UJI POTENSI KELOMPOK 4

ANTIBIOTIK
Asmafitriani Purnama Wulansari Neldy
Dya Iqhta P Reza Nur Fahmi
Firza Savira Rensa Alsya Fitri
Nasyitoh Fatimiyah Syarafina
Ofiati Wijaya Vannisa Nabilla W
Rafika A. Yunita Sari
UJI POTENSI ANTIBIOTIK

Merupakan teknik untuk menetapkan suatu potensi antibiotika dengan mengukur efek senyawa tersebut

terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji yang peka dan sesuai.

Penurunan aktivitas antimikroba tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia  sehingga pengujian secara
mikrobiologi atau biologi merupakan standar dalam penetapan penurunan aktivitas anti mikroba.

Metode umum yang dapat digunakan, yaitu:

• penetapan dengan lempeng-silinder atau "cawan“  mikroba yang ditambahkan dihambat

pertumbuhannya pada daerah berupa Iingkaran atau "zona" di sekeliling silinder yang benisi larutan
antibiotik.
• penetapan dengan cara "tabung" atau turbidimetri  berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan
mikroorganisme dalam media cair yang mengandung larutan antibiotik.
FIRST UP
CONSULTANTS
 PENYIAPAN BAKU DAN SAMPEL (FI V)
Penyiapan Baku Penyiapan Sampel
• Membuat Larutan persediaan  larutkan sejumlah / • pada hari penetapan buat larutan
seluruh isi 1 vial (jika diperlukan) BP antibiotik yang persediaan serta encerkan larutan uji
ditimbang saksama dan telah dikeringkan, dalam
pelarut tertentu, seperti tertera pada setiap antibiotik
dengan pengencer akhir yang sama
• Di encerkan hingga kadar yang dikehendaki.
seperti untuk baku pembanding.
• Simpan dalam lemari pendingin dan gunakan dalam
waktu yang ditentukan. • Penetapan menggunakan 5 tingkat dosis
• Pada hari penetapan  buat pengenceran dari larutan
baku, memerlukan hanya I tingkat dosis
persediaan 5 atau lebih larutan untuk pengujian sampel pada kadar perkiraan sama
dengan kadar bertahap, umumnya dengan dengan tingkat dosis tengah baku.
perbandingan 1:1,25 untuk penetapan dengan
prosedur Lempeng-Silinder atau lebih kecil untuk
penetapan turbidimetri.
• Gunakan pengencer akhir (tabel 1) yang dinyatakan
dan urutan kadar dengan dosis tengah yang
ditentukan. FIRST UP
CONSULTANTS
 FIRST UP
CONSULTANTS
MIKOBA UJI

FIRST UP
CONSULTANTS
 JURNAL 1
“Kinetic microplate bioassays for relative potency of
antibiotics improved by Partial Least Square (PLS)
regression”

FIRST UP
CONSULTANTS
Pendahuluan
Keberhasilan terapi antimikroba tergantung pada  hubungan antara tingkat
konsentrasi plasmatik dan aktivitas antimikroba (atau potensi relatif) antibiotik yang
ada dalam bentuk sediaan.

Beberapa metode dilakukan untuk pengujian antimikroba di mana aktivitas

antimikroba ditentukan oleh:

• pengukuran kekeruhan (turbidity) dari penghambatan pertumbuhan mikroba

dalam medium kultur cair;
• menghitung reduksi jumlah unit pembentuk koloni (CFU) dalam media kultur agar;
• mengukur ukuran zona hambatan berdasarkan metode difusi agar.
Biasanya, metode difusi agar dan penghitungan pelat sangat melelahkan dan
membutuhkan waktu yang lama, serta memerlukan masa inkubasi yang lama (18 - 24
jam). Alternatif  Uji Turbidimetri
FIRST UP
CONSULTANTS
UJI TURBIDIMETRI

• Uji turbidimetri  alternatif yang dapat diandalkan karena mudah dilakukan,

menggunakan jumlah medium kultur dan larutan antibiotik yang lebih sedikit, dan
memberikan hasil dengan periode inkubasi yang singkat (biasanya 3-6 jam).
• Penentuan potensi relatif dari zat antimikroba (dalam sediaan) dengan uji
turbidimetri  menggunakan seperangkat tabung reaksi yang mengandung sekitar 10
mL kultur cair yang diinokulasi dari uji mikroorganisme sensitif.
• Selain itu, tabung juga mengandung beberapa pengenceran sampel dan pertumbuhan
penghambatan bertahap dibandingkan untuk memperkirakan potensi relatif.

