Mengapa Perlu Dilakukan Pewarnaan

Bakteri ?
 Mikroorganisme seperti bakteri umumnya sulit dilihat
dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi
atupun membiaskan cahaya.
 Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna
mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.
 Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme

1. Mempermudah melihat bentuk mikroorganisme, baik bakteri,

ragi, maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroorganisme
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam
jasad.
4. Melihat reaksi mikroorganisme terhadap pewarna yang
diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan

1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh

terlalu tebal atau tipis

2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan

aplikasi bahan kimia seperti metanol, fenol.

3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

 FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI PEWARNAAN

1. Fiksasi
Cara fisik (pemanasan atau dengan freeze driying)
Cara kimia seperti; metanol, fenol dan formalin.

Fungsi fiksasi sebelum pewarnaan yaitu:

a. Merekatkan sel mikroba pada gelas objek
b. Membunuh mikroorganisme secara cepat dengan tidak menyebabkan
perbahan-perubahan bentuk dan strukturnya.
c. Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna
d. Membuat sel-sel mikroba lebih kuat (keras)
e. Mencegah terjadinya otolisis sel, yaitu pecahnya sel yang disebabkan
oleh enzim-enzim yang dikandungnya sendiri
2. Pelunturan zat warna
adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel yang telah
diwarnai.
Fungsi : untuk menghasilkan kontras yang baik pada bayangan
mikroskop.
Ditinjau dari kekuatan ikatan antara sel dengan zat warna, maka dikenal
beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan alKohol, tahan air dan lain-
lain.
Ada beberapa macam peluntur zat warna, antara lain:
a. Peluntur warna bersifat asam yakni HNO3, HCl, H2SO4 dan campuran
asam-asam tersebut dengan alcohol.
b. Peluntur zat warna bersifat basa yakni KOH, NaOH, sabun dan
garam-garam basa.
c. Peluntur zat warna lemah, yaitu alcohol, air, minyak cengkeh,
aseton dan gliserin
d. Garam-garam logam berat AgNO3, CuSO4 dan lain-lain.
e. Garam-garam logam ringan Na2SO4, MgSO4 dan lain-lain
3. Identifikasi pewarnaan
Zat warna dapat diidentifikasikan dengan beberapa cara misalnya
dengan mempertinggi kadar zat warna, mempertinggi temperature
pewarnaan 60-90oC dan menambahkan suatu mordan.
Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan zat warna
terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan dengan cara
pewarnaan tanpa diberi mordan. Ada beberapa mordan, yaitu:
a. Mordan basa (klorida)
b. Mordan asam (natrium)

4. Substrat
Atas dasar macam zat warna yang diserap oleh sel dapat dibedakan:
a. Sel-sel basofil
b. Sel-sel asidofil/ oksifil
c. Sel-sel yang sudanofil
5. Zat warna penutup atau zat warna lawan
 adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna
mula-mula yang digunakan.
 Fungsi dari zat warna punutup adalah memberikan warna pada sel yang
berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula.
 Zat warna punutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan
memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna
utama.
 MACAM-MACAM ZAT WARNA BAKTERI

No Nama Zat Pewarnaan Warna Bakteri

1 Sapranin Merah
2 Gentian violet Ungu
3 Methylen blue Biru
4 Malachit green Hijau
5 Karbol fuchsin Merah

9
 PEMBUATAN PREPARAT
 Sebelum dilakukan pewarnaan pada sel mikroba, harus dilakukan praparat
oles. Preparat oles yang baik merupakan prasyarat berhasilnya pewarnaan.
 Adapun teknik pewarnaan yang tepat yaitu:
1. Olesan tidak terlalu tebal, pada olesan yang tebal sel-sel bakteri akan
bertumpuk-tumpuk sehingga sulit untuk menentukan bentuk sel
individu.
2. Olesan tidak terlalu tipis karena dapat menyulitkan pengamatan secara
mikroskopis.
3. Kaca objek yang dipakai tidak boleh tergores dan harus bersih betul. Hal
ini disebabkan ukuran sel bakteri amat kecil, maka goresan atau partikel
debu pada kaca objek dapat dikelirukan sebagai mikroba.
4. Preparat bakteri harus benar-benar kering udara sebelum difiksasi
dengan panas.
5. Penggunakan teknik aseptic, untuk menghindakan kontaminasi preparat
yang dibuat dan melindungi diri sendiri
Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan Negatif

