ELISA

Jurusan TLM
POLTEKKES Kemenkes Jayapura

Oleh
Indra Taufik Sahli, S.Si., M.Biomed
Immunoassay adalah tes yang menggunakan
kompleks antigen dan antibodi sebagai alat
untuk menghasilkan hasil yang terukur
 1. Immunoassay tak berlabel
 2. immunoassay berlabel
1. Uji Aglutinasi
2. Uji Presipitasi
3. Uji Fiksasi Komplemen
4. Uji Netralisasi toksin
1. Immunofluorescens assay (IFA) : (Cat
Fluoresens)
2. Radioimmunoassay (RIA) : Radioisotop
3. ELISA : Enzim
4. Luminescent Assay (LIA) : Luminescent
 Adalah teknik biokimia yang digunakan terutama
dalam imunologi untuk mendeteksi keberadaan
suatu antigen atau antibodi dalam sampel
 Untuk menentukan kadar Ag atau Ab.
 Indikator berupa enzim dilengketkan
pada Ag atau Ab
 Enzim: horseradish peroxidase (HRP), alkaline
phosphatase (AP), urease beta galaktosidase dan
flukosa oksidase
 Metode ELISA pertama kali dikenalkan oleh
Engvall dan Perlmann tahun 1971
 Antigen: molekul yang menginduksi produksi
antibodi ketika dikenali oleh tubuh
 Apapun yang asing bagi sistem imun, misal:
bakteri, virus, parasit, protein dll
 Antibodi: protein yg diproduksi oleh sistem
imun untuk melawan antigen
 IgA- Secreted by saliva, colostrum,
respiratory and GI tract. Prevents
microbes from attaching to mucous
membranes.
 IgD- Function unknown. Antigen
receptor. Small amounts in serum
 IgM- First to reach site of infection in
primary response
 IgE- Least abundant, mediates allergic
reactions
 IgG- Most abundant. Most active in a
secondary immune response. Can
cross the placenta. Enhances
phagocytosis.
 Diperlukan adanya marker untuk mengetahui
ikatan antigen-antibodi
 Marker tidak boleh mengganggu ikatan
 Reagen, waktu simpan lama
 Spesifitas dan sensitivitas ELISA tinggi
 Mudah dilihat hasilnya dan prosedur cepat
 ELISA dapat digunakan untuk berbagai infeksi
 Pengukuran aktivitas enzim jauh lebih
kompleks dibandingkan pengukuran
aktivitas dengan menggunakan
radioisotop
 Aktivitas enzim dapat terpengaruh oleh
konstituen plasma
 Kit tersedia secara komersial, tapi
tidak murah
 Sangat spesifik untuk antigen tertentu,
Tidak akan mengenali antigen lain
 Bisa terjadi positif/negatif palsu,
terutama dengan antigen yang
termutasi.
1. Antigen/antibodi yang diinginkan diabsorbsi
ke permukaan plastik (‘sorbent’)
2. Antigen dikenali oleh antibodi spesifik
(‘immuno’)
3. Antibodi ini dikenali oleh antibodi kedua
(‘immuno’) yang ditempeli oleh enzim
(‘enzyme-linked’)
4. Substrat bereaksi dengan enzim untuk
memproduksi produk, berupa warna
1. Antigen/sampel ditambahkan ke
plate
2. Blocking buffer ditambahkan
untuk menghalangi tempat
pengikatan protein
3. Tambahkan antibodi primer yang
sesuai
4. Tambahkan konjugat antibodi
sekunder-enzim yang sesuai yang
mengenali dan berikatan dengan
antibodi primer
5. Tambahkan substrat TMB yang
akan dikonversi oleh enzim
menjadi bentuk yang terdeteksi
 Untuk deteksi langsung, antigen yang dilapisi
pelat multi-sumur dideteksi oleh antibodi
yang secara langsung terkonjugasi menjadi
enzim.
 Metode deteksi ini adalah opsi yang baik jika
tidak tersedia secara komersial Kit ELISA
untuk protein target Anda
 Cepat karena hanya satu antibodi dan lebih
sedikit langkah yang digunakan.
 Reaksi silang dari antibodi sekunder
dihilangkan.
 Imunoreaktivitas antibodi primer dapat
dipengaruhi oleh pelabelan dengan enzim
atau label.
 Pelabelan antibodi primer untuk setiap
sistem ELISA spesifik memakan waktu dan
mahal.
 Tidak ada fleksibilitas dalam pemilihan label
antibodi primer dari satu percobaan ke
eksperimen lainnya.
 Amplifikasi sinyal hanya sedikit.
 Berbagai macam antibodi sekunder berlabel
tersedia secara komersial.
 Serbaguna karena banyak antibodi primer dapat
dibuat dalam satu spesies dan diberi label
sekunder yang sama antibodi dapat digunakan
untuk deteksi.
 Imunoreaktivitas maksimum dari antibodi primer
dipertahankan karena tidak diberi label.
 Sensitivitas meningkat karena setiap antibodi
primer mengandung beberapa epitop yang dapat
diikat oleh antibodi sekunder berlabel,
memungkinkan untuk penguatan sinyal.
 Reaktivitas silang dapat terjadi dengan
antibodi sekunder, menghasilkan sinyal tidak
spesifik.
 Langkah inkubasi tambahan diperlukan dalam
prosedur ini.
 Sandwich ELISA