FIRST UP
CONSULTANTS
ANTIBIOTIK YANG DIUJI:
Apramisin Vankomisin
• Antibiotik golongan aminoglikosida . • Antibiotik glikopeptida yang
• MK: menghambat sintesis protein. digunakan dalam pengobatan infeksi
• Digunakan dalam pengobatan beberapa Gram-positif.
penyakit menular (colibacillosis, • MK : menghambat sintesis
salmonellosis, enteritis bakteri dan peptidoglikan dan mengubah
septikemia Escherichia coli pada hewan). permeabilitas selektif membran
sitoplasma bakteri.

FIRST UP
CONSULTANTS
METODE YANG DIUSULKAN:

• Beberapa metode telah dilaporkan Peneliti mengusulkan kinetic-reading

untuk analisis aminoglikosida dan
glikopeptida  spektrofotometri,
KCKT, uji mikrobiologi metode difusi
agar, uji turbidimetri, dll.
• Uji mikrobiologis  masih
merupakan metode resmi untuk
sebagian besar antibiotik
aminoglikosida dan glikopeptida
dalam bentuk sediaan farmasi.
turbidimetric microplate bioassays
untuk analisis apramycin dan
vankomisin menggunakan regresi
partial least square (PLS) 
Memungkinkan untuk memperkirakan
potensi relatif dari antibiotik dalam
bentuk sediaan farmasi tanpa
pemasangan yang berlebihan dan
meningkatkan rentang linier dari
bioassay turbidimetri.

FIRST UP
CONSULTANTS
KELEBIHAN PEMILIHAN METODE:

Penggunaan lempeng-lempeng mikro (microplate)  dapat mengurangi

jumlah larutan antibiotik dan medium kultur.

Pembacaan secara kinertik / Kinetic-reading  pengukuran absorbansi yang

dapat dilakukan selama waktu inkubasi.

Metode integral  alternatif yang baik digunakan untuk memperkirakan

potensi relatif antibiotik dengan menggunakan area di bawah kurva
pertumbuhan mikroba vs log konsentrasi antibiotik.

Regresi parsial least square (PLS) sangat berguna untuk membangun

model prediksi ketika prediktor sangat kolinear dan ketika ada banyak
prediktor. FIRST UP
CONSULTANTS
 REAGEN, MEDIA, DAN MIKROORGANISME
Reference standar : Mediumuntuk penetapan
Sampel: biologis turbidimetri:
Apramycin sulfat (potensi
873 µg/mg) ApralanTM Tryptic Soy Agar (TSA)
Vankomisin hidroklorida VancocinTM Tryptic Soy Broth (TSB)
(potensi 99.300 µg/ml)

Medium antibiotik nomor Kultur bakteri E-coli (ATCC

2 (anti 2) dan nomor 8 Buffer fosfat pH 8,0 dan 8739) dan Bacillus subtilis
(anti 8) untuk penetapan 4,5 (ATCC 6633) yang dikultur
biologi difusi agar di agar miring

Media kultur dan larutan buffer harus disterilisasi

pada 1210C selama 15 menit FIRST UP
CONSULTANTS
 ALAT DAN INSTRUMEN
Microplate
reader
Microplate
Autoclave
Incubator

Inkubator
pH meter
bakteri

Analytical Antibiotic
balance zone reader FIRST UP
CONSULTANTS
 PENETAPAN BIOLOGI APRAMYCIN DG TURBIDIMETRIC
MICROPLATE

100 µl alikuot reference

100 µl TSB yang sudah
standar apramycin dengan Larutan sampel (apralanTM
terdapat inokulasi E-coli
konsentrasi 5; 10; 15; 20; dengan konsentrasi teoritis
(ATCC 8739) (5.0% v/v)
25; 30; dan 35 mg/L 20 mg/L) dimasukkan
dimasukkan kedalam
dimasukkan kedalam kedalam microplate.
microplate.
microplate.