Pewarnaan Differensial

Pewarnaan Struktural

MACAM-MACAM PEWARNAAN
11
 PEWARNAAN SEDERHANA

adalah salah satu cara pewarnaan yang hanya menggunakan

satu macam zat warna.
Tujuan : Untuk melihat bentuk dan ukuran sel.
Zat warna yang digunakan adalah metilen blue, gentian violet
(Kristal violet), karbol fuksin, safranin, hijau malakhit dan lain-
lain.
Keunggulan :
1. Mudah dan cepat
2. Dapat memperlihatkan penataan bakteri, misalnya seperti
rantai (stretokokus) seperti buah anggur (stafilokokus),
berbentuk kubus (sarcina).
3. Dapat mengamati struktur tertentu misalnya endospora
 PEWARNAAN NEGATIF
Bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya
menjadi hitam gelap.
Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai (spirochaeta)
Caranya secara umum dengan mencampur mikroba dalam setetes
tinta cina/ tinta india (negrosin) lalu meyebarkan diatas kaca objek
yang bersih.
Mikroba kelihatan transparan (tembus pandang) dan tampak jelas
pisah diatara medan yang gelap
Pewarnaan ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Pewarnaan negatif tidak mengalami pemanasan atau perlakuan lain
dengan dengan bahan kimia
Berhasil tidaknya metode ini tergantung pada kaca objek harus betul-
betul bersih, jumlah negrosin yang digunakan menentukan
keberhasilan pewarnaan dan campuran mikoorganisme harus
digesekkan diatas kaca objek bukan sekedar didorong
 PEWARNAAN DIFFERENSIAL

 Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat

warna

 Tujuan untuk membedakan antar bakteri

 Pewarnaan gram dan pewarnaan bakteri tahan asam (BTA)

14
1. PEWARNAAN GRAM

Sejarah

 Metode ini diberi nama berdasarkan

penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (1853–1938)
yang mengembangkan teknik ini
pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
 Dimodifikasi oleh Hucker pada
tahun 1921
PENGERTIAN PEWARNAAN GRAM

adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies

bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan
gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka.

Perbedaan utama di antara keduanya adalah

struktur dan komposisi dinding selnya.
TUJUAN PEWARNAAN GRAM
1. Untuk memahami cara identifikasi bakteri secara Gram.
2. Membagi Bakteri menjadi bakteri Gram Negatif (-) dan Bakteri
Gram Positif (+)
 Bakteri Gram Positif

Bakteri Gram Positif mampu mempertahankan zat warna utama dalam

pewarnaan Gram, yaitu Gentian Violet, sehingga nampak berwarna
ungu saat pengamatan dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini
tersusun oleh sebagian besar Peptidoglikan, yang mampu mengikat zat
warna dan tidak rusak saat dicuci dengan alcohol.

Contoh : Lactobacillus, Actinomyces, Arachnia, Bifidobacterium,

Staphylococcus, Propionibacterium dan Eubacterium
 Bakteri Gram Negatif

Bakteri Gram negatif memiliki komposisi dinding sel yang sebagian

besar tersusun dari lapisan lipid (lipopolisakarida), sehingga pada saat
pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat warna utama terutama
saat dicuci dengan alcohol (lipid rusak saat dicuci dengan alcohol),
akibatnya kelompok bakteri ini memberikan kenampakan warna merah
(warna dari zat warna ke dua : safranin atau air fuchsin) di akhir
kegiatan pewarnaan Gram.

Contoh : Salmonella Typhi,

Rhizobium Leguminosarum,
azotobacter,
Neisseria gororrhoeae,
Pseudomonas aeruginosa,
Helicobacter pylori dan
Haemophilus influenza.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1. Larutan violet kristal (1 tetes) sebagai cat warna utama yang akan diikat
oleh peptidoglikan bakteri
2. Larutan Iodin ( 1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan warna
utama.
3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton/etanol) yaitu solven
organic yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama
(secukupnya sampai cat warna utama luntur).
4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) (1 tetes) digunakan untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan warna cat utama
setelah perlakuan dengan alkohol.
TAHAP PEWARNAAN GRAM
Warna Bakteri
Perlakuan Waktu
Gram + Gram -
Pembuatan preparat
Fiksasi
Gentian violet 30 detik ungu ungu
Cuci dengan air
Larutan iodium 30 detik - -

Cuci dengan air dan keringkan

Dekolorisasi dengan alkohol 20 detik
Cuci dengan air dan keringkan
Sapranin 30 detik ungu merah
24
 Hal-hal yang perlu diperhatikan
dalam pewarnaan gram

Tahap dekolorisasi yang mengakibatkan iodine lepas dari sel.

 Pemberian ethanol berlebih (over decolorization), sehingga sel gram
positif tampak seperti gram negatif.
 Pemberian etanol terlalu sedikit dalam (underdecolorization), yang
tidak akan melarutkan iodine secara sempurna sehingga sel gram
negatif seperti gram positif.

 Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda

yang tidak lebih lama dari 24 jam.
 Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap
warna utama, khususnya pada gram positif.
 Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel,
sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel
seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
gram variabel
 2. PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM (BTA)
 Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak
dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun
jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui
proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan
diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun
seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan
asam (BTA).
 Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa
keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium
tuberculosis .
 Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling
banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.
 Prinsip Pewarnaan
Bakteri tahan asam (BTA) akan memberikan warna merah,
sedangkan yang tidak tahan asam akan berwarna biru.
 TAHAP PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM
(ZIEHL NELSON)

Pengintesifan cat utama

Pemberian cat utama # Panaskan pada
# Fuchin (merah) penangas air, suhu
90oC, 4 menit

Pencucian (dekolorisasi) Pemberian cat penutup

# Larutan asam alkohol (cat lawan)
(alkohol 95% + HCl 5 – # Metilen blue / berlian
10%) hijau
 PEWARNAAN STRUKTURAL / KHUSUS

Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan

pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus.
Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan
supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti
halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana
cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa
menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium.
PENGERTIAN
 Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang
dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh
buruk dari luar. Patogen yang digunakan untuk
mengendalikan serangga adalah bakteri pembentuk
spora.
PROSES PEMBENTUKAN SPORA

1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk

spora
2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar
membran kini menjadi lapisan dalam membran (calon) spora.
3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks)
4. Pembentukan korteks
5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5
ini,jika spora mendapatkan lingkungan yang kondusif, maka ia
bisa tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru.
Dalam spora, sifat-sifat bakteri tetap.
Spora dibentuk, jika keadaan lingkungan tidak menguntungkan
baginya misalnya, untuk pertahanan diri.
Spora sangat tahan terhadap suhu tinggi dan desinfektan. Hal ini
disebabkan karena dinding spora sangat kuat dan tersusun atas
3 lapisan, antara lain: intin (lapisan dalam), ektin (lapisan luar),
dan lapisan lendir yang terlihatdiantara intin dan ektin.
Di dalam bentuk spora bakteri akan tahan lama tanpa makanan
dan tidak melakukan pembiakan, jika lingkungan di luar telah
membaik, maka dinding spora akan pecah dan bentuk vegetatif
akan keluar dan bakteri akan aktif kembali.
Faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan Spora
 Fiksasi
 Waktu pengecatan tidak tepat
 Konsentrasi reagent
 Umur bakteri
 Nutrisi
Pada prinsipnya, pemanasan akan mengembangkan lapisan luar
spora sehingga zat warna utama dapat masuk masuk ke dalam
spora sehingga berwarna hijau. melalui pendinginan warna
utama akan terperangkap di dalam spora, dengan pencucian zat
warna utama yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga
pada saat pewarnaan kedua (safranin), sel vegetatif akan
berwarna merah.
Metode pewarnaan Klein. Pada prinsipnya, spora bakteri
berwarna merah dan badan bakteri berwarna biru. Dinding spora
yang tebal memerlukan pemanasan agar pori-pori membesar dan
zat warna dapat masuk.
Metode Schaefier-Fulton. Pada prinsipnya, spora akan mengikat
larutan pewarna malakit hijau dengan proses pemanasan,
sedangkan dinding sel akan mengikat warna safranin yang
berwarna merah setelah kelebihan pewarna malakit hijau dicuci
dengan menggunakan air
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan
tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada
kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul.
Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana
biru gelap.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam
asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat
tebal pada dinding sel dan flagel.

Prinsip: Flagel mampu mengikat zat warna karena penggunaan

mordant, dan berwarna merah ungu lebih muda dan sel
vegetative akan berwarna merah ungu apabila dilakukan
pengecetan flagel metode gray.
Cara kerja :

Lakukan uji motil terlebih dahulu

 Siapkan media SIM, lakukan inokulasi 1ohse biakan bakteri secara tusukan
pada media SIM secara aseptis
 Inkubasi 37C selama 24 jam

Interprestasi hasil
(+) terjadi pertumbuhan menyebar pada sekitar tusukan
(-) tidak terjadi pertumbuhan menyebar pada sekitar tusukan

Pembuatan preparat
 Siapkan objeckglass yang bersih, kering dan bebas lemak
 Labelisasi
 Teteskan 1 tetes sampel bakteri ditepi objeckglass menggunakan pipet tetes
steril secara aseptis
 Objeck glass dimiringkan sehingga tetesan mengalir keujung yang lain
 Keringkan dalam incubator suhu 37C selama 10 menit
Pengecetan

Siapkan preparat yang sudah jadi dan taruh di jembatan

pengecetan
Genangi preparat dengan larutan mordant selama 10 menit
Buang sisa cat, cuci dengan air mengalir
Genangi dengan ZN A selama 5 menit
Buang sisa cat, cuci dengan air mengalir, kering anginkan
Periksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dengan
penambahan emersi oil