HLA-DQ A1, -DQB1 AND –DRB1 Gene Polymorphism -

In Malay Type 1 Diabetes Mellitus Patients

And Their Use For Risk Prediction
A G Rohana, K C Loh, S K Tin, C H Soh, W M Wan Nazaimoon, K Y Fong, K Nor Azmi, B
A K Khalid

Med J Malaysia Vol 66 No 2 June 2011

RESTY VARIA TUTUPOHO 1

 DAFTAR SINGKATAN
CI : Confidence interval
HLA : Human leucocyte antigen
MHC : Major histocompatibility complex
Pc : P value corrected for the number of statistical comparisons
PCR : Polymerase chain reaction
RR : Relative risk
DM : Diabetes mellitus.

2
 PENDAHULUAN
Diabetes mellitus (DM) tipe 1:
- penyebab heterogen
- dipengaruhi faktor lingkungan
- penerimaan autoimun

Predisposisi rusaknya sel beta pancreas dikaitkan dengan variasi

genetik pada kromosom yang berbeda.

Gen pada major histocompatibility complex (MHC) kelas II pada

lengan pendek kromosom 6  penentu berkembangnya DM tipe 1.

Patel (1977), hubungan gen human leucocyte antigen (HLA) dan DM

tipe 1 pada Kaukasian dengan molekul B8 atau B15 kelas I
 …pendahuluan
Hubungan kuat DM tipe 1 dengan gen MHC Class II dengan variasi ras
yang jelas: DR3 atau DR4 pada Kaukasian, dan DR4 atau DR9 pada
orang Jepang
Davies et al, 1994; Wolf, 1983; Ito, 1988

Berdasar genotip, polimorfisme gen HLA-DQA1, -DQB1, dan -DRB1

berhubungan dengan DM tipe 1
Todd, 1990

Alel HLA- DR/DQ sebagai predisposisi atau protektor DM tipe 1

ADA, 2005

Penemuan ini memberi prediksi risiko yang lebih baik bagi DM tipe 1
dan memberi informasi pada anak muda termasuk prediksi destruksi
sel β dan diabetes cenderung ketosis
Koji, 2006; Ramaswami et al, 2008
 …pendahuluan
Peningkatan global prevalensi DM tipe 1, tingkat prevalensi orang Asia
lebih rendah  dipengaruhi banyaknya penerimaan ekspresi HLA
 TUJUAN
Memeriksa polimorfisme gen HLA-DQA1, -DQB1, dan -DRB1 pada
pasien DM tipe 1 etnis Melayu.
 METODE
Desain : Kohort
Tempat : Hospital Universiti Kebangsaan Malaysia
Tan Tock Seng Hospital
Populasi : 75 pasien Melayu DM tipe 1
Etik : Komite Etik RS Universiti Kebangsaan Malaysia dan
RS Tan Tock Seng, dan informed consent
Statistik : Pearson chi- square test atau Fisher’s exact dan
logistic regression

7
Table I: Characteristics of 75 patients (34 males, 41 females) with type 1 DM
Median (range)
Age at evaluation 22.0 yr (0.2 – 52.0 yr)
Age at diagnosis 14.0 yr (0.2 – 38.0 yr)
Body mass index (BMI) 19.9 kg/m2 (13.6 – 29.7 kg/m2)
Waist-hip ratio (WHR) 0.8 (0.7 – 0.9)
Basal C-peptide* 133 pmol/L (0 – 487 pmol/L)
Stimulated C-peptide* 201 pmol/L (0 – 669 pmol/L)
Proportion of patients with positive autoimmune markers for type 1 DM

Glutamate decarboxylase antibody (GAD) 0/75 (40.0%)