Potensi relatif apralan dapat

ditentukan:
 Berdasarkan kurva dosis respons
Absorbansi VS Log konsentrasi
Apramycin setelah inkubasi. Absrobansi diukur pada
Microplate diinkubasi
panjang gelombang 630
 Metode integral (area dibawah nm setiap interval waktu
pada 37,0 0C ± 1,0 0C
kurva pertumbuhan mikroba). selama 180 menit.
15 menit.
 Menggunakan Partial Least Square FIRST UP
(PLS). CONSULTANTS
 PENETAPAN MIKROBIOLOGI DIFUSI AGAR UNTUK
APRAMYCIN
Setelah proses pemadatan, 4
20 ml alikuot anti 2 ml medium anti-2 yang sudah
dimasukkan kedalam cawan diinokulasi dengan B. subtillis
petri berukuran 90 mm. (ATCC 6633) dituangkan ke
lapisan dasar.
Cawan petri diinkubasi pada Ukuran zona inhibisi diukur
37.0 ± 1.0 °C selama 18-24 menggunakan antibiotic zone
jam. reader.
Kertas disk yang sebelumnya
sudah dibasahi dengan larutan
reference standar apramyin
(1,0; 2,0 dan 4,0 mg/L) atau
apralan dengan kovsevtrasi
teoritik 2,0 mg/L ditempatkan
pada lapisan seed.
Potensi relative ditentukan
dengan balanced experimental
design.
FIRST UP
CONSULTANTS
TURBIDIMETRIC MICROPLATE UNTUK VANKOMISIN

• Aliquots dari 100 μL larutan standar referensi vankomisin (konsentrasi

0,6, 0,7, 0,8, 0,9, dan 1,0 mg/L) dan Vancocin™ (konsentrasi teoritis 1,0
mg/L) dipindahkan ke lempeng mikro.
• Alikuot dari 100 μL TSB diinokulasi dengan B. subtilis (ATCC 6633) dalam
proporsi 5% dipindahkan ke lempeng mikro. Selain itu, kontrol negatif
dan positif juga dimasukkan.
• Lempeng mikro diinkubasi pada suhu 37,0 ± 1,0 ° C selama 300 menit,
dan absorbansi diukur pada 630 nm pada interval 30 menit.
• Potensi relatif dari Vancocin™ ditentukan menggunakan regresi partial
least square (PLS).

FIRST UP
CONSULTANTS
AGAR DIFFUSION BIOASSAYS UNTUK
VANKOMISIN

• Aliquot 10 mL Anti 8 dipindahkan ke cawan Petri 90 mm. Setelah

pemadatan, bagian 4 mL media Anti 8 diinokulasi dengan suspensi B.
subtillis (ATCC 6633) dituangkan ke lapisan dasar.
• Disk kertas yang sebelumnya direndam ke dalam larutan standar
referensi vankomisin (konsentrasi 6,4, 8,0, 10,0, 12,5, dan 15,6 mg/L)
atau larutan Vancocin™ (konsentrasi teoritis 10,0 mg/L) ditempatkan
pada permukaan lapisan yang diunggulkan.
• Cawan petri diinkubasi pada suhu 37,0 ± 1,0 ° C selama 18-24 jam, dan
ukuran zona hambat diukur menggunakan pembaca zona antibiotik.
• Potensi relatif ditentukan dengan menggunakan desain eksperimental
interpolasi.

FIRST UP
CONSULTANTS
REGRESI PARTIAL LEAST SQUARE (PLS)

• Regresi Partial Least Square (PLS) dilakukan dengan menggunakan Minitab™.

• Ide umum PLS adalah untuk mengurangi prediktor menjadi komponen yang lebih
kecil dari komponen yang tidak berkorelasi dan untuk melakukan regresi kuadrat
terkecil (least squares regression) pada komponen-komponen yang tidak
berkorelasi untuk menghindari pemasangan yang berlebihan (Over-fitting).
• Analisis PLS sering dilakukan dalam dua langkah:
a) Menghitung model regresi PLS untuk set data kalibrasi (atau training),
b) Memvalidasi model dengan set data validasi (atau tes) yang berbeda.

FIRST UP
CONSULTANTS
REGRESI PARTIAL LEAST SQUARE (PLS)

• Validasi silang sering digunakan untuk mengoptimalkan jumlah komponen yang

akan digunakan untuk memaksimalkan kemampuan prediksi model regresi PLS.
• Prosedur validasi silang dilakukan sebagai berikut:

Satu Model tanpa Respon untuk Nilai residu Jumlah prediksi

observasi observasi observasi validasi silang kuadrat (PRESS)
dihilangkan; dihitung; yang dihitung; langkah dan koefisien
dihilangkan 1 hingga 4 prediksi penentuan
diprediksi diulangi sampai (R-Sq (pred))
menggunaka semua dihitung. Model PLS
n model PLS; pengamatan dengan jumlah
dihilangkan dan komponen yang
sesuai; menghasilkan R-Sq
(pred) tertinggi dan
PRESS terendah
dipilih.
FIRST UP
CONSULTANTS
 HASIL DAN PEMBAHASAN

