KROMATOGRAFI KOLOM

Iva Rinia Dewi.,S.Farm.,M.Sc.,Apt

 Kromatografi
kolom adalah metode
yang digunakan untuk
memurnikan bahan kimia tunggal
dari campurannya
 Metode ini sering digunakan untuk

aplikasi preparasi pada skala

mikrogram hingga kilogram. 
 Keuntungan utama kromatografi
kolom adalah biaya yang rendah dan
kemudahan membuang fasa diam
 yang telah digunakan. Kemudahan
pembuangan fasa diam ini
mencegah kontaminasi silang dan
degradasi fasa diam akibat
pemakaian ulang atau daur ulang.
 Kromatografikolom preparatif klasik
berupa tabung kaca dengan diameter
antara 5 mm hingga 50 mm dengan
panjang 5 cm hingga 1 m dengan
keran dan pengisi (dengan sumbat
kaca atau serat kaca – untuk
mencegah hilangnya fasa diam) pada
bagian bawah
Dua metode yang
umum digunakan
untuk preparasi
kolom adalah:
metode kering dan
Metode kering
 Pada metode kering, kolom
pertama kali diisi dengan serbuk
kering fasa diam, kemudian
kolom dialiri fasa gerak hingga
seluruh kolom terbasahi. Mulai
titik ini, fasa diam tidak
diperkenankan mengering.
Metode basah
 Pada metode basah, fasa diam dibasahi dengan 
fasa gerak hingga menjadi bubur di luar kolom,
dan kemudian dituangkan perlahan-lahan ke
dalam kolom. Pencampuran dan penuangan
harus ekstra hati-hati untuk mencegah
munculnya gelembung udara.
 Larutan bahan organik diletakkan di bagian atas
fasa diam menggunakan pipet. Lapisan ini
biasanya ditutup dengan lapisan kecil pasir atau
katun atau wol kaca untuk melindungi bentuk
lapisan organik dari tuangan eluen
 Eluenkemudian dialirkan perlahan
melalui kolom sambil membawa
sampel bahan organik. Sering kali,
wadah eluen sferis atau corong
pisah bersumbat yang sudah diisi
eluen diletakkan di bagian atas
kolom.
 Komponen-komponen tunggal tertahan
oleh fasa diam secara berbeda satu sama
lain pada saat mereka bergerak bersama
eluen dengan laju yang berbeda melalui
kolom.
 Di akhir kolom, mereka terelusi satu per

satu. Selama keseluruhan proses

kromatografi, eluen dikumpulkan sesuai 
fraksi-fraksinya. 
 Fraksi-fraksi dapat dikumpulkan
secara otomatis oleh pengumpul
fraksi.
 Produktivitas kromatografi dapat

ditingkatkan dengan menjalankan

beberapa kolom sekaligus. Di sini,
diperlukan pengumpul multi
aliran.
 Komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan
masing-masing fraksi dianalisa senyawa
terlarutnya, misalnya dengan kromatografi,
absorpsi sinar UV atau fluoresensi.
 Senyawa berwarna (atau senyawa
berfluoresensi di bawah lampu UV) dapat
terlihat di dalam kolom sebagai pita-pita
bergerak.
Fase Diam
 Fasadiam atau adsorben (penjerap)
dalam kromatografi kolom adalah
zat padat. Fasa diam yang paling
umum untuk kromatografi kolom
adalah silika gel, diikuti dengan 
alumina. Serbuk selulosa pernah
banyak digunakan. 
Fase Gerak
 Fasa gerak atau eluen dapat berupa 
pelarut murni atau campuran pelarut.
Pemilihan dilakukan sedemikian rupa
sehingga nilai faktor retensisenyawa
yang diinginkan berada pada kisaran
0,2 - 0,3 untuk meminimalkan waktu
dan jumlah eluen yang diperlukan
selama kromatografi. 
 Eluen dapat pula dipilih berdasarkan
daya pisahnya sehingga senyawa yang
berbeda dapat dipisahkan secara efektif.
 Optimasi eluen dilakukan melalui uji

pendahuluan berskala kecil, biasanya

menggunakan kromatografi lapisan tipis
 (KLT) dengan fasa gerak yang sama.
 Ada laju aliran optimum untuk masing-masing
pemisahan. Semakin cepat laju aliran eluen akan
meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk
melalui kolom sehingga meminimalkan difusi,
menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
 Namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi
karena analit memerlukan waktu tertentu untuk
berada pada kesetimbangan antara fasa diam-
fasa gerak, lihat persamaan Van Deemter.
 Persamaan van Deemter
 Van Deemter membuat hubungan antara

