Kimia Analisis Kuantitatif

Lisa andina, M.sc., Apt.

Putri Indah Sayati, M.Pharm.Sci., Apt
Definisi
• Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran
didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-
komponen campuran diantara dua fase, yaitu fase diam
(padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas)
• Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal

istilah kromatografi adsorpsi

• Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut

kromatografi partisi
Pengelompokan kromatografi
Jenis fase diam Jenis fase gerak Alat untuk fase diam

Gas Kolom Kromatografi gas-padat

Kromatografi adsorpsi
Kompetisi antara fase
diam padat dan fase
gerak Kolom Krom. Kolom cair; KCKT

Cair

Lapisan datar KLT; krom. kertas

Krom. Gas-cair; Krom

Gas Kolom
cair super kritik
Kromatografi partisi
kromatografi Kompetisi antara fase
diam cair dengan fase
gerak
Cair Kolom Krom.cair-cair; KCKT

Kromatografi penukar
ion
Kompetisi antara Cair Kolom Krom.penukar ion
penukar ion dengan fase
gerak cair

Kromatografi permeasi
Kompetisi antara matriks Kromatografi permeasi
Cair Kolom
polimer dan fase gerak gel
cair
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

• Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara

melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)

• Kegunaan HPLC adalah:

• Menetapkan kadar senyawa tertentu seperti asam amino, asam

nukleat dan protein dalam cairan fisiologis;

• Menentukan kadar senyawa aktif obat;

• Memurnikan senyawa dalam suatu campuran

• Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase

gerak (mobile phase)

• Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar

kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi

kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak

• Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan

detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram

Instrumentasi HPLC
• Pada dasarnya terdiri
atas:
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran
fase gerak
3. Alat untuk
memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung
buangan fase gerak
7. Komputer
 7

How can We Analyze the Sample?

Carbohydrates
1. fructose
2. Glucose
3. Saccharose
4. Palatinose
5. Trehalulose
6. isomaltose
5

Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm)

2
70/30 Acetonitrile/Water 3
mAU
1 mL/min Detect=Refractive Index 1
4
6

time
Kromatogram
kromatogram
Kualitatif vs Kuantitatif
Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR)
dan luas area/tinggi puncak
Untuk:
- analisis kualitatif digunakan informasi tR,
- analisis kuantitatif digunakan informasi luas
area/tinggi puncak kromatogram
Jenis-jenis HPLC
A. Kromatografi adsorpsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui

sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini
memakai silika sebagai fase diamnya.
Jenis-jenis HPLC
B. Kromatografi partisi

Umumnya disebut juga kromatografi fase terikat. Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah
silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat.

Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar
seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.

Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer.

Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH
fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.

Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih
lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
Jenis-jenis HPLC
C. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu
fase gerak.

Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin.

Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya.

Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik.

Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.

Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh
penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion
pada resin.
Jenis-jenis HPLC
D. Kromatografi eksklusi ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton.Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar,
akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan
terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM
yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.
Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi
interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
To be continued

GAS CHROMATOGRAPHY