• Metode turbidimetri bergantung pada

penghambatan pertumbuhan kultur mikroba
dalam larutan yang sudah tercampur dengan
antibiotik, dan media cair yang mempercepat
pertumbuhan.
• Antibiotik menganggu/hambat pertumbuhan
mikroba dengan banyak cara:
a. Antibiotik meningkatkan fase lag
b. Antibiotik menurunkan waktu generasi
c. Antibiotik menurunkan microbial burden =
membunuh bakteri secara langsung (ke
membran sitoplasma)
FIRST UP
CONSULTANTS
KURVA PERTUMBUHAN E. COLI DENGAN
APRAMYCIN

FIRST UP
CONSULTANTS
KURVA PERTUMBUHAN B. SUBTILIS DENGAN
VANCOMYCIN

FIRST UP
CONSULTANTS
 APRAMYCIN
• Kurva dosis-respons yang diperoleh untuk bioassay titik akhir apramycin
turbidimetric (180 menit inkubasi) menunjukkan regresi yang signifikan secara
statistic (p value = 0,0000).
• Namun, kurva dosis-respons menunjukkan deviasi linearitas yang signifikan
(0,9677).
Tabel 1. Analisis regresi linier diperoleh dari bioassay microplate turbidimetrik untuk apramycin
menggunakan regresi parsial least squares (PLS), regresi area di bawah kurva (AUC), dan regresi
absorbansi vs log konsentrasi (End-Point) setelah 180 menit inkubasi pada 37,0 ± 1,0 ° C.

FIRST UP
CONSULTANTS
VANCOMYCIN

• Kurva dosis-respons (300 menit inkubasi) vancomycin menunjukkan regresi yang

signifikan (p-value = 0,000).
• Meskipun demikian, kurva dosis-respons menunjukkan deviasi linearitas yang
signifikan (0,9776), sehingga tidak dapat digunakan untuk estimasi potensi relatif.

Tabel 2. Analisis regresi linier diperoleh dari bioassay microplate turbidimetrik untuk vancomycin menggunakan
regresi parsial least squares (PLS), area di bawah kurva (AUC) regresi, dan absorbansi vs log konsentrasi (End-
Point) setelah 300 menit inkubasi pada 37,0 ± 1,0 ° C.

FIRST UP
CONSULTANTS
Metode Integral
KURVA DOSIS-RESPONS BIOASSAY TURBIDIMETRIK

Terlihat bahwa semakin lama waktu Namun untuk kemiringan vancomycin

inkubasi semakin tinggi kemiringan kurva tidak dipengaruhi secara signifikan oleh
dosis-respons apramycin. waktu inkubasi.
Namun, persamaannya semakin lama waktu inkubasi semakin
tinggi pertumbuhan mikroba (diukur sebagai absorbansi). FIRST UP
CONSULTANTS
CONT’D
• Hubungan dosis-respons ditentukan area plot di bawah kurva pertumbuhan
mikroba (AUC) vs log konsentrasi antibiotik.
• AUC dihitung menggunakan metode trapesium untuk setiap segmen kurva
pertumbuhan mikroba.
• Semakin tinggi konsentrasi antibiotik semakin kecil AUC, sehingga hubungan dosis-
respons berbanding terbalik dengan konsentrasi antibiotik.

Apramycin Vancomycin FIRST UP

CONSULTANTS
• Metode integral adalah metode yang cocok setelah mempertimbangkan seluruh
kurva pertumbuhan mikroba.
• Namun hasil dari linearitas metode integral untuk model linear dosis-respon lebih
rendah daripada yang diperoleh dengan menggunakan regresi PLS.

Kurva AUC (min.mg/L) vs. log konsentrasi Kurva AUC (min.mg/L) vs. log konsentrasi
vancomysin setelah 300 menit inkubasi apramycin (setelah 180 menit inkubasi
FIRST UP
pada 37 ± 1,0 ° C. pada 37 ± 1,0 ° C CONSULTANTS
CONT’D
• Setelah metode integral gagal memprediksi potensi relatif dari
antibiotik, metode alternatif harus ditemukan untuk mengatasi masalah
ini.
• Multiple Linear Regression (MLR) adalah alat yang berguna untuk
menjelaskan bagaimana variabel dependen (respons) terkait dengan
dua atau lebih variabel independen (prediktor atau faktor).
• Namun, MLR mungkin bukan model prediksi yang baik jika datanya
sangat collinear dan jika jumlah prediktor lebih besar dari jumlah
pengamatan.
• Atas dasar hal itu, peneliti membangun model prediktif untuk
memperkirakan potensi relatif dari antibiotik menggunakan regresi
partial least square (PLS).

