galur dari genus Streptomyces. Galur Streptomyces yang berbeda spesies
menjadi sasaran sasaran pembatasan endonuklease pencernaan DNA genom.

1. Untuk menentukan hubungan di antara mereka. Karena generasi sidik jari kompleks mengandung
sejumlah besar fragmen berat molekul rendah, itu tidak memberikan resolusi yang cukup untuk
menentukan hubungan taksonomi pada tingkat spesies. (Crameri et al.)

2. Menerapkan teknik analisis fragmen restriksi frekuensi rendah untuk membedakan antara strain
dari enam Streptomyces spesies. (Beyazova dan Lechevalier)

3. Menggunakan FRLP untuk mengevaluasi streptomisetes kentang scab-inducing dan

streptomisetes non-patogenik dan menyimpulkan bahwa itu ada sedikit kepentingan dalam
klasifikasi spesies streptomisetes. (Doering-Saad et al.)

4. Melaporkan bahwa data RFLP dapat membedakan antara spesies yang ditugaskan ke berbagai
Streptomyces genera. (Kim et al.)

5. Menyatakan bahwa daerah yang dilestarikan dalam gen 16S dan 23S rRNA yang mengapit daerah
spacer 16S-23S rDNA adalah segmen yang andal untuk membedakan antara strain. (Gürtler dan
Stanisich)
Lanjutan

6. Mengamati variasi besar dalam pola RFLP dari variasi spesies streptomyses yang
presentatif meskipun beberapa fragmen umum, meskipun beberapa fragmen umum juga
diperiksa dan itu disimpulkan bahwa analisis RFLP dari gen ribosom RNA tampaknya
menjadi sebuah alat identifikasi galur-galur yang akurat dan cepat untuk membangun
hubungan antar spesies streptomyces yang berkerabat dekat. (Clarke et al.)

7. Menggunakan PCR sidik jari untuk membedakan antara galur streptomyces tanaman
patogenik yang berkerabat dekat dan menunjukkan bahwa metode ini dapat memberikan
sebuah cara penentuan identitas organisme yang bermanfaat dan cepat. (Sadowsky et
al.)

8. Menguji wilayah spacer intergenik 16S-23S dari galur Streptomyces albidoflavus yang
teridentifikasi. Elektroforesis dan analisis ukuran fragmen dari produk-produk ini
mengungkapkan variabilitas yang luas dalam jumlah dan ukuran daerah spacer dan ini
menyebabkan pengakuan 19 pola pita yang berbeda. Metode ini dianggap berguna untuk
membedakan antara streptomisetes pada tingkat galur. (Hain et al.)
 Lanjutan

Untuk tujuan karakterisasi dan klasifikasi, strain

perwakilan dari berbagai kelompok Streptomyces
menjadi sasaran teknik sidik jari DNA (RFLP).
Dalam penelitian ini, galur
representatif dari kelompok warna
Teknik ini telah digunakan untuk membedakan bakteri, multimember menjadi sasaran
terutama Streptomisetes.
penelitian RFLP dan kami
melaporkan kegunaan dari analisis
Metode lain dari sidik jari DNA seperti Random specer intergenik 16-23S rDNA
Amplified Polymorphic DNA (RAPD) juga telah untuk pembedaan galur yang tidak
diterapkan untuk menghilangkan strain duplikat dari diketahui dari genus Streptomyces .
actinomycetes serta untuk mengidentifikasi daerah
yang dilestarikan dari genom actinomycete
Bahan dan Metode
Semua larutan yang digunakan dalam percobaan disiapkan dari
pengenceran larutan stok reagen utama. Biologi molekuler
menggolong-golongkan reagen-reagen dan enzim diperoleh dari
pemasok komersial (Digma dan Gibco).
Larutan stok disiapkan menurut Sambrook et al.
DNA genom dari galur Streptomyces disiapkan sesuai dengan
metode ekstraksi guanidine tiosianat.
Penanaman dan ekstraksi DNA dan pemurnian
galur: Empat belas galur representatif diisolasi oleh
Seimbung diperoleh dari Departemen Pertanian
Lingkungan dan Ilmu Biologi di Universitas
Newcastle dan dikembang biakkan dalam agar non-
sporolasi selama 3 hari pada 25oC.

Amplifikasi PCR dan analisis RFLP: galur yang dipelajari oleh

RFLP dari daerah antar gen gen rDNA dan dengan membangun
matriks kesamaan dan dendrogram untuk menunjukkan hubungan
antara sampel. Amplifikasi PCR daerah interspacer 16S-23S rDNA
dilakukan dalam sebuah Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480,
menggunakan tabung microfuge PCR 0,5 ml. Taq DNA polimerase,
larutan MgCl2 dan buffer Taq berasal dari BiotaqTM DNA
Polymerase Bioline. Deoksiribonukleotida (dNTP) diperoleh dari
Boehringer Mannheim GmbH, Jerman, pada konsentrasi 100 mM.

