Kelompok 1

Rania Saida Afipah 10060316133

Aisyah 10060316149
Sagita Ghaniyah C. 10060316153
Ega Utami 10060316155
Berliana Angelina 10060316159
Nurul Qalbiy 10060316166
Sulton Ramadhan 10060316167
Dian Komalasari 10060314134
Tutun
 PENDAHULUAN
PAKAN OBAT
Pakan obat adalah salah satu metode yang digunakan
untuk memberikan obat-obatan kepada hewan. Cara
tersebut efektif untuk memperlakukan hewan secara
terkendali, aman dan ramah.
Dalam studi stabilitas, salah satu kuncinya adalah
mengukur zat aktif dan mengamati semua jenis degradasi
yang dapat mengubah integritas molekul yang dipelajari
dan teknik analisis merupakan peran penting dalam jenis
studi ini.
HALQUINOL
Campuran 5,7-dichloro-8-hydroxyquinoline (57-
74%), 5-chloro-8-hydroxyquinoline (23-40%) dan 7-
chloro-8-hydroxyquinoline (kurang dari 3%).
Halquinol memiliki aktivitas antibakteri,
antijamur dan antiprotozoal. Di Asia dan Amerika
Selatan banyak digunakan untuk melawan infeksi
mikroba serta mempercepat pertumbuhan dengan
menggabungkan halquinol dan pakan obat pada
konsentrasi yang berbeda.
 PENDAHULUAN
Ultra-Pressure Liquid
Chromatography

UPLC merupakan kromatografi cair kinerja tinggi yang

Validasi dan
memiliki ukuran partikel kurang dari 2 micron yang
Pengembangan
memungkinkan terjadi pemisahan lebih baik dari HPLC.
metode
Kelebihan dari UPLC diantaranya menggunakan partikel halus,
menghemat waktu serta mengurangi penggunaan pelarut. Ukuran
partikel yang kurang dari 2 mikron menyebabkan peningkatan
signifikan dalam efesiensi dan menurunkan laju aliran.
Instrumentasi UPLC terdiri dari tempat injeksi sampel, kolom
UPLC dan detektor. Sistem penghantaran pelarut memiliki
performa tekanan tinggi yang reprodusibel dengan laju pelarut
yang konstan.
 PENDAHULUAN
Rumusan Masalah
1) Mengapa perlu dilakukan pengembangan dan validasi
metode analitik dengan UPLC?
2) Bagaimana hasil studi stabilitas dari 5-HQ dan 5,7-HQ
dalam kondisi degradasi?
3) Apakah mengukur 5-HQ dan 5,7-HQ efektif dan efisien
pada pakan obat babi dengan menggunakan metode UPLC?
Tujuan Penelitian
1) Melakukan validasi metode analitik dengan UPLC untuk mengukur
5-HQ dan 5,7-HQ dalam pakan obat babi.
2) Melakukan studi stabilitas kedua analit dalam kondisi degradasi
meliputi suhu, kelembaban, sinar ultraviolet.
3) Melakukan pengukuran 5-HQ dan 5,7-HQ yang efektif dan efisien
pada pakan obat babi yang menggunakan metode UPLC dengan
waktu retensi yang lebih pendek dan menggunakan pelarut yang
lebih sedikit.
 TAHAPAN PENELITIAN
(BAHAN DAN METODE)
PAKAN
2 BABI
PERALATAN
Pakan obat babi yang diberikan terdiri
atas jagung, kedelai, sekam padi,
3 YANG DIGUNAKAN
Bahan Kimia
1 dan Reagen
gandum, tepung bunga matahari,
monocalcium fosfat, dedak, kalsium
Sistem UPLC Acquity H-Class
Waters, dilengkapi dengan pompa
5-chloro-8-hydroxyquinoline (5-HQ) karbonat dan bentonit. Untuk
kuaterner, sampel otomatis, oven
dan 5,7-dichloro-8-hydroxyquinoline penerapan metode, stabilitas pakan
kolom dan detektor photodiode array
(5,7-HQ), standar dari Sigma obat pada suhu ruang 60C dan 35%
Aldrich. Asetonitril dan metanol, HR. Kemudian, setiap pakan dikemas
(PDA). Pengumpulan data dan
asam o-fosfat, Sodium EDTA dan air dalam kantong plastik dan tiga lapis pemrosesan dilakukan dengan
Milli-Q (sistem Millipore) digunakan kertas kraft. perangkat lunak Empower 3.0 (versi
sepanjang percobaan. Filter
7.1, 2010).
membran (Nilon 0,45 µm)
 KONDISI
4 KROMATOGRAFI
FG asam o-fosfat 0,1% dlm air deionisasi
PERSIAPAN
& asetonitril (45:55 v/v). Suhu kolom
40C, suhu autosampler 15C. Deteksi
6 LARUTAN STOK
pada panjang gelombang 247 nm, laju Pakan babi yang diberi obat beratnya 100 mg,
aliran: 0,5 mL/mnt, volume injeksi: 10µL PERSIAPAN
5
dipindahkan dgn pipet 25 mL dan ditambah
dalam 3 menit. Pemisahan kromatografi LARUTAN STOK methanol. Lalu disonikasi dua menit. Kemudian
dilakukan diruang kontrol suhu (25±2C). ad. pelarut sampai tanda batas. Alikuot dari 800
Ditimbang 5-HQ dan 5,7-HQ 10 mg,
FG disiapkan dengan mencampur 235 µL µL dipindahkan ke labu ukur 25 mL dan
dilarutkan dlm metanol dan dipindahkan ke
asam o-fosfat dlm 200 mL air deionisasi ditambahkan air deionisasi. Jumlah 5-HQ dan
labu ukur 25 mL lalu ad. Pelarut sampai
(pH 2.5), lalu disaring dgn filter Pall 5,7-HQ ditentukan oleh interpolasi dalam kurva
tanda batas. Kemudian diperoleh 400 µg/mL
PVDF 0,45 µm dan disonikasi 15 menit kalibrasi.
obat. Alikuot 500µL dipindahkan ke dalam
sebelum digunakan.
labu ukur 25 mL, ditambah air deionisasi
dan diperoleh larutan stok 8 µg/mL obat.
 TAHAPAN PENELITIAN
(validasi)
Presisi dan
2 Akurasi
Evaluasi ketepatan instrumental pada 5-HQ
Linearitas
1 Kurva Kalibrasi
dilakukan 3 kali (80, 100 dan 120%) dgn
konsentrasi 296,36, 370,46, 444,54 ng/mL.
3 Selektivitas