Tyrosine phosphatase antibody (IA-2) 4/48 (8.3%)
Insulin auto-antibodies (IAA) 24/48 (50.0%)
*Basal and stimulated C-peptide levels refer to basal (fasting) and 30-minute post 1 mg glucagon-stimulated
values respectively.
 …metode
Pengumpulan darah dan ekstraksi DNA
- 10 ml darah dengan EDTA dengan kondisi aseptic
- DNA genomic (1-2 μg) dieksraksi dengan DNAzol dan disimpan pada
suhu 4°C  siap untuk typing
Millet, 1988

9
 …metode
Amplifikasi gen oleh polymerase chain reaction (PCR)
- 50 – 100 ηg genom DNA sebagai template untuk amplifikasi gen
HLA kelas II dengan metode PCR.
- Amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal 94°C selama 3 menit
 denaturasi 94°C 35 siklus selama 10 detik  diperkuat dengan
60°C (kecuali untuk DRB1 dimana suhu yang kuat adalah 55°C)
selama 30 detik  diperpanjang pada suhu 72°C selama 30 detik
 diperpanjang suhu 72°C selama 5 menit.

DNA polymerase DyNAzyme (Finnzymes Oy) digunakan dan

dilakukan thermal cycling dengan PTC-200 thermal cycler (MJ
Research, USA)

Kontrol positif dan negatif digunakan pada semua amplifikasi PCR.

 …metode
Analisis polimorfisme gen DQA1, DQB1, DRB1
Setelah amplification, 7 μl produk PCR dibiakkan dengan restriksi
enzim sesuai instruksi manufaktur

Total, ada 22 enzim restriksi yang berbeda digunakan dalam typing

HLA kelas II DRB1, DQA1 and DQB1
Inoko, 1993

Gel elektroforesis
Sampel restriksi enzyme-cleaved DNA yang amplified 
dielektroforesis menggunakan pengecatan ethidium-bromide gel
agarose 3% atau gel agarose NuSieve GTG 4%

Hasil diperiksa dibawah cahaya ultraviolet dan didokumentasi

dengan foto.
 HASIL
Frekuensi alel DQA1 dan DQB1
Frekuensi alel pada pasien DM tipe 1 dibandingkan dengan control
(tabel II)
Table II: Distribution of DQA1 alleles among Type 1 DM patients and healthy controls
Patient % Control %
Relative Risk (95% CI) P value Pc value
(n = 75) (n = 162)
DQA1*0101 10.7 10.5 1.05 (0.44 – 2.50) 0.968 NS
DQA1*0102 33.3 50.0 0.50 (0.29 – 0.89) 0.016 NS
DQA1*0103 8.0 12.3 0.65 (0.26 – 1.64) 0.319 NS
DQA1*0201 9.3 21.0 0.41 (0.18 – 0.95) 0.027 NS
DQA1*0301 18.7 12.3 1.64 (0.79 – 3.42) 0.197 NS
DQA1*0401 0.0 3.1 0.19 (0.01 – 3.47) 0.182 NS
DQA1*0501 50.7 20.4 3.97 (2.20 - 7.15) < 0.001 < 0.01
DQA1*0601 14.7 35.2 0.33 (0.16 - 0.66) 0.001 0.008
Pc = corrected P value for the number of different DQA1 alleles tested
NS = not statistically significant

12
 …hasil
Frekuensi alel DQB1 pada pasien DM tipe 1 dibandingkan dengan
kontrol yang sehat (tabel III)
Table III: Distribution of DQB1 alleles among Type 1 DM patients and healthy controls
Patient % Control %
Relative Risk (95% CI) P value Pc value
(n = 75) (n = 162)
DQB1*0201 48.0 19.1 3.86 (2.13 - 6.99) < 0.001 < 0.05
DQB1*0301 26.7 44.4 0.46 (0.25 - 0.83) 0.009 NS
DQB1*0302 12.0 7.4 1.72 (0.71 - 4.20) 0.247 NS
DQB1*0303 10.7 7.4 1.52 (0.61 - 3.79) 0.401 NS
DQB1*0402 0.0 0.6 0.71 (0.03 – 17.71) 1.000 NS
DQB1*0501 22.7 33.3 0.60 (0.32 - 1.11) 0.095 NS
DQB1*0502 17.3 17.9 0.98 (0.48 - 1.99) 0.915 NS
DQB1*0503 6.7 13.0 0.51 (0.19 - 1.37) 0.149 NS
DQB1*0601 4.0 23.5 0.16 (0.05 - 0.48) < 0.001 < 0.05
DQB1*0602/3 0.0 2.5 0.23 (0.01 - 4.39) 0.311 NS
DQB1*0604 2.7 0.6 3.66 (0.47 – 28.25) 0.236 NS

