LANNY KARTIKASARI

1516201007
REKAYASA GENETIKA BIDANG
HEWAN: KONSEP CRISPR-Cas9
SYSTEM
sgRNA: Single guide RNA
crRNA: CRISPR RNA
tracrRNA: trans activating crRNA
• Sistem ini berkaitan dengan sistem imun
• Berperan dalam pembelahan DNA
• Invasi DNA bakteriofag/DNA plasmid
 CRISPR (Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats
Komponen meliputi:
• Small RNA dan RNA guide
• DNA endonuclease
• Epigenom: Epigenome terdiri dari senyawa kimia
yang memodifikasi genom dengan cara yang
memberitahu apa yang harus dilakukan oleh RNA
• Cas9 (Crispr yang berasosiasi dengan protein 9)
berupa enzim retriksi
• Biasanya ditemukan di eukariot (Streptococcus
pyogenes)
 Clustered regularly interspaced short
palindromic repeats (CRISPR)
• CRISPR merupakan salah satu metode genetic
editing, yaitu mengubah atau menonaktifkan gen
tertentu.
• segmen DNA prokariotik maupun eukariot
(misalnya Streptococcus pyogenes) yang
mengandung urutan basa berulang.
• Pengulangan basa disebut palindrome, berarti
urutan mundur sama dengan maju (ex
GGCTTTTCGG). Sebagaian besar gen organisme
memiliki urutan gen palindromik.
• metode CRISPR ini hanya dapat dilakukan jika gen
target memiliki urutan palindromik.
• Genetic editing atau pengubahan gen dilakukan
oleh suatu enzim nuclease, yang dalam konteks
ini dihasilkan oleh virus maupun bakteri.
• Enzim nuclease merupakan enzim yang dapat
memotong ikatan fosfodiester pada urutan basa
nukleotida.
• Salah satu enzim yang umum digunakan dalam
CRISPR ini adalah Cas9.
Genetic editing CRISPR
• Genomik lokus : Lokus dimana letak gen target
• DNA target : DNA yang akan diubah dan
memiliki urutan basa nukleotida palindromik
• PAM : Protospacer adjacent motif,
promoter yang menandai gen target
• sgRNA : Single-guide RNA, urutan DNA
yang mengikatkan antara DNA target
• dengan enzim nuclease
• Cas9 : Enzim nuclease yang memotong
DNA target
 Konsep dasar genetic editing menggunakan
Cas9 dilakukan dengan beberapa tahap
• 1. PERSIAPAN dan INSERSI
• Dalam tahap ini, dilakukan pembentukan plasmid
yang mengandung PAM, sgRNA (guide RNA), dan
gen Cas9.
• Gen target dari kelompok EMX yang meregulasi
perkembangan sel pada manusia, umunya
ditargetkan oleh Cas9.
• Hal ini dikarenakan EMX1 memiliki urutan
palindromik, yang identik dengan sgRNA Cas9.
• Kemudian plasmid dimasukkan dalam sel baik
melalui metode fisik maupun kimia.
• 2. PENGIKATAN DNA TARGET
• Setelah plasmid masuk, maka PAM (promoter) akan
mencari gen target dan mengawali pengikatan sgRNA.
• PAM pada Cas9 memiliki urutan basa nukleotida yang
khas dan identik dengan gen target.
• PAM Cas9 urutan 5'-NGG-3'di mana "N" adalah setiap
basa nukleotida diikuti oleh dua guanin ("G").
• Setiap pengikatan DNA terdapat dua urutan, yaitu
template strand targeting dan nontemplate strand
targeting.
• Masing-masing urutan berfungsi untuk melekatkan
nuclease dengan DNA double helix.
• 3. Aktivitas nuclease
• Setelah pengikatan DNA target berhasil, maka
enzim nuclease akan memotong DNA target.
• DNA target terpotong karena enzim ini
memiliki mampu memotong ikatan
phospodiester antar nukleotida.
• DNA target yang terpotong menghasilkan DNA
double stranded breaks (DSBs), yang
merupakan DNA yang tidak stabil (rusak)
• 4. Repairing DNA target
• Repairang DNA atau menyambung DNA dilakukan
setelah terjadi DSBs. Jika DNA tidak disambung maka
dapat menyebabkan mutasi atau kematian dari
organisme target.
• Ada dua jalur yang digunakan untuk menyambung
kembali (reparing) DNA, yaitu non-homologous end-
joining (NHEJ) dan Homology directed repair (HDR).
• Jalur NHEJ adalah jalur dimana tidak ada pasangan
homolog dari gen target, sehingga repairing dilakukan
dengan gen yang tidak homolog.
• Sebaliknya jalur HDR adalah jalur dimana ada
pasangan homolog gen target, sehingga
repairing dilakukan dengan gen homolog. Jalur
HDR umumnya dapat terjadi ketika fase G2
dan S pada pembelahan sel.
• Jalur HDR membentuk gen editing yang
sesuai, sedangkan NHEJ membentuk gene
editing mutasi.
• Fase G2 dan S mitosis
berhubungan dengan
siklus sel
• Diferensiasi sel terjadi
selama perkembangan
organisme
multiseluler, saat
organisme pada tahap
zigot hingga
membentuk jaringan
dan sistem organ
• Siklus sel pada eukariot melibatkan inti sel dan
siklus sel
• Tahap siklus sel ada 2 yaitu fase fungsional (fase S
dan fase M) dan fase persiapan (fase G1 dan G2)
• Fase S ditandai dengan adanya replikasi DNA,
replikasi kromosom, dan pemilahan oleh nukleus
• Fase G2 pada mamalia berlangsung selama 2 jam
• Cara terbaik untuk mengendalikan aktivitas gen adalah
dengan penyesuaian epigenome dengan genom itu sendiri.