(1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and
any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting
antibody is added, and binds to antigen; (4) enzyme-linked
secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5)
substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
 Sensitivitas tinggi - 2-5 kali lebih sensitif dari
ELISA direct atau indirect
 Spesifisitas tinggi - dua antibodi terlibat
dalam penangkapan dan deteksi
 Fleksibilitas - deteksi baik langsung maupun
tidak langsung dapat digunakan
 Cocok untuk sampel kompleks (atau kasar /
tidak murni): antigen tidak memerlukan
pemurnian sebelum pengukuran
 Optimalisasi antibodi sulit - reaktivitas silang
dapat terjadi antara penangkapan dan
deteksi antibodi
 Membutuhkan kit ELISA standar atau
pasangan antibodi teruji
 Hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi
antigen yang bersifat multivalent serta
sulitnya mencari dua jenis antibody yang
dapat berinteraksi antigen yang sama pada
sisi antigenik yang berbeda (epitopnya harus
berbeda).
 Umumnya untuk menentukan Ag.
 Ab spesifik [dilekatkan pada partikel
/sumur ] dicampur bersama sama Ag*
Tambahkan serum [Ag] yang akan
bersaing dengan Ag*untuk mengikat
Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag
 Tidak diperlukan pemrosesan sampel dan
sampel kasar atau tidak murni dapat
digunakan
 Lebih kuat - kurang sensitif terhadap
pengenceran sampel dan efek matriks sampel
dibandingkan ELISA sandwich
 Cocok untuk antigen kecil
 Elisa untuk deteksi virus
 Elisa untuk infeksi Bakteri
 Elisa untuk infeksi Parasit
 Elisa untuk diagnosis hormon
 Bakteri utuh
 Antigen dinding sel bakteri
 ]antigen membran bakteri
 Antigen lipolisakarida
 Glikolipid
 Flagela
 Fimbria
 Protein ektraseluler (toksin)
 Antigen non polisakarida
 Antigen polisakarida
 Sentrifugasi
 Pembekuan
 Penyerapan pada kertas saring
 Swabb
 Hasil titer antibodi tinggi tidak
mencerminkan hewan terinfeksi misalnya
Brucella ovis mnunjukan antibodi tetapi tidak
pernah ditemukannya kuman.
 Dapat bereaksi silang dengan antibodi akibat
respon imun oleh penyakit lain
1. Inkubasi dengan sampel uji
 100 μL sampel uji atau standar dalam buffer
ditambahkan ke tiap well.
 Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 2
jam.
2. Cuci
3. Lapisi well dengan antibodi
 100 μL antibodi yang terlarut dalam buffer
ditambahkan ke tiap well.
 Tutup plate dan inkubasi pada 4 °C semalaman.

4. Cuci
5. Inkubasi dengan enzim-antibodi terkonjugasi
 100 μL enzim-antibodi terkonjugasi dalam buffer ditambahkan ke tiap well.
utup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 1 jam.
Enzim-antibodi terkonjugasi seharusnya melawan antigen agar dapat
ditunjukkan.
Antibodi terkonjugasi harusnya spesifik untuk antigen yang diinginkan

6. Cuci
7. Pembentukan warna
 100 μL substrat kromogenik ditambahkan pada tiap well.
Tutup plate dan inkubasi 15 menit, hingga terbentuk warna yang sesuai.
Plate sebaiknya dihindarkan dari cahaya selama inkubasi.

8. Penghentian pembentukan warna

 Pengentian reaksi dengan menambahkan 100 μL 0.5M H2SO4 pada tiap well.
9. Membaca hasil
 Baca hasil secara langsung melalui bagian bawah plate menggunakan fotometer
(ELISA reader) otomatis atau semi-otomatis.
Panjang gelombang yang direkomendasikan antara 620-650 nm.
 Dari tabel hasil
pengukuran
standar dapat
dibuat grafik
dimana sumbu x
adalah
konsentrasi
(pg/mL) dan y
adalah nilai
absorbansi.
 Dari grafik standar
dapat diketahui
persamaan regresi
linier dari standar
yaitu y= ax + b
(y=0,001x + 0,050).
 Persamaan tersebut
akan digunakan untuk
menghitung
konsentrasi sampel.
 Contohnya pada
sampel 1 diketahui
bahwa absorbansi
sebesar 2,199, maka
cara menghitung nilai
x (kadar TNF-α) adalah
(2,199 – 0,050) / 0,001
dan didapatkan hasil
2149pg/mL