FIRST UP
CONSULTANTS
• Masalah penting dalam regresi PLS adalah penentuan jumlah komponen yang akan
digunakan dalam model prediktif.
• Komponen dalam jumlah kecil mungkin tidak cukup untuk membangun model
prediksi yang baik.
• Namun komponen dalam jumlah besar dapat menyebabkan model prediksi yang
‘over-fitting’.
• Dengan demikian, peneliti melakukan validasi silang ”leave-one-out" untuk
menentukan jumlah komponen yang sesuai untuk model regresi PLS.

FIRST UP
CONSULTANTS
CONT’D
• Koefisien prediksi determinasi (R-Sq (pred)) sering digunakan untuk
menentukan seberapa baik model PLS memprediksi respons untuk
pengamatan baru.
• R-Sq (pred) dihitung dengan secara sistematis menghapus setiap
pengamatan dari set data kalibrasi, memperkirakan persamaan regresi
PLS, dan menentukan seberapa baik model memprediksi pengamatan
yang dihapus (prosedur validasi silang).
• R-Sq (pred) dapat mencegah over-fitting model dan dapat lebih
bermanfaat daripada koefisien penambatan (R-Sq).

FIRST UP
CONSULTANTS
• Model regresi PLS untuk apramiycin turbidimetric bioassay dioptimalkan
menggunakan 6 komponen, dengan koefisen dterminasi (R-Sq = 0,9996), regresi
yang signifikan (p-value = 0,000), tidak ada penyimpangan linearitas yang
signifikan.

FIRST UP
CONSULTANTS
• Data kalibrasi digunakan untuk
memperkirakan model PLS untuk
bioassay apramycin dan jumlah
komponen optimal ditentukan dengan
pendekatan crossvalidation “leave-one-
out”. Selanjutnya diguakan data validasi
untuk memprediksi model PLS.
• Menunjukkan kemampuan prediksi yang
tinggi.
• Menggunakan lebih dari 6 komponen,
dengan niali R-Sq (pred) berkurang dan
PRESS meningkat menunjukkan model
yang digunakan sesuai.

FIRST UP
CONSULTANTS
• Model regresi PLS untuk vancomycin dioptimalkan menggunakan 4 komponen,
dengan koefisen determinasi (R-Sq = 0,9951), regresi signifikan (p-value – 0,000)
dan tidak terjadi penyimpangan linearitas yang signifikan.

FIRST UP
CONSULTANTS
• Data kalibrasi digunakan untuk
memperkirakan model PLC untuk
bioassay vancomycin dan jumlah
komponen optimal menggunakan
pendekatan cross validation “leave-
one-out”. Selanjutnya digunakan data
validasi untuk memprediksi model
PLS.
• Menunjukkan kemampuan prediksi
yang tinggi.
• Menggunakan lebih dari 4
komponen, nilai R-Sq (pred)
berkurang dan PRESS meningkat
menunjukkan model yang digunakan
sesuai.
FIRST UP
CONSULTANTS
• Berbeda dengan kurva dosis-respon konvensional , model regresi PLS
dapat disesuaikan untuk memprediksi konsentrasi antiobiotik. Hal ini
menguntungkan karena memungkinkan peneliti untuk menganalisa
berbagai konsentrasi apramycin (rentang eksponensial 7x).
• Model prediksi regresi PLS dapat juga digunakan untuk respon dengan
rentang pendek dari konsentrasi vancomycin (rentang eksponensial
1,6x).
• Cara konvensional menggunakan kurva dosis-respon, rentang harus
dikurangi untuk memenhui penyesuaian regresi linear sehingga
memberikan prediksi yang baik (rentang eksponensial 3x).

FIRST UP
CONSULTANTS
• Perbandingan hasil potensi relatif untuk Apralan dan Vancocin diperoleh dari
bioassay turbidimetri menggunakan regresi PLS yang diperoleh dari metode difusi
agar.
• Two one-sided test untuk kesetaraan menunjukkan potensi relative yang diperoleh
dengan menggunakan bioassay turbidimetri setara dengan yang diperoleh dari
metode difusi agar untuk antibiotik apramycin (p =0,000) dan vancomycin
(p=0,000).
• Waktu untuk inkubasi pada metode bioassay turbidimetri lebih cepat yaitu 180
menit untuk apramycin dan 300 menit untuk vancomycin dibandingkan dengan
metode difusi agar (18-24 jam).
• Penentuaan potensi relative dari antibiotik menggunakan bioassay turbidimetri
meningkat dengan model regresi PLS.