Pc = corrected P value for the number of different DQB1 alleles tested

NS = not statistically significant

13
 Table IV: Distribution of DRB1 alleles among IDDM patients and healthy controls
Patient % (n =
75)
Control % (n =
162)
Relative Risk (95% CI) P value …hasil
Pc value

Frekuensi
DRB1*0103 alel DRB1
DRB1*0301
1.3
38.7
1.2
6.8
1.29 (0.17 - 9.97)
8.36 (3.92 - 17.81)
1.000
< 0.001
NS
< 0.05
Frekuensi
DRB1*0302 alel DRB1
0.0 pada DM
1.2 tipe 1 (tabel IV)- 8.97)
0.43 (0.02 1.000 NS
DRB1*0401 0.0 0.6 0.71 (0.03 - 17.71) 1.000 NS
DRB1*0402 1.3 0.6 2.17 (0.22 - 21.19) 0.534 NS
DRB1*0405 10.7 3.1 3.61 (1.19 - 10.94) 0.028 NS
DRB1*0406 4.0 4.3 1.00 (0.27 - 3.67) 1.000 NS
DRB1*0701 5.3 12.3 0.44 (0.15 - 1.26) 0.096 NS
DRB1*0802 0.0 1.2 0.43 (0.02 - 8.97) 1.000 NS
DRB1*0803 5.3 8.6 0.64 (0.22 - 1.93) 0.371 NS
DRB1*0901 9.3 13.0 0.72 (0.30 - 1.74) 0.421 NS
DRB1*1001 5.3 4.9 1.14 (0.35 - 3.71) 1.000 NS
DRB1*1101 2.7 1.9 1.55 (0.30 - 8.04) 0.653 NS
DRB1*1201 1.3 0.0 6.54 (0.26 - 162.53) 0.316 NS
DRB1*1202 30.7 50.6 0.44 (0.25 - 0.78) 0.004 NS
DRB1*1302 0.0 0.6 0.71 (0.03 - 17.71) 1.000 NS
DRB1*1304 0.0 0.6 0.71 (0.03 - 17.71) 1.000 NS
DRB1*1305 0.0 3.7 0.16 (0.01 - 2.87) 0.181 NS
DRB1*1401 2.7 1.2 2.18 (0.37 - 12.88) 0.593 NS
DRB1*1404 4.0 6.2 0.70 (0.20 - 2.43) 0.760 NS
DRB1*1405 0.0 0.6 0.71 (0.03 - 17.71) 1.000 NS
DRB1*1501 13.3 16.0 0.83 (0.38 - 1.79) 0.588 NS
DRB1*1502 22.7 37.7 0.49 (0.27 - 0.92) 0.022 NS
DRB1*1601 1.3 1.2 1.29 (0.17 - 9.97) 1.000 NS
DRB1*1602 2.7 0.0 11.05 (0.52 - 233.16) 0.099 NS
14
Pc = corrected P value for the number of different DRB1 alleles tested
NS = not statistically significant
 …hasil
Prediksi risiko berdasar genotype HLA
Menggunakan trend test, efek dosis melihat alel HLA- DQA1*0501,
DQB1*0201, DRB1*0301, DQA1*0601 dan DQB1*0601 (highest P value
= 0.015)