Tabel 1. Streptomycetes Straits used in the RFLP in this study

 Lanjutan..
Larutan stok kerja dari dNTP2 dibuat dengan
pencampuran sebuah stok master dalam perbandingan
equimolar untuk menghasilkan konsentrasi akhir dNTP
tunggal pada 25 mM. GP1 utama depan (5'-
GCGATTGGGACGAAGTCG3'-) dan GP2 utama
terbalik ( TATCGTGGC CTCCCACGTCC3'-)
5'- yang
digunakan untuk amplifikasi PCR. Reagen yang
dicampur dengan vortexing dan dikumpulkan pada dasar
tabung oleh sebuah sentrifugasi dorongan kecil (5 detik).
tabung-tabung disimpan di es hingga mereka akan
ditempatkan di thermocycler. Setelah penambahan DNA
sampel, reaksi pencampuran diletakkan dalam blok
thermocycler dan dihangatkan pada 96oC untuk 5 menit
dalam denatursi awal, dan kemudian Taq polimerase
(0,5 ml) ditambahkan. Amplifikasi PCR dilakukan
sesuai dengan profil suhu berikut: denaturasi awal pada
95oC selama 5 menit, 35 siklus denaturasi (1 menit pada
95oC); annealing (1 menit pada 55oC); ekstensi (1 menit
pada 72oC) dan ekstensi akhir pada 72oC selama 10
menit.
Lanjutan..
Produk-produk PCR disimpan pada 4oC dan kemudian diperiksa dengan elektroforesis
agarosa (1%, b / v dalam 0,5XTBE) pada buffer berjalan 0,5XTBE, yang mengandung
etidium bromida 0,5 μg / ml. Sekitar 5 μl dari reaksi PCR dicampur dengan 1 μl buffer
pemuatan gel (jus biru) dan dimasukkan ke dalam sumur dalam slab gel agarosa.
Elektroforesis dijalankan pada 100V selama 1 jam, dan ukuran fragmen yang
diamplifikasi (daerah interspacer 16S dan 23S rDNA) diidentifikasi dengan perbandingan
dengan penanda ukuran molekul (Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus, MBI
Fermentas) pada posisi 500- bp. PCR 16S rDNA yang diamplifikasi dipisahkan oleh
elektroforesis agarosa preparatif (14). Setelah pemisahan, dielusi dan dimurnikan dari gel
agarosa oleh kit (Ekstrak Nukleospin, Biogene Limited, Macherey-Nagel GmbH & Co.
KG).
Lanjutan..
Pencernaan dengan enzim restriksi: Produk PCR (8,5 ml) dicerna dengan tiga endonuklease
restriksi, Bsp143I, HaeIII dan MnlI pada suhu 37oC selama 3 jam. DNA yang dicerna
dianalisis dengan elektroforesis horizontal dalam gel agarosa 4% NuSieve 3: 1. Elektroforesis
dilakukan pada 100V selama 220 menit dengan alat elektroforesis gel dalam buffer TBE.
Tangga 20-bp superladder-rendah digunakan sebagai penanda DNA. Setelah elektroforesis,
pemindaian analisis gambar gel dan estimasi ukuran fragmen dilakukan di bawah sinar UV dan
didokumentasikan pada iluminator BioRad yang terhubung ke program komputer yang disebut
Program Bandingkan Gel. Fragmen restriksi yang lebih pendek dari 99bp tidak
dipertimbangkan dalam analisis. Pola pembatasan masing-masing enzim untuk seluruh strain
uji ditransfer sebagai file TIF untuk dianalisis dalam Program Analis Molekuler. Pita-pita
informatif yang berasal dari pencernaan enzim restriksi diberi skor dengan ada atau tidaknya
mereka, dan kesamaan serta perbedaan dihitung. Matriks jarak persentase kesamaan dan
dendrogram dibangun. Metode unweighed pair group menggunakan rata-rata aritmatika
(UPGMA; 16) digunakan untuk membuat dendrogram.
Hasil dan Pembahasan
DNA dari semua 14 strain yang diuji diamplifikasi dengan primer ribosom yang digunakan dalam penelitian ini. Semua strain menghasilkan satu
pita tunggal sekitar 300-400 bp. Ukuran ini sesuai dengan ukuran prediksi wilayah interspace gen 16S-23S rRNA dari pasangan primer yang
digunakan di sini. Tiga endonuklease (MnlI, HaeIII dan Bsp143I) yang diuji dalam penelitian ini menghasilkan pola fragmen yang identik
(Gambar 1). Elektroforesis produk-produk ini mengungkapkan variabilitas yang luas dalam jumlah daerah spacer. Dalam pola restriksi ketiga
enzim ini, pita-pita bening diamati dari seluruh strain uji berikut: A1P1, A5P2, A1P3, B1P2, B4P3, B1P1, C7P1, C3P1, C1P3, D2P1, D5R1, E2P1,
E3P1, E1P1; dan mereka menghasilkan band-band yang identik. Pola restriksi Bsp143I diperlihatkan dalam Gambar 1.