FIRST UP
CONSULTANTS
KESIMPULAN
• Dalam jurnal ini peneliti mengusulkan untuk menggunakan regresi parsial kuadrat
terkecil (PLS) untuk membangun model prediksi untuk estimasi potensi relatif
antibiotik.
• Bioassay microplate turbidimetrik membaca kinetik untuk aminoglikosida dan
glikopeptida digunakan sebagai bukti konsep.
• Regresi PLS memungkinkan peneliti membangun model prediksi tanpa overfitting
dengan beberapa komponen.
• Regresi PLS meningkatkan rentang linear bioassay turbidimetri dan memberikan
prediksi potensi relatif yang setara dengan yang diperoleh dari metode standar
difusi agar.
• Oleh karena itu, peneliti menyimpulkan bahwa regresi PLS dapat digunakan untuk
memperkirakan potensi relatif dari antibiotik dengan keuntungan yang signifikan
bila dibandingkan dengan penentuan kurva dosis-respons konvensional.
FIRST UP
CONSULTANTS
 Jurnal 2
Using image analysis to determine
gentamicin potency by agar diffusion
microbiological assay and its
measurement uncertainty
Uji difusi mikrobiologis agar merupakan salah satu metode yang paling umum digunakan untuk
menganalisis antibiotik dalam farmasi industri dan laboratorium klinis.

Metode ini didasarkan pada dua fenomena yang biasanya terjadi secara bersamaan:
• Difusi antibiotik
• Pertumbuhan mikroba

Setelah masa inkubasi, zona penghambatan dapat diamati karena efek dari difusi antibiotik dalam
pertumbuhan mikroba.

Ukuran zona hambat dipengaruhi oleh beberapa faktor yang mempengaruhi difusi antibiotik dan/atau
pertumbuhan mikroba.
• Misal: Komposisi dan volume media kultur digunakan; dan kondisi inkubasi

Pendahuluan
Cont’d
Ketidakpastian
dari
Ketidakpastian
pengambilan
dari massa
sampel
dan
volumetrik
aparatur

Ketidakpastian
dari
pengukuran

Data bias
 Cont’d

• Penggunaan kaliper dan instrumen manual sulit,

memakan waktu dan memberikan variabilitas
yang tinggi.
• Pengukuran diameter zona hambat dengan
kaliper dapat menyebabkan peningkatan
ketidakpastian pengukuran, tergantung pada
bentuk (bentuk oval atau bentuk lingkaran) dari
zona hambatan.
Cont’d
• Penggunaan garam tetrazolium, seperti 2,3,5-
triphenyltetrazolium klorida (TTC), telah dilaporkan
dalam literatur yang bertujuan mendeteksi pertumbuhan
mikroba.
• TTC adalah bubuk putih yang larut dalam air, yang dapat
direduksi oleh enzim dehydrogenase dari metabolisme
sel membentuk endapan warna kemerahan yaitu 1,3,5-
triphenyltetrazolium formazan (TPF).
• Dengan demikian, TTC dapat digunakan sebagai pewarna
viabilitas, yang memberikan warna kontras pada
pertumbuhan mikroba yang memungkinkan zona
hambat yang lebih mudah dengan analisis gambar.
 Penentuan potensi gentamisin dengan uji
difusi mikrobiologi agar dan masing-
masing variabilitas pengukuran
menggunakan perangkat lunak
penganalisa gambar
Cont’d
Dampak pengukuran zona hambat
menggunakan analisis gambar pada
penentuan potensi dan pengukuran
masing-masing variabilitas juga dievaluasi
ALAT DAN BAHAN
Alat
• Labu ukur dan pipet
• Timbangan analitik (Shimadzu, AUY220)
• pH meter (Gehaka, PG 1800)
• Waterbath digital (SPLabor, SP-12/100ED)
• Inkubator mikrobiologi (Nova Ética)
• Inhibition zone reader terkalibrasi (Haloes
caliper, IUL)
• Smartphone (Samsung, J7 Prime) dan ImageJ
software image analyzer
Bahan
• Kultur medium MHA (BD-Difco)*
• Gentamisin sulfat (Sigma- Aldrich, PHR1077)
• Dapar fosfat 0,1 M (pH 8,0)*
• TTC (Vetec Química do Brasil)
*disterilisasi dengan autoklaf (Stermax) pada
suhu 121o C selama 15 menit
FIRST UP
CONSULTANTS
PENGUKURAN DIFUSI AGAR MIKROBIOLOGI