Dibuat 6 konsentrasi pada 5-HQ Sedangkan pada 5,7-HQ dilakukan 6 kali secara Dilakukan dengan menganalisis pakan
(70- 120%) yaitu 148.18, 222.27, berulang pada konsentrasi 961,91, 1202,39, babi (berisi jagung, bungkil kedelai, sekam
296.36, 370.45, 444.54 dan 518.64 1442,86 ng/mL. Untuk mengetahui jml kedua padi, gandum, tepung bunga matahari,
ng/mL dan 6 konsentrasi pada 5,7- analit dilakukan pengembangan metode dengan monokalsium fosfat, dadak, kalsium karbonat
HQ yaitu 480,95, 721,43, 961,91, cara mengukur daerah puncak, dengan persamaan dan bentonit) untuk mengidentifikasi apakah
1202,39, 1442,86 dan 1683,34 garis lurus kurva kalibrasi. Keakuratan metode ada interferensi dari matrik dengan analit
ng/mL. Lalu dilakukan ditentukan dengan menghitung perolehan kembali yang sesuai (melalui perbandingan berbagai
perhitungann untuk mendapatkan setiap analit pakan obat yang mengandung 5-HQ kromatogram dan waktu retensi 5-HQ dan
persamaan regresi. dan 5,7-HQ. Presisi dinyatakan sebagai % SBR. 5,7-HQ dalam sampel dan standar ).
 Batas deteksi
4 (LOD) dan Batas
Kuantifikasi (LOC)
Disiapkan larutan 5-HQ berbagai
konsentrasi, 0,72 , 1,46 dan 2,18
ng/mL dan larutan 5,7-HQ pada
konsentrasi 2,30 4,61 , 6,92 ng/ml.
Perhitungan:
LOD = 3 Sb/b1
LOC=10 Sb/b1
Ket:
Sb: standar deviansi dari blanko
b1:kemiringan dari kurva kalibrasi.
6 Forced
Degradation Study
Dilakukan hidrolisis asam & alkali , oksidasi kimia
dengan H2O2 dan degradasi dgn lampu UV (365 nm). 15,6
mg standar 5,7-HQ dipindahkan ke labu ukur 100ml, lalu
5 Robustness ditambah 50 ml metanol dan ad. tanda batas. Masukkan 2 mL
larutan ke labu ukur 10 ml, lalu ditambah HCl 6 N ad. tanda
Metode robustness dievaluasi batas. Dilakukan prosedur sama, dgn mengganti HCl 6N
dengan menambahan 0,01 % EDTA menjadi H2SO4 3N, NaOH 6N, H2O2 30%. Menentukan
ke fase cair, dengan mengubah stabilitas larutan 5-HQ dan 5,7-HQ disimpan pada suhu 25C
rasio fase gerak H3PO4 : aseton dan dianalisis selama 24, 48 dan 120 jam.
nitril (50:50). Kemudian Analisis sampel degradasi, 600 µL larutan dipindahkan ke labu ukur
10 mL. Larutan alkali diadjust pH 4,0 dengan H2SO4 6N.
ditambahkan 0,1% HCOOH dan
Sedangkan larutan asam diadjust pH 4,0 dengan NaOH 6N.
menganalisis stabilitas sampel
Konsentrasi akhir 5- HQ 547,20 ng/mL dan 1888,92 ng/mL untuk
larutan pada suhu 25  2C selama 5,7-HQ. Larutan dianalisis dgn pengembangan metode UPLC.
24 jam.
 Hasil dan pembahasan
1.
Uji Kesesuaian
Sistem