• Epigenome adalah sekelompok senyawa kimia yang
terdapat pada histon. Senyawa kimia ini dapat mengatur
akses ke DNA dengan membuka atau menutup untuk
protein yang selanjutnya akan menyebabkan ekspresi gen.
• Enzim Cas9 memotong melalui DNA seperti sepasang
gunting molekuler dan molekul RNA menargetkan posisi
spesifik DNA untuk membuat potongan.
• Sebuah enzim retriksi Cas9 dapat digabungkan ke
pengubah epigenetik dengan menambahkan gugus metil
(Me) pada DNA atau asetil (Ac) pada protein histon.
• Epigenetik ditandai dengan tidak adanya
perubahan pada sekuen DNA, melainkan
faktor non genetika yang menyebabkan
ekspresi gen suatu organisme menjadi
berubah
• Contoh perubahan epigenetik pada eukariot
adalah proses diferensiasi sel
• Hal ini akan memungkinkan para peneliti untuk
mempelajari bagaimana modifikasi mempengaruhi
ekspresi gen dan dinamika DNA.
• Penambahan gugus asetil pada protein yang
menghubungkan DNA untuk mengirim ekspresi gen
target yang berlebih,
• sehingga dapat mengkonfirmasikan bahwa sistem
bekerja dan memiliki efek pada penanda epigenetik.
• Puluhan enzim dapat membuat atau menghapus tanda
epigenetik pada DNA, dan tidak semua dari enzim
tersebut dapat diterima.
JOURNAL LAIN
DSB REPAIR PROMOTES GENE EDITING
• DSB: DNA double stranded breaks.
• DSBs disebabkan oleh enzim Cas9 (kuning) dapat
diperbaiki di salah satu dari dua cara.
• Kesalahan jalur NHEJ, ujung dari DSB diproses
oleh mesin perbaikan DNA endogen dan
bergabung kembali, yang dapat mengakibatkan
mutasi INDEL secara acak.
• Mutasi Indel terjadi di dalam daerah pengkode
gen dapat mengakibatkan frameshifts dan
penciptaan kodon stop, mengakibatkan kegagalan
pada sistem gen.
• Atau, perbaikan template dalam bentuk
plasmid atau ssODN dapat diberikan untuk
memanfaatkan jalur HDR, yang
memungkinkan untuk mengedit secara tepat.
• untai tunggal DNA juga dapat menginduksi
HDR.
• ssODN repair template terbentuk setelah
amplifikasi oleh PCR
PRIMER SEQUENCES FOR sgRNA
cloning and validation
 PROSEDUR CRISPR-CAS9
• Design of targeting components and the use
of the CRISPR Design Tool ● TIMING 1 d
• Design of the ssODN template (optional) ●
TIMING 1 h
• Preparation of sgRNA expression construct
• (A) Generation of the sgRNA expression
construct by PCR amplification ● TIMING 2 h
• (B) Cloning sgRNA into the pSpCas9(BB)
vector for co-expression with Cas9 ● TIMING
3d
• Functional validation of sgRNAs: HEK 293FT
cell culture and transfections ● TIMING 3–4 d
• Co-transfection of CRISPR plasmids and HDR
templates into HEK 293FT cells (optional) ●
TIMING 3–4 d
• hESC(HUES9) culture and transfection ● TIMING
3–4 d
• Isolation of clonal cell lines by FACS● TIMING 2–
3 h hands-on; 2–3 weeks expansion
• Isolation of clonal cell lines by dilution ● TIMING
2–3 h hands-on; 2–3 weeks expansion
• Functional testing: detection of indel mutations
by the SURVEYORnuclease assay ● TIMING 5–6 h
• Assessment of Cas9 cleavage or HDR-
mediated target modification efficiency by
Sanger sequencing ● TIMING 3 d
• Deep sequencing and off-target analysis ●
TIMING 2–3 d
Contoh lain sistem CISPR-CAS9
• protospacer adjacent motif (PAM) at the end
of target DNA sequence.
• Ketika ada donor DNA maka terjadi perbaikan
sekuen.
• Selanjutnya terjadi gene editing di DNA target
(misalnya sel manusia, gen zebra fish, dan sel
bakteri).
• Nowadays, three nucleases are widely used in
genome editing: zinc finger nuclease (ZFN),
transcription activator–like effector nuclease
(TALEN), and CRISPR [menurut Porteus M.
Genome Editing: A New Approach to Human
Therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol.
2016; 56: 163-90.]
ENGINEERED NUCLEASES IN GENOME
EDITING
THE COMPARISON OF WORKING MECHANISM
AMONG ZFN, TALEN, CRISPR-CAS9
APPLICATION OF CRISPR-CAS9 SYSTEM
IN NEW FIELD
CRISPR-CAS9 SYSTEM: aktivitas
pembelahan saat ada sgRNA
sebagai alat untuk menunjukkan
lokasi gen dan RNA.
Dengan menggabungkan Cas9
dengan protein fungsional.
Lalu aktivasi transkripsi / represi
dan modifikasi basa nitrogen
Application of Large-scale genetic
screening by CRISPR-Cas9 library.
 Typical cancer mouse models
established by CRISPR-Cas9 system.