Restriction patterns of 16s-23s

spacer region rDNA genes
digested with Bsp 1431
endonuclease enzym.
Untuk memperkirakan hubungan genetik, penilaian dengan ada atau tidak adanya fragmen dilakukan. Sebuah
dendrogram jarak genetik yang dibangun dari data RFLP menggunakan algoritma UPGMA dan komposisi
kelompok masing-masing kelompok ditunjukkan pada Gambar 2. Tingkat kesamaan 16S-23S wilayah spacer gen
rDNA yang dicerna dengan Bsp143I, HaeIII dan MnlI endonuklease enzim terlihat pada Tabel 2.

Dendogram obtained by
unweighed pair group method
using aritmatic averages based
o n R F L P d a t a .
 Kelompok I (<72% kesamaan) termasuk 2 dari 14 strain yang diteliti. Mereka ditugaskan ke kelompok warna 1 (A1P1, A5P1).
Kelompok II (<78% kesamaan) termasuk 4 jenis uji; ini milik kelompok warna 3 (C1P3, C7P1, C3P1) dan kelompok warna 2
(B4P3). Profil RFLP dari grup ini menunjukkan bahwa noda pada kelompok warna 3 saling terkait erat. Namun, kelompok II
terdiri dari strain yang diisolasi dari rhizoplane, non-rhizosphere dan ectorhizosphere. Kelompok III (<74% kesamaan) termasuk 2
galur uji yang merupakan galur warna kelompok 4 (D2P1 dan D5R1). Kelompok IV (<74% kesamaan) melibatkan 2 galur uji
(B1P2, B1P1) yang termasuk dalam kelompok warna 2.
 Strain yang termasuk dalam kelompok warna 5 ditugaskan ke kelompok V (E2P1, E1P1, E3P1). Galur kelompok V (<74%
kesamaan) termasuk kelompok warna 5 dan diisolasi dari tanah ectorhizosphere. Satu jenis uji (A1P3) yang termasuk dalam
kelompok warna I berada dalam satu kelompok anggota tunggal. Namun, strain ini dikelompokkan dengan strain grup I aslinya
pada kemiripan 55%. Penting untuk menentukan jumlah minimum enzim restriksi untuk memeriksa afiliasi filogenetik dari banyak
isolat dari lingkungan menggunakan analisis RFLP dari rDNA interspacer yang diamplifikasi PCR.
 Dalam penelitian ini, analisis PCR-RFLP menggunakan tiga enzim restriksi ditunjukkan untuk memperkirakan hubungan
filogenetik antara isolattidak diketahui Streptomyces yang dari sampel tanah. Dengan demikian, metode PCR-RFLP ini dapat
berfungsi sebagai alat cepat untuk memperkirakan perkiraan hubungan filogenetik isolat, tanpa perlu interspecer rDNA atau untai
16S rDNA. Telah dilaporkan bahwa analisis PCR-RFLP berdasarkan wilayah spacer 16S-23S telah semakin banyak digunakan
untuk menyelesaikan isolat terkait erat dalam beberapa tahun terakhir, karena wilayah spacer lebih bervariasi daripada gen 16S
rDNA.
Hal tersebut menghabiskan waktu dan sulit untuk mengidentifikasi galur Streptomyces yang tidak diketahui oleh
karakter fenotipik. Analisis PCR-RFLP dari daerah spacer intergenik dari 14 galur menunjukkan harapan sebagai
alat cepat untuk membedakan galur Streptomyces. Dalam penelitian ini, banyak galur tidak termasuk spesies yang
telah dijelaskan sebelumnya.

Levels of similaritas of 16s-23s

spacer region rDNAs genes
digested with Bsp 1431, HaeIII
and MnII endonuclease enzym.
Kesimpulan
Metode ini dapat digunakan untuk membedakan antara streptomisetes pada
tingkat regangan karena daerah spacer memiliki variabilitas yang luas dalam
jumlah dan ukuran. Metode ini sangat sederhana dan tidak memerlukan prosedur
pendukung lainnya. Analisis RFLP terkait dengan database DNA harus sangat
membantu dalam studi yang membutuhkan pemeriksaan cepat Streptomyces
isolatdari lingkungan yang berbeda. Ini akan menjadi alat cepat untuk
membedakan galur genus yang tidak diketahui Streptomyces dan harus berguna
dalam sistem identifikasi rutin.

Desi Trilipi dan Fitra Purnama Agung

Thank You