Pada tabel 1, diperoleh parameter kesesuaian

sistem dalam analisis senyawa untuk 6 injeksi
terpisah. Nilai % SBR yang diperoleh dari 5-HQ
dan 5,7-HQ memenuhi persyaratan USP yaitu ≤
2%. Selain itu, dilakukan penentuan faktor
kapasitas (k) dan selektifitas (α), faktor tailing,
resolusi (Rs) dan pelat teoritis per meter
(efisiensi).
 Validasi Metode
2. Analitik
Sistem Linearitas
dan Koefisien Presisi dan
Korelasii Akurasi

5-HQ dan 5,7-HQ Nilai %SBR masing-

masing-masing sebesar 0,9993 masing 0,40% dan 1,39%.
dan 0,9988. Nilai yang diperoleh
Persyaratan metode merupakan kriteria
analisis akurat memiliki nilai penerimaan karena < 2%.
koefisien korelasi > 0,999.

Recovery Rata-rata persentase

(Perolehan recovery (persen perolehan
Kembali) kembali) 5-HQ dan 5,7 HQ
adalah 99,83% dan
100,23%. Persyaratan rata-
rata recovery adalah 95% -
102%.
 Batas deteksi dan
Batas Kuantifikasi
Batas deteksi dan kuantifikasi
5-HQ ditentukan dalam 0,69 Reproduksibilitas
ng/mL dan 2,09 ng/mL, sedangkan
Nilai recovery 5-HQ
batas deteksi dan kuantifikasi pada
99,2% dengan %SBR 0,7%
5,7-HQ ditentukan dalam 1,03
untuk analis 1 dan 98,9%
ng/mL dan 3,13 ng/mL.
dengan %SBR 0,6% untuk
analis 2.
Robustness
Untuk 5,7-HQ 100,6%
Metode yang diusulkan dengan
dengan %RSD 1,5% oleh
membuat modifikasi pada fase gerak
analis 1 dan 100,3% dengan
dan mengevaluasi stabilitas sampel
%SBR 0,9% oleh analis 2
dalam larutan setelah 24 jam, pada
kondisi normal dan berbeda, menunjukkan bahwa metode

menyatakan hasilnya sebagai ini dapat digunakan.