DQA1*0501, DQB1*0201, DRB1*0301  hubungan positif antara DM

tipe 1 dan beberapa alel tertentu

HLA-DQA1*0601 dan DQB1*0601  hubungan negatif antara DM tipe

1 dan beberapa alel tertentu

15
 …hasil
Efek dosis: Odds DM tipe 1 = 0.39x5.68NDRB1*0301 x0.18NDQB1*0601

Dimana NDRB1*0301 = 0, jika subyek tidak punya alel DRB1*0301

1, jika DRB1*0301 subyek heterozigot
2, jika DRB1*0301 subyek homozigot
dan NDQB1*0601 sama

Relative risk (RR) untuk DM tipe 1 meningkat untuk tiap peningkatan

unit alel DRB1*0301 dengan 5.68 (P < 0.001).

RR DM tipe 1 menurun dengan 0.18 pangkat alel DQB1*0601 (P <

0.001)

Setelah disesuaikan, DQA1*0501, DQB1*0201 dan DQA1*0601 tidak

signifikan secara statistik sebagai predictor risiko pada P values 0.063,
16
0.890 dan 0.217
 …hasil
Model ini mengklasifikasikan 76.8% subyek berdasarkan kelompok
status penyakit

Model ini mencapai klasifikasi yang benar 94.4% diantara kontrol dan
38.7% diantara pasien

17
 DISKUSI
Studi ini, melaporkan frekuensi alel HLA-DQ and HLA-DR pada pasien
DM tipe 1 etnis Melayu  pengaruh kompleks HLA pada penerimaan
DM tipe 1 etnis Melayu

Mendukung data: marker HLA pada DM tipe 1 dan derajat risiko yang
diberikan bervariasi antar kelompok ras dan etnik.

Studi ini, HLA-DRB1*0301  marker genetik yang bebas untuk DM

tipe 1 ada etnis Melayu (RR = 8.36).

Studi pada orang Kaukasian, kulit hitam, dan Cina, kecuali Jepang:
HLA-DRB1*0301  marker genetik yang bebas untuk DM tipe 1.
Ronningen, 1991; Escribano-de-Diego, 1999, Kockum, 1993; Garcia et al, 1992; Lee, 1985; Chan, 1995;
Chang, 1995; Penny et al, 1992, Jenkins, 1990; Ikegami et al, 1992

18
 …diskusi
studi ini tidak menemukan hubungan antara haplotipe HLA-DR4 dan
DM tipe 1 pada etnis Melayu

Kebalikan dengan populasi Kaukasian, mirip dengan studi populasi

Cina
Lee, 1985; Penny et al, 1992; Hu, 1993

Belum ada laporan insidens DM tipe 1 diantara populasi asli etnis

Melayu  diyakini insidensnya rendah ~ populasi Cina dan Jepang.

Prevalensi DM tipe 1 yang rendah pada populasi Asia  rendahnya

frekuensi alel HLA-DR
Lee, 1985; Ikegami et al, 1992; Hu, 1993

19
 …diskusi
Studi ini, HLA-DQB1*0601  marker genetik independen (RR = 0.16)
melawan terjadinya DM tipe 1  tak biasa pada etnis Melayu

Cruickshanks (1994), penurunan frekuensi HLA- DQB1*0601/0603

pada anak kulit putih non-Hispanik dengan DM tipe 1 dari Kolorado

Tidak ada hubungan antara HLA-DQB1*0601 dan DM tipe 1 Kaukasian

dari Norwegia , Italia dan Spanyol Utara
Ronningen, 1991; Escribano-de-Diego, 1999

Kurangnya hubungan antara HLA-DQB1*0601 dan DM tipe 1 juga

terbukti pada Hispanik, Kulit hitam, Jepang dan Cina
Cruickshanks, 1994; Garcia-Pacheco, 1992; Ikegami et al, 1992; Chan, 1995; Hu, 1993

20
 …diskusi
Studi ini tidak menemukan efek protektif pada HLA-DQB1*0602/3
pada DM tipe 1
Kockum, 1993; Khalil et al, 1990; Mijovic, 1991; Jenkins, 1991; Awata et al, 1990

Frekuensi HLA- DQB1*0602/3 yang rendah pada tnis Melayu

menutupi hubungan negatifnya dengan DM tipe 1.

Efek protektif HLA-DQB1*0602/3 pada DM tipe 1 pada Kaukasian,

Kulit hitam, India Utara, dan Jepang
Kockum, 1993; Khalil et al, 1990; Mijovic, 1991; Jenkins, 1991; Awata et al, 1990
Chuang, 1995; Penny et al, 1992; Hu, 1993

21
 …diskusi
Studi ini tidak menemukan HLA-DQA1*0301 sebagai alel primer DM
tipe 1 pada etnis Melayu

Populasi Hispanik dan kulit putih non-Hispanik, kulit hitam, Jepang dan
India Utara  HLA-DQA1*0301 sebagai alel primer pada DM tipe 1
Ronningen, 1991; Escribano-de-Diego, 1999, Cruickshanks, 1994; Buzzetti et al, 1993; Khalil et al, 1990;
Garcia-Pacheco et al, 1992, Mijovic, 1991; Ikegami et al, 1992; Yamagata et al, 1991; Todd, 1990, Jenkins,
1991

Studi pada populasi Cina  peyimpangan serupa dari ras lainnya

Chuang, 1995; Penny et al, 1992; Hu, 1993

Studi di Taiwan, alel HLA-DQA1*0301 berhubungan dengan DM tipe 1

hanya pada individu yang mempunyai haplotipe DR4 atau DR9
Chuang, 1995; Hu, 1993

22
 …diskusi
Studi ini, tidak satupun hubungan DR4- atau DR9- ditemukan pada
etnis Melayu

Meningkatnya frekuensi haplotipe DR3, bukan DR4 atau DR9, pada

anak Cina DM tipe 1 di Singapura
Lee, 1985

23
 …diskusi
Studi ini ~ populasi Kaukasian  HLA-DQA1*0501 marker risiko untuk
DM tipe 1 pada populasi Kaukasian, kulit hitam, dan Jepang
Escribano-de-Diego, 1999; Jenkins, 1991; Garcia-Pacheco et al, 1992; Todd, 1990

HLA-DQB1*0201 berhubungan dengan Kaukasian, Kulit hitam, dan

Cina
Escribano-de-Diego, 1999; Jenkins, 1991; Clayton, 1993; Chan, 1995

24
 …diskusi
Studi ini, HLA- DQA1*0501 dan HLA-DQB1*0201 tak signifikan sebagai
faktor risiko dalam model regresi logistik

India Utara, penerimaan mayor alel HLA- DQA1*0501 dan HLA-

DQB1*0201 yang memperlihatkan risiko tertinggi untuk DM tipe 1
dengan kombinasi HLA- DQA*0501-DQB1*0201
Kanga, 2004

Observasi ini, membuat hubungan disekuilibrium untuk pengaruh bagi

alel HLA yang lain tidak dilakukan  haplotype DR3 mempunyai
susunan alel DRB1*0301- DQA1*0501-DQB1*0201
Todd, 1990; Kockum, 1993; Chuang, 1995; Ikegami et al, 1992; Khalil et al, 1990; Mijovic, 1991; Jenkins,
1991

25
 CONCLUSION
SIMPULAN
• Pada etnis Melayu, HLA-DR dan DQ- marker unik DM tipe 1
• Perbedaan hubungan HLA antar grup etnik dipengaruhi perbedaan
disekuilibrium linkage.
• Model prediksi risiko untuk DM tipe 1 dibuat berdasar kuantitas
penerimaan alel HLA- DRB1*0301 dan alel protektif HLA-
DQB1*0601
• Perhatian pada pengaruh gen pada aspek (onset penyakit, destruki
sel B komplit, dan kecenderungan ketosis) dari DM tipe 1
menjanjikan informasi yang tak ternilai untuk mengantisipasi awal
dan mengenali penyakit diantara pasien. 26
TERIMA KASIH

27