X1 X2
• Logaritma konsentrasi • Logaritma pada basis 2
larutan gentamisin, dari proporsi suspensi
pada tiga tingkatan: Staphylococcus aureus
• 20 (-1), 40 (0), dan 80 (ATCC 6538), pada tiga
(1) mcg/mL tingkatan:
• Yang digunakan: 20 – • 0,1% (-1), 0,3% (0), dan
80 mcg/ml (standar) 1,0% (1)
dan 40 mcg/ml (uji) (mulai dari 105 hingga
106 CFU/mL)
• Yang digunakan: 0,3%
X3 X4
• Volume MHA pada • Waktu pre-difusi, pada
lapisan terinokulasi, tiga tingkatan:
pada tiga tingkatan: • 0 (-1), 90 (0), dan 180
• 4,0 (-1), 4,5 (0), dan 5 (1) menit
(1) mL • Yang digunakan: 0
• Yang digunakan: 5 ml menit (tanpa waktu
predifusi)

FIRST UP
CONSULTANTS
Larutan uji dan standar
Cawan petri disiapkan:
gentamisin sulfat diencerkan
20 ml MHA (lapisan dasar) + 5 Cakram kertas direndam
dengan dapar fosfat
ml MHA (yang diinokulasikan dalam larutan uji dan standar
(konsentrasi akhir: 20 (d (S1)),
dengan 0,3% suspensi  letakkan di cawan petri.
40 (d (S2) dan d(T)), dan 80 (d
Staphylococcus aureus).
(S3)) mcg/mL).

Inkubasi pada (37 + 1)oC Tambahkan larutan TTC 0,3% Validasi (linearitas, presisi,
selama 18 – 24 jam. pada tiap cawan petri. akurasi, dan ketahanan).

FIRST UP
CONSULTANTS
 ANALISIS GAMBAR

Standar : I(S1), I(S2), dan I(S3) Zona hambat diukur

Cawan petri difoto Sampel : I(T) menggunakan
menggunakan
software penganalisa
kamera smartphone
gambar ImageJ

Taguchi Design → mengurangi variabilitas ukuran zona hambat (memaksimalkan rasio signal-to-noise)
Parameter yang diteliti: Parameter yang diteliti:
• Jarak smartphone dari cawan petri (X5), pada dua • Peningkatan kontras gambar (X7), pada dua level:
level: 15 cm (-1) dan 20 cm tanpa peningkatan kontras (-1) dan dengan
• Penggunaan larutan TTC (X6), pada dua level: peningkatan kontras
sebelum penambahan larutan TTC (-1) dan setelah • Tepi yang jelas (X8), pada dua level: gambar tanpa tepi
penambahan larutan TTC yang jelas (-1) dan gambar dengan tepi yang jelas (1)
FIRST UP
CONSULTANTS
Untuk tujuan perbandingan, ukuran zona hambatan standar (I (S1), I (S2), dan I (S3))
dan sampel uji (I (T)) diukur menggunakan reader zona hambat yang telah dikalibrasi
(Haloes caliper, IUL).

Haloes caliper, IUL

FIRST UP
CONSULTANTS
 POTENSI DAN KETIDAKPASTIAN PENGUKURAN

• Pengujian mikrobiologis dengan metode difusi agar: mengadopsi desain

eksperimental 3 x 1, menggunakan tiga dosis standar (d(S1), d(S2), dan d(S3)) dan
salah satu sampel uji (d(T)).
• Potensi (P%) dihitung sebagai fungsi dari ukuran zona hambatan standar (I(S1),
I(S2), dan I(S3)) dan sampel uji (I(T)).
Persamaan 1

Persamaan 2
• Ketidakpastian standar (ꭒI (ꭓi)) , koefisien korelasi (rij) dan turunan parsial (∂M/∂I(xi))
digunakan untuk memperkirakan ketidakpastian standar gabungan yang terkait
dengan potensi (M), seperti yang dijlaskan dalam persamaan 3.
FIRST UP
CONSULTANTS
CONT’D

Persamaan 3

• Turunan parsial dari fungsi pengukuran (M, Persamaan (2)) mempertimbangkan

semua jumlah input disajikan dalam Persamaan (4) - (7).

FIRST UP
CONSULTANTS
CONT’D
• Karena ukuran zona hambat proposional dengan logaritma konsentrasi
gentamisin, M harus dikonversi kembali ke skala asli (Persamaan (1)).
• Nilai P% dan ketidakpastian masing-masing diperkirakan dengan
menggunakan logaritma M dan Um.

• Selain itu, P% dilaporkan dengan faktor ketidakpastian multiplikasi (UF)

yang memungkinkan kemudahan penyajian interval kepercayaan 95%
(IC95%) dengan distribusi log-normal.