persentase perbaikan dan nilai absolut
dari perbedaan aritmatika.
 3. Studi Degradasi
- Gambar 2A: Puncak 5-HQ waktu retensi 0,79 menit,
sedangkan 5,7-HQ 1,65 menit.
- Gambar 2B: Puncak 5-HQ dan 5,7-HQ didegradasi
dengan H2SO4 3N tidak ada puncak tambahan.
- Gambar 2C: Analit yang terpapar oleh H2O2 30%
tidak ada puncak degradasi, pengamatan puncak
dilakukan dalam waktu 0,4 menit.
- Gambar 2D: Analit berada dibawah degradasi dengan
HCl 6N puncak tambahan ke 1,83 menit.
- Gambar 2E: Adanya puncak setelah penambahan
NaOH 6N, tidak ada puncak degradasi tambahan.
- Gambar 2F: Kromatogram analit setelah 24 jam
menunjukkan puncak yang terbentuk menghilang
karena hampir sama dengan garis dasar.
Hydrogen peroksida bereaksi dengan analit dan
adanya degradasi dari 5-HQ diamati saat nilai
mulai berkurang 7% sedangkan untuk 5,7-HQ
pengamatan dilakukan ketika berkurang hingga
34%. Berdasarkan dari semua studi degradasi,
dapat diketahui bahwa sinar UV dapat
menyebabkan degradasi yang lebih besar dan
lebih cepat dari kedua analit. Selama 24 jam, 5-
HQ terdegradasi sebesar 95% dan 5,7-HQ
terdegradasi sebanyak 89% meskipun tidak ada
produk degradasi yang terdeteksi oleh detektor
PDA. Karena nilai SBR yang dihasilkan kurang
dari 2% maka metode ini dapat digunakan dan
dirasa lebih efisien.
 Aplikasi untuk
4. Sampel

Metode yang dikembangkan berhasil diterapkan dalam

mengukur 5-HQ dan 5,7-HQ didalam tiga pakan babi yang
berbeda yaitu pada sampel A, B dan C pada suhu 60 ̊C dan
35% RH. Penelitian ini bertujuan dalam mengusulkan metode
baru untuk mendeteksi 5- HQ, 5,7-HQ dan produk degradasi
yang mungkin terjadi dari kedua analit. Kondisi yang cocok
diusulkan untuk penelitian di masa depan dan kuantifikasi 5-
HQ dan 5,7-HQ dalam waktu kurang dari 2 menit.

Metode divalidasi yang diusulkan ini telah terbukti kuat, sehingga dapat digunakan dalam penentuan 5-HQ dan 5,7 -HQ yang
ada dalam berbagai jenis makanan babi. Seperti yang diamati jumlah 5-HQ telah menurun menjadi 58,9% dalam pakan obat A dan
pada pakan obat B menjadi 62,4%, pakan obat C berkurang menjadi 85,2%. Kandungan 5,7-HQ dalam pakan obat A menurun
menjadi 83,1%, dan dalam pakan obat B menurun menjadi 57,3%, sedangkan pakan obat dalam sampel C menurun menjadi 98,7%.
Hasil ini menunjukkan bahwa sampel C merupakan yang paling stabil karena penurunannya hanya sekitar 15% dari 5-HQ dan 2%
5,7-HQ hadir dalam sampel umpan ini.
 KESIMPULAN
Metode baru ini untuk mengukur 5- Metode yang divalidasi ini selektif, sensitif, akurat dan tepat. Analisis statistik
HQ dan 5,7-HQ dalam pakan babi mengungkapkan bahwa metode ini dapat diulang dan selektif untuk analisis 5-HQ
dikembangkan dan divalidasi, telah dan 5,7-HQ tanpa adanya gangguan. Studi degradasi paksa menunjukkan bahwa 5,7-
memenuhi persyaratan yang ditentukan HQ lebih rentan terhadap degradasi daripada 5-HQ dengan hidrogen peroksida
dalam pedoman validasi ICH. karena pemulihannya lebih rendah dari 5,7-HQ, tetapi 5-HQ lebih rentan daripada
5,7-HQ terhadap asam klorida dan khususnya dengan sinar UV adalah metode yang
dapat menurunkan sebagian besar antara keduanya. Kesesuaian metode ini dapat
digunakan untuk analisis sampel stabilitas yang diperoleh selama percobaan stabilitas
dipercepat, dan pakan babi.