kecepatan fase gerak terhadap HETP dan

hubungan tersebut secara umum dinamakan
persamaan Van Deemter.
 Dari kedua gambar di atas kurva
paling atas (yg ada tulisan HETP)
merupakan resultan dari ketiga
gaya tsb.
 Semakin tinggi resultan –> HETP

semakin tinggi berarti efisiensi

kolom lebih jelek.
 Sedangkan makin rendah resultan

–> HETP makin rendah efisiensi

 Kenapa?
 Karena ada rumus lagi yaitu:

Jumlah lempeng teoritis = Panjang kolom /

HETP (lebar lempeng teoritis)
 N = L / HETP
 Efisiensi kolom meningkat jika N / jumlah
lempeng teoritis meningkat.
 Kenapa?
 Karena semakin banyak lempeng teoritis

maka pemisahan semakin baik

(diumpamakan semakin banyak pula corong
pisahnya ekstraksinya lebih baik). Semakin
panjang L (panjang kolom) maka semakin
banyak jumlah lempeng teoritis dan efisiensi
semakin bagus.
 Namun bila HETP lebih besar efisiensi kolom jelek.
 kenapa?
 Karena berarti lebar untuk 1 kolom teoritis lebih
besar sehingga dalam kolom yg panjangnya sama,
jumlah lempeng teoritisnya lebih sedikit.
 Misalnya ada dua kolom, dimana panjang kolom
(L) nya sama2 100 cm. Kolom 1 HETPnya 5 cm
sedangkan kolom 2 HETPnya 10 cm. Berarti dalam
kolom 1 ada 20 lempeng teoritis kan (dari
100/5) ? lebih besar daripada di kolom 2 yg
lempeng teoritisnya cuma 10 (100/10)
 Kolom laboratorium sederhana bekerja dengan
prinsip aliran gravitasi.
 Laju aliran kolom semacam ini dapat dinaikkan
dengan menambah eluen baru di bagian atas fasa
diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di
bagian bawah.
 Laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh
dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan
(misalnya: udara, nitrogen, atau argon) untuk
menekan pelarut melalui kolom (kromatografi
kolom kilat)
Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi
kolom kilat biasanya lebih halus daripada
kromatografi kolom gravitasi.
 Misalnya, silika gel untuk kromatografi kilat

berukuran antara  230 – 400 mesh (40 –

63 µm), sementara untuk kromatografi
gravitasi antara 70 – 230 mesh (63 – 200 µm)
 Telah dikembangkan lembar lajur (spreadsheet)
yang mendukung suksesnya pengembangan
kolom kilat.
 Lembar lajur memperkirakan volume retensi dan
pita volume analit, jumlah fraksi yang
diperkirakan untuk masing-masing kandungan
analit, dan resolusi antara dua puncak yang
berdekatan.
 Informasi ini memungkinkan pengguna memilih
parameter optimal untuk pemisahan berskala
preparatif sebelum dicobakan pada kolom kilat.
Sistem otomasi
 Kromatografi kolom adalah tahapan yang sangat
memakan waktu dalam laboratorium apapun, dan
dapat berubah menjadi suatu proses leher botol
dalam sekejap.
 Oleh karenanya, beberapa pabrikan seperti Buchi,
Interchim dan Teledyne Isco telah mengembangkan
sistem otomasi kromatografi kilat (biasanya dirujuk
sebagai KCTR, kromatografi cair tekanan rendah (
bahasa Inggris: low pressure liquid chromatography,
LPLC) dengan tekanan antara 350–525 kPa atau 50,8–
76,1 psi, yang meminimalisir keterlibatan manusia
dalam proses pemurnian.
 Resolusi (kemampuan memisahkan campuran)
pada sistem LPLC pasti lebih rendah daripada
KCKT, karena bahan kemasan dalam kolom KCKT
dapat lebih kecil, biasnya hanya 5 mikrometer
sehingga meningkatkan luas permukaan fasa
diam, meningkatkan luas permukaan interaksi
dan pemisahan menjadi lebih baik.
 Namun, penggunaan media berkemasan kecil ini
menyebabkan tekanan balik yang tinggi dan
itulah mengapa disebut kromatografi cair kinerja
tinggi
  Kolom LPLC biasanya dikemas dengan silika
sekitar 50 mikrometer, sehingga mengurangi
tekanan balik dan resolusi, tetapi juga
menghilangkan kebutuhan pompa bertekanan
tinggi yang mahal.
 Pabrikan juga sekrang mulai berpindah kepada

sistem kromatografi kilat bertekanan tinggi dan

memberinya nama sistem kromatografi cair
tekanan menengah (bahasa Inggris: medium
pressure liquid chromatography, MPLC) yang
beroperasi pada tekanan di atas 1 Mpa (150 psi).
Perhitungan Rosulusi Kromatogram
 Ada juga kromatografi kolom yang dilengkapi
dengan pompa peristaltik, mengalirkan dapar dan
larutan sampel melalui bagian atas kolom.
Larutan dan dapar mengalir melalui kolom hingga
mencapai pengumpul fraksi di bagian akhir kolom
untuk mengumpulkan sampel yang terelusi.
Sebelum mencapai pengumpul sampel, sampel
yang dielusi dari kolom melewati suatu detektor
seperti spektrofotometer atau spektrometer
massa sehingga konsentrasi sampel yang sudah
dipisahkan dalam campuran dapat ditentukan.
 Sebagai contoh, jika kita ingin memisahkan
dua protein yang berbeda dengan kapasitas
ikatan terhadap kolom yang berbeda dari
suatu larutan, jenis detektor yang baik adalah
spektrofotometer dengan panjang gelombang
280 nm.
 Semakin tinggi konsentrasi protein yang

melalui kolom, semakin besar absorbansinya

pada panjang gelombang tersebut.
 Oleh karena kromatografi kolom
mempunyai aliran tetap untuk semua
eluat yang melalui detektor dengan
berbagai macam konsentrasi, harus
dibuat plot dari detektor antara
konsentrasi sampel terelusi melawan
waktu. Plot konsentrasi sampel versus
waktu ini disebut dengan
kromatogram.
 Tujuan utama kromatografi adalah untuk
memisahkan komponen yang berbeda dari suatu
campuran larutan.
 Resolusi menyatakan daya pemisahan antar
komponen dalam campuran.
 Semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin
baik pemisahan sampel yang dihasilkan oleh
kolom.
 Data ini adalah cara terbaik menentukan sifat
pemisahan kolom untuk sampel tertentu.
Resolusi dapat dihitung dari kromatogram.
 Kurva terpisah dalam diagram mewakili profil
konsentrasi elusi sampel yang berbeda selama
proses, berdasarkan afinitasnya terhadap resin
kolom. Untuk menghitung resolusi, diperlukan
waktu retensi dan lebar kurva.
 Waktu retensi: waktu dari awal sinyal terdeteksi
oleh detektor hingga titik puncak profil konsentrasi
elusi masing-masing sampel yang berbeda.
 Lebar kurva: lebar kurva profil konsentrasi sampel
yang berbeda dalam kromatogram dalam satuan
waktu.
 Metode yang sudah disederhanakan dalam
menghitung resolusi kromatogram adalah
menggunakan model pelat.
  Model pelat berasumsi bahwa kolom dapat

dibagi menjadi sejumlah seksi tertentu,

atau pelat, dan kesetimbangan massa dapat
dihitung untuk masing-masing pelat
tunggal.
 Pendekatan ini memperkirakan kurva
kromatogram sebagai kurva distribusi
Gaussian. Dengan melakukan ini, lebar
 Dari variabel dalam gambar di atas, resolusi, jumlah pelat, dan tinggi
pelat model pelat kolom dapat dihitung menggunakan persamaan:
 Resolusi (Rs):
 Rs = 2(tRB – tRA)(wB + wA)
 dengan:
 tRB = waktu retensi solut B
 tRA = waktu retensi solut A
 wB = lebar alas kurva Gaussian solut B
 wA = lebar alas kurva Gaussian solut A
 Jumlah pelat (N):
 N = (tR)2(w/4)2
 Tinggi pelat (H):
 H = LN
 dengan L adalah panjang kolom.
Kesetimbangan Absorbsi kolom
 Untuk sebuah kolom adsorpsi, resin kolom
(fasa diam) tersusun atas butiran mikro
(microbead). Bahkan partikel-partikel yang
lebih kecil seperti protein, karbohidrat, ion
logam, atau senyawa kimia lainnya
berkonjugasi pada microbead ini. Masing-
masing partikel yang terikat
pada microbead diasumsikan dapat mengikat
solut sampel yang akan dimurnikan atau
dipisahkan dengan rasio 1:1, dialirkan melalui
kolom
 Ikatan antara molekul target yang akan
dipisahkan dengan molekul yang terikat
pada microbead dapat dituliskan sebagai
reaksi kesetimbangan sederhana 
 Keq = [CS]([C][S]) dengan Keqadalah tetapan
kesetimbangan, [C] dan [S] adalah
konsentrasi molekul target dan molekul yang
terikat pada resin kolom. [CS] adalah
konsentrasi senyawa kompleks molekul
target yang terikat pada resin kolom
 Berdasarkan ini, tiga kondisi
isotermal yang berbeda dapat
digunakan untuk menjelaskan
dinamika ikatan kromatografi
kolom: linear, Langmuir, dan
Freundlich.
 Isotermal linear terjadi ketika konsentrasi
solut yang akan dimurnikan relatif sangat
kecil dibandingkan molekul terikat. Oleh
karena itu, kesetimbangannya dapat
didefinisikan sebagai:
 [CS] = K [C].
eq
 Untuk penggunaan skala industri, total
molekul terikat pada butiran resin harus
diperhitungkan karena ruang-ruang kosong
harus diperhitungkan.
 Isotermal Langmuir dan isotermal Freundlich

berguna untuk menjelaskan kondisi

kesetimbangan ini.
 Isotermal Langmuir: [CS] = (K S [C])(1 +
eq tot
Keq[C]), dengan Stot total molekul terikat pada
butiran penyangga fasa diam.
 Isotermal Freundlich:
 [CS] = K [C]1/n
eq
 Isotermal Freundlich digunakan ketika kolom

dapat mengikat banyak sampel yang berbeda

dalam larutan yang akan dimurnikan.
 Oleh karena banyak sampel berbedah memiliki

tetapan ikatan terhadap butiran yang berbeda,

akan muncul banyak Keq.
 Oleh karenanya, isotermal Langmuir bukan

merupakan model yang bagus untuk kasus ikatan

ini
 Column loaded with silica/column medium
 Eluting solvent added to compact silica layer and to
remove air bubbles
 Purple mixture as a thin layer is added to top of silica
layer
 Eluting solvent added and eluted (purple layer
separates into a red and blue layer)
 Eluting solvent added and eluted (red and blue layers
separate further)
 Red layer collected (the faster moving layer)
 Blue layer collected (the slower moving layer)
 No more compounds are eluted, process ended
Kelebihan Kromatografi Kolom
 Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi
preparative.
 Digunakan untuk menentukan jumlah
komponen campuran.
 Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi

substansi
Kekurangan Kromatografi Kolom
 Untuk mempersiapkan kolom
dibutuhkan kemampuan teknik
danmanual.
 Metode ini sangat membutuhkan

waktu yang lama (time

consuming)
Aplikasi Kromatografi Kolom
 Dalam bidang bioteknologi,
kromatografi mempunyai peranan
yang sangat besar. misalnya dalam
penentuan, baik kualitatif maupun
kuantitatif,senyawa dalam protein.
 Protein sering dipilih karena ia sering

menjadi obyek molekul yang harus di

purified (dimurnikan) terutama untuk
keperluan dalam bio farmasi
 Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam
pemisahan molekul-molekul penting seperti
asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan
molekul penting lainnya.
 Dengan data-data yang didapatkan dengan
menggunakankromatografi ini, selanjutnya
sebuah produk obat-obatan dapat
ditingkatkanmutunya, dapat dipakai sebagai data
awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau
dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi
obat tersebut sehingga bisa bertahan lama
 Dalam bidang clinical (klinik), teknik
ini sangat bermanfaat terutama dalam
menginvestigasi fluida badan seperti
air liur. Dari air liur seorang pasien,
dokter dapat mengetahui jenis
penyakit yang sedang diderita pasien
tersebut.
 Seorang perokok dapat diketahui apakah dia
termasuk perokok beratatau ringan hanya
dengan mengetahui konsentrasi CN (sianida)
dari sampelair liurnya.
 Demikian halnya air kencing, darah dan fluida

badan lainnya bisamemberikan data yang

akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu
penyakitdalam tubuh manusia dapat
dideteksi secara dini dan cepat.