FIRST UP
CONSULTANTS
 HASIL DAN PEMBAHASAN

• Desain two-level full factorial with central point mengindikasikan zona

hambat (I(Xi)) dipengaruhi oleh konsentrasi larutan gentamisin (X1),
jumlah suspensi Staphylococcus aureus (ATCC 6538) (X2), volume
kultur medium MHA (X3), dan waktu pre-difusi (X4).
• R2 = 99,06%, R2 – adjusted = 98,95%, dan R2 prediction = 98,80% FIRST UP
CONSULTANTS
 Response surface plot dari ukuran zona penghambatan (I(XI))
sebagai fungsi terhadap faktor input (X1, X2, X3, dan X4)  Kondisi analitik yang optimal
untuk pengujian mikrobiologis
difusi agar dicapai menggunakan
konsentrasi gentamisin (X1) dari
20 – 80 µg/mL, 0,3% suspensi
Staphylococcus aureus (ATCC
6538) (X2 = 0), 5 mL media kultur
inokulasi MHA (X3 = 1), tanpa
waktu pre-difusi (X4 = -1).

 Pengujian mikrobiologis difusi agar

hasilnya linear (R2 = 99,94%, dari
20 - 80 µg/mL), presisi (presisi
intermediet RSD = 3,5%), akurat
Ukuran zona hambat → sebuah fungsi yang menunjukan difusi (mean recovery sebesar 97,4%),
antibiotik dan pertumbuhan mikroba. Oleh karena itu, ukuran zona dan robust (dalam kondisi studi
hambat dapat mengalami peningkatan atau penurunan oleh faktor analitik).
yang mempengaruhi difusi antibiotik atau/dan pertumbuhan mikroba.
FIRST UP
CONSULTANTS
Gambar dari cawan petri yang digunakan pada desain taguchi untuk mempelajari faktor
ekstrinsik; X5  jarak smartphone dari cawan petri dan X6  penggunaan larutan TTC

15 cm dari smartphone

20 cm dari smartphone

ANOVA dari desain Taguchi yang digunakan

untuk mempelajari faktor ekstrinsik

FIRST UP
CONSULTANTS
Nilai signal-to-noise ratio yang diperoleh dari desain Taguchi untuk
pengujian faktor ekstrinsik

X5 = -1  jarak smartphone 15 cm dari cawan petri

X6 = 1  setelah penambahan TTC FIRST UP 55
CONSULTANTS
 Dengan penambahan TTC dan
jarak smartphone 15 cm dari
cawan petri
TTC = 2,3,5-trifenil tetrazolium
klorida

Gambar cawan petri yang digunakan pada

desain Taguchi untuk mempelajari faktor
intrinsik
Faktor intrinsik:
• Kontras gambar (X7)
• Tepi pada zona penghambatan (X8)

FIRST UP
CONSULTANTS
ANOVA dari desain Taguchi yang digunakan
untuk mempelajari faktor intrinsik

Nilai signal-to-noise ratio yang diperoleh

dari desain Taguchi untuk mempelajari
faktor intrinsik

X7 = 1  dengan peningkatan kontras

X8 = 1  dengan tepi yang jelas

FIRST UP 57
CONSULTANTS
Berdasarkan nilai rasio signal-to-noise yang
paling maksimum untuk faktor intrinsik

Kondisi optimal:
Dengan peningkatan kontras
(X7=1) dan dengan tepi yang
jelas (X8=1)

FIRST UP 58
CONSULTANTS
Ketidakpastian pengukuran menggunakan image analyzer dan jangka sorong

Ketidakpastian pengukuran
menggunakan penganalisis gambar
jauh lebih kecil dibandingkan
pengukuran menggunakan jangka
sorong

Risiko pengambilan keputusan yang

salah lebih kecil pada pengukuran
menggunakan penganalisis gambar
(imageJ)
FIRST UP
CONSULTANTS
 KESIMPULAN
Pengujian mikrobiologis difusi agar dikembangkan dan dioptimalkan menggunakan
desain two-level full factorial dengan titik pusat (central point).

Prosedur analitik yang dioptimalkan adalah linearitas, akurat, presisi, dan kekuatan
(robust).

Kondisi untuk pengukuran ukuran zona hambat menggunakan analisis gambar

dioptimalkan menggunakan desain Taguchi, mempertimbangkan faktor ekstrinsik
dan intrinsik.
Nilai potensi yang diperoleh dari pengukuran zona hambat yang diukur
menggunakan analisis gambar dan jangka sorong menunjukan similaritas. Namun,
ketidakpastian pengukuran berkurang secara signifikan dalam pengukuran zona
hambat yang diukur menggunakan analisis gambar.
FIRST UP
CONSULTANTS
 FIRST UP
CONSULTANTS

THANK YOU 

61