HPLC (HIGH

PERFORMACE LIQUID
CHROMATOGRAPHY)

Oleh : Susi Sukmawati

 PENGERTIAN HPLC
 HPLC merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada Teknik
kromatografi dimana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat.
 Seperti tenik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat
tertentu.
 HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mmdengan
ukuran partikel penunjang 50 micrometer, sedangkan laju aliran dipertinggi
dengan tekanan tinggi.
 awalnya dikenal dengan high pressure liquid chromatography (HPLC),
kemudian diganti high performance liquid chromatography (HPLC).
 KEGUNAAN HPLC
 HPLC memiliki kemampuan untuk memisahkan dan mengidentifikasi senya!a
yang hadir dalam sampel yang dapat dilarutkan dalam cairan di jejak
konsentrasi serendah bagian per triliun. Karena fleksibilitas ini" HPLC
digunakan dalam berbagai aplikasi industri dan ilmiah" seperti , farmasi,
lingkungan, forensic, dan bahan kimia.
 JENIS-JENIS HPLC
 Kromatografi Adsorbsi

Pemisahan kromatografi adsorbsi menggunakan fase diam berupa silika, gel dan alumina.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
 Kromatografi Fase Terikat

Fase diamnya = silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Modifikasi silika
adalah hidrokarbon non-polar (contoh : oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik) fase gerak = campuran metanol dg air atau dengan
larutan buffer.
 Kromatografi Penukar Ion

Fase diam = dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak (contoh : polistiren
resin). Fase gerak = air à karena sifat ionisasinya.
 Kromatografi Pasangan Ion

Digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah

yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang
mempunyai muatan yang berlawanan.
 Kromatografi Eksklusi Ukuran / Kromatografi Permiasi Gel

Digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam = silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.
 Kromatografi Afinitas

Digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
 PRINSIP DASAR KERJA HPLC
 Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan
tertentu sebagai fasa geraknya.
 Untuk skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <
golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol <
golongan asam.
 HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif.
 Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari
kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solute yang kuat berinteraksi dengan
fasa diam maka solute-solute tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh
detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
 KOMPONEN BESERTA
FUNGSI HPLC
 Pompa (pump)

Fungsi pompa pada KCKT adalah mendorong fase gerak masuk ke dalam kolom
dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa yang cocok digunakan
untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah
pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum
dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000
psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit.
Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan 20 mL/ menit.
 Kolom

Kolom dianggap sebagai jantung pada kromatografi yang mana terdapat fase
diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/ analit. Kolom HPLC
secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk
tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom ditempatkan di
ruang yang bersuhu tetap (konstan). Jenis kolom yang digunakan tergantung
komponen yang dipisahkan, sistem kromatografi, jenis kromatografi.
 Recorder

Fungsi dari recorder adalah menampilkan hasil yang diperoleh pada hasil
analisis yang ditampilkan melalui komputer dalam bentuk kromatogram.
 Detektor

Fungsi detektor adalah mendeteksi komponen yang memisah. Detektor dapat

mendeteksi komponen yang terelusi oleh fasa diam sehingga keluar dari kolom
serta mengukur jumlah molekul tersebut sehingga dapat dilakukan analisis
kuantitatif terhadap sampel yang dianalisis. Detektor meneruskan data yang
diperoleh ke recorder atau computer sehingga dihasilkan kromatogram.
 Waste

Fungsi dari waste adalah tempat pembuangan eluen yang sudah melewati
detektor.
 Sample Injector

Fungsi dari sample injector adalah tempat memasukkan cuplikan/sampel

dengan bantuan syringe. Ada 3 jenis injektor, yakni syringe injector,loop
valve ,dan automatic injector (autosampler). Syringe injector merupakan
bentuk injektor yang paling sederhana dan umum digunakan di laboratorium.
Degasser
Fungsi degasser adalah menghilangkan gas pada sampel yang akan dianalisis,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa
dan detektor yang akan mengacaukan analisis.
Solven reserve
Fungsi dari solven reserver adalah untuk menampung fasa gerak yang akan
dialirkan ke dalam kolom dengan bantuan pompa.
 CARA MENGGUNAKAN HPLC
 a. Cara Menghidupkan

• Semua komponen dihubungkan ke power supply.

• Pompa, detektor, komputer, dan printer dinyalakan karena untuk
pengeprinan hasil langsung.
• Ditunggu hingga 15 menit terlebih dahulu.
• Lampu yang berwarna merah menyala pada saat dinyalakan, ketika sudah
menyala barulah berwarna hijau.
• LC solution yang terdapat dalam komputer dibuka, karena hanya ada satu LC
maka klik LC no 1.
• Setelah itu akan muncul bagian cara pengaturannya yaitu klik metode,
kemudian instrument, parameter seperti komposisi eluen, laju aliran, detektor,
dan lamanya waktu analisis diatur.
• Klik detektor uv pada panjang gelombang 254 nm, klik end time.
 b. Cara Penginjeksian Sampel

• Syringe atau alat penunjeksian dibersihkan terlebih dahulu, kemudian

setelah bersih dicuci dengan pelarut yang akan digunakan.
• Klik single star, injeksi run lalu equation information. Terdapat dua pilihan
dalam penginjeksian yaitu automatic sample atau mengambil sendiri sampel,
atau menginject dengan sendirinya, dan yang kedua adalah injection volume
(jumlah sampel yang ingin diinjeksikan).
• Pada proses peninjeksian syringe dimasukkan pada bagian injeksi secara
tegak dan jgan sampai jarumnya bengkok.
• Tombol pada tempat injeksi diputar ke arah load, keluarkan cairan, dan
terakhir putar ke arah injek, lalu keluarkan jarum secara hati-hati.
 CARA MEMBACA
KROMATOGRAM DARI HPLC
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk
kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada
Gambar berikut ini

Dari Gambar waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni
bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila
kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau
proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil
secara kuantitatif.
 CARA MENENTUKAN
KONSENTRASI SAMPEL HPLC
1. Langkah pertama membuat larutan induk parasetamol.
2. Langkah berikutnya yaitu pembuatan larutan standar.
3. Terakhir membuat larutan sampel.
 CARA MAINTENANCE HPLC
 Stabilitas pH

kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH,
pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen
dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH.
Ikatan kimia baru yang memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk
beberapa fasa diam. Fase stasioner didasarkan pada silika gel ultra murni juga
dapat digunakan pada rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11,
tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis
Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan oleh
karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
 Teknik Stabilitas

Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam kolom
yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa
(6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam kolom,
yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram
 Eluen

Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari kotoran
pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan
mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.
 Penyimpanan Kolom

o Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang
digunakan dalam terakhir analisis.
o Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom
harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
o Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam
pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah
pelarut Asetonitril.
 REFERENSI
 https://www.academia.edu/14500677/Pengertian_hplc_hight_pressure_liquid_c
hromatografy
 https://youtu.be/eFtgZQf19_k
 Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga
University Press. Surabaya.
This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